孟 科，榮 軒，梁 鵬，強 浩，馮登偵

（寧夏大學農學院，寧夏銀川 750021）

我國養(yǎng)殖的大多數綿羊都為單羔品種，生產時出現雙羔以及多羔的情況比較少，篩選綿羊的多胎基因可以顯著提高其繁殖力，有利于提高養(yǎng)殖戶的經濟效益。綿羊多羔性狀是綿羊育種和生產中的一個重要繁殖性狀，受到遺傳、飼養(yǎng)環(huán)境、激素、營養(yǎng)等多因素的綜合影響。隨著現代分子生物學技術的發(fā)展，綿羊多羔性狀的候選基因已被眾多學者進行了深入研究，大多集中在轉化生長因子（Transforming Growth Factor-，-）超家族和骨形態(tài)發(fā)生蛋白（Bone Morphogenetic Protein，）通路或與之相關的信號通路。

骨形態(tài)發(fā)生蛋白（）屬于-超家族的一員，該蛋白大約有20 多個家族成員，其成員在結構上相似，但其功能在不同時期和不同階段有著很大的區(qū)別。與哺乳動物的多種功能密切相關，該蛋白不僅可誘導軟骨和骨的形成，而且對于調節(jié)動物繁殖、細胞分化和細胞凋亡具有非常重要的作用。、和基因是骨形態(tài)發(fā)生蛋白家族的重要成員。據研究表明，在體外培養(yǎng)的牛卵泡中，10 ng/mL的可促進原始卵泡的發(fā)育并維持次級卵泡的超微結構，100 ng/mL 的可促進原始卵泡、次級卵泡和卵母細胞的直徑增加。Kumar 等研究發(fā)現，在水牛妊娠的不同階段，基因mRNA 和的表達量在妊娠早期均顯著上升，基因mRNA 表達量在妊娠晚期也明顯上升。Tanwar 等研究發(fā)現，基因及其下游靶蛋白（pSMAD1/5/8）在小鼠卵泡發(fā)育的各個階段均有表達。還有研究結果表明，小鼠敲除基因后，將導致子宮缺陷甚至生育能力降低。這些研究均說明、和基因在動物繁殖方面起著關鍵作用。

本實驗以杜泊羊、灘寒雜交羊、雜一代、雜二代和橫交一代5 個綿羊群體為研究對象，基于Ensemble 數據庫中查到的、和基因的錯義突變位點（g.48462350C＞T、g.63454744T＞G、g.58171856C＞G），利用Sequenom MassARRAYSNP 技術對3 個突變位點進行基因型檢測，探究不同綿羊群體、和基因SNP 位點的多態(tài)性，并與產羔數進行關聯分析，篩選影響5 個綿羊群體多羔性狀的關鍵位點，為上述綿羊群體產羔數的選育提供分子標記。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 本研究的實驗個體均來自寧夏宇泊科技有限公司石嘴山威震肉羊繁育場，各羊群信息如表1 所示。實驗羊均為健康無病、飼養(yǎng)管理一致的成年母羊。將采集的耳組織放入75%酒精，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 實驗羊群信息

1.2 基因組DNA 提取 綿羊耳組織樣本使用組織DNA磁珠法提取試劑盒對DNA 進行提取，-20℃保存，用于后續(xù)的飛行質譜基因型檢測。

1.3 飛行質譜檢測 采用Sequenom MassARRAYSNP 技術對768 只綿羊的、和基因3 個位點（rs號分別為rs160577278、rs416697440 和rs422626052）在5 個綿羊群體進行基因型檢測，待檢樣品為DNA。該步驟交由北京康普森農業(yè)科技有限公司完成，具體實驗步驟如下。①引物設計：根據Ensemble 數據庫中公布的綿羊、和基因SNP 位點信息，使用Sequenom 公司的引物設計軟件Assay Design 3.1設計待測SNP 位點的PCR 反應和單堿基延伸引物（表2）；②DNA 質檢；③PCR 擴增：該步驟在384 孔板中進行，PCR 反應體系：0.5 μL 的10×PCR Buffer，0.4 μL 的MgCl（（25 mmol/L），0.1 μL 的dNTP Mix（25 mmol/L），1 μL 的Primer Mix（0.5 μmol/L），0.2 μL 的HotStar Taq（5 U/μL），1.8 μL 的去離子水，1 μL 的10 ng/μL DNA，總 反應體系為5 μL/ 孔。PCR反應程序：94 ℃預變性120 s，94 ℃變性20 s、56 ℃復性30 s、72 ℃延伸60 s（45 個循環(huán)），72 ℃延伸180 s，4 ℃保存；④蝦堿性磷酸酶（Shrimp Alkaline Phosphatase，SAP）消化；⑤單堿基延伸；⑥樹脂純化；⑦芯片點樣；⑧質譜檢測。

表2 SNPs 位點引物信息表

1.3.8 數據處理 采用Microsoft Excel 2019 軟件統(tǒng)計綿羊、和基因3 個位點的基因型頻率、等位基因頻率、多態(tài)信息含量（PIC）、觀察雜合度（Ho）、期望雜合度（He）和有效等位基因數（Ne），進行哈代 -溫伯格平衡檢驗。用SPSS 22.0 軟件程序中一般線性模型對5 個綿羊群體各基因型與產羔數表型數據的關聯分析，數據以“平均值±標準差”表示。

2 結果與分析

2.1 DNA 提取質檢結果 利用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測5 個綿羊群體耳組織DNA 的純度、濃度和完整性。DNA 提取質檢結果顯示，單個樣品濃度都在50 ng/μL以上，OD/OD為1.7～2.1，無大分子污染；電泳條帶均單一、清晰（圖1）。

圖1 DNA 電泳圖

2.2、和基因分型結果 由圖2 可知，基因的g.48462350C＞T 位點存在CC、CT、TT 3 種基因型。結果表明，該位點的CT 基因型個體數最多，TT 基因型個體數較少?；虻膅.63454744T＞G位點存在GG、GT、TT 3 種基因型。結果表明，該位點的TT 基因型個體數最多，GG 基因型個體數較少?；虻膅.58171856C＞G 位點存在CC、GC、GG 3 種基因型。結果表明，該位點的CC 基因型個體數最多，GG 基因型個體數較少。

圖2 BMP2、BMP4 和BMP7 基因3 個位點的分型結果

2.3基因多態(tài)性分析及其與綿羊群體產羔數的關聯分析

2.3.1基因SNP 位點的群體遺傳學分析基因的g.48462350C＞T 位點在5 個綿羊群體中均存在CC、TC、TT 3 種基因型；經卡方適合性檢驗分析，該位點在D 群體不處于哈代-溫伯格平衡狀態(tài)（＜0.05），在其他群體均處于哈代-溫伯格平衡狀態(tài)（＞0.05）（表3）。該位點在5 個群體中均處于中度多態(tài)（0.25＜PIC＜0.5）（表4）。

表3 BMP2 基因頻率和基因型頻率

表4 BMP2 基因SNP 位點群體遺傳學分析

2.3.2基因與綿羊群體產羔數的關聯性分析 對結果樣品進行校正，對群體數量低于5% 的基因型淘汰后再對其他基因型進行分析，然后對基因g.48462350C＞T 位點的不同基因型與5 個群體的產羔數進行關聯分析。結果表明：該位點不同基因型與5 個綿羊群體的產羔數均無顯著差異，不適用于上述綿羊群體多羔性狀的選育（表5）。

表5 BMP2 基因在5 個綿羊群體中基因型與產羔數的關聯分析

2.4基因多態(tài)性分析及其與綿羊群體產羔數的關聯分析

2.4.1基因SNP 位點的群體遺傳學分析基因的g.63454744T＞G 位點在D、H群體中存在GT、TT 2 種基因型，在其他群體均存在GG、GT、TT 3 種基因型，該位點在5 個綿羊群體的優(yōu)勢基因型為TT，優(yōu)勢等位基因為T；經卡方適合性檢驗分析，該位點在5 個群體均處于哈代-溫伯格平衡狀態(tài)（＞0.05）（表6）。該位點在5 個群體中均表現為低度多態(tài)（PIC＜0.25）（表7）。

表6 BMP4 基因頻率和基因型頻率

表7 BMP4 基因SNP 位點的群體遺傳學分析

2.4.2基因與綿羊群體產羔數的關聯性分析 對結果樣品進行校正，對群體數量低于5% 的基因型淘汰后再對其他基因型進行分析，然后對基因g.63454744T＞G 位點的不同基因型與5 個群體的產羔數進行關聯分析。結果表明：該位點不同基因型與5 個綿羊群體的產羔數均無顯著差異（＞0.05），不適用于上述綿羊群體多羔性狀的選育（表8）。

表8 BMP4 基因在5 個綿羊群體中基因型與產羔數的關聯分析

2.5基因多態(tài)性分析及其與綿羊群體產羔數的關聯分析

2.5.1基因SNP 位點的群體遺傳學分析基因的g.58171856C＞G 位點在D、TH 群體中存在CC、GC 2 種基因型，在其他群體均存在GG、GC、CC 3 種基因型，該位點在5 個綿羊群體的優(yōu)勢基因型為CC，優(yōu)勢等位基因為C；經卡方適合性檢驗分析，該位點在5 個群體均處于哈代-溫伯格平衡狀態(tài)（＞0.05）（表9）。該位點在5 個群體中均表現為低度多態(tài)（PIC＜0.25）（表10）。

表9 BMP7 基因頻率和基因型頻率

表10 BMP7 基因SNP 位點的群體遺傳學分析

2.5.2基因與5 個綿羊群體產羔數關聯性分析對結果樣品進行校正，對群體數量低于5% 的基因型淘汰后再對其他基因型進行分析，然后對基因g.58171856C＞G 位點的不同基因型與5 個群體的產羔數進行關聯分析。結果表明：該位點不同基因型均與5個綿羊群體的產羔數無顯著差異，不適用于上述綿羊群體多羔性狀的選育（表11）。

表11 BMP7 基因5 個綿羊群體中基因型與產羔數的關聯分析

3 討 論

3.1基因與產羔性能的關系 Otsuka研究發(fā)現，骨形態(tài)發(fā)生蛋白中主要是以、和基因通過調節(jié)顆粒細胞的增殖和類固醇的生成，在雌性動物生殖過程中發(fā)揮著關鍵作用。Χie 等通過熒光定量PCR 發(fā)現，和基因在新西蘭兔的卵巢發(fā)育過程中均有表達，其中60 日齡的卵巢中和的表達量均顯著高于120 日齡和6 日齡，且基因的表達量始終高于基因的表達量。還有研究發(fā)現，基因可誘導人顆粒細胞中卵泡刺激素受體（FSHR）的表達，同時還降低促黃體生成素受體（LHR）和類固醇生成的急性調節(jié)蛋白（STAR）的表達，從而促進卵泡的生成。魏強研究發(fā)現，基因位點的不同基因型與豬的總產仔數、活產仔數、斷奶頭數上差異極顯著。除此之外，張壯彪等發(fā)現基因在綿羊性腺軸的7 種組織中均有表達,其中產多羔的小尾寒羊輸卵管、卵巢、下丘腦、垂體、小腦的表達量均高于產單羔蘇尼特羊。Zhang 等在后續(xù)研究中發(fā)現，基因的g.48462350C＞T 位點與小尾寒羊平均產羔數顯著相關（＜0.05），這與本實驗的研究結果不一致，可能是因為選擇的群體不同所導致的。因此，基因可能通過調控卵巢發(fā)育和卵巢功能對雌性動物的產羔性能產生影響。

本研究發(fā)現，基因的g.48462350C＞T 位點在杜泊羊、灘寒雜交羊、雜一代、雜二代、橫交一代5個綿羊群體中均表現為中度多態(tài)（0.25＜PIC＜0.5），表明該位點在上述群體中存在較強的選擇和育種潛力。卡方適合性檢驗分析表明，該位點在D 群體不處于哈代-溫伯格平衡狀態(tài)（＜0.05），這可能與本實驗的人工選擇有關，在其他群體均處于哈代-溫伯格平衡狀態(tài)（＞0.05），表明該位點在其他群體具有適應性較強的優(yōu)勢。進一步與產羔數關聯分析發(fā)現，該位點不同基因型之間均與產羔數無顯著差異（＞0.05），即該位點不適用于上述5 個綿羊群體多羔性狀的選育。

3.2基因與產羔性能的關系 徐業(yè)芬等研究發(fā)現，基因mRNA 在湖羊多羔組中的表達量極顯著高于單羔組，其在后續(xù)研究中發(fā)現，基因mRNA 的表達量在高繁殖率的湖羊組中顯著高于低繁殖率的湖羊組。同時，韋濤的研究結果表明，湖羊卵巢組織基因mRNA 的表達水平與排卵數呈極顯著正相關，該基因A298C 位點AA 型個體第三胎產羔數和經產平均產羔數均顯著高于AB 型，表明基因在湖羊卵泡發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用。此外，孫振梅研究發(fā)現，在單多羔兩組黔北麻羊的垂體、輸卵管、子宮、下丘腦、卵巢5 個繁殖組織中均檢測到基因mRNA 的表達，其中在卵巢組織中的表達量最高，在下丘腦中最低，而且該研究還發(fā)現在黔北麻羊的卵巢組織中，多羔組基因的表達量顯著高于單羔組。Rajesh 等研究發(fā)現，和基因可刺激雌激素的產生并且促進水牛卵巢卵泡中顆粒細胞的存活。還有研究發(fā)現，基因可以促進雞原始生殖細胞的生成。上述結果均表明，基因對雌性動物產羔性能的作用十分重要。

本研究發(fā)現，基因的g.63454744T＞G 位點在5 個綿羊群體中均表現為低度多態(tài)（PIC＜0.25），表明該位點在上述綿羊群體中具有較小的選擇潛力。經卡方適合性檢驗分析，該位點在5 個綿羊群體中均處于哈代-溫伯格平衡狀態(tài)（＞0.05），說明該位點具有適應性較強的優(yōu)勢。進一步與產羔數關聯分析發(fā)現，該位點不同基因型之間均與產羔數無顯著差異（＞0.05），即該位點不適用于上述5 個綿羊群體多羔性狀的選育。

3.3基因與產羔性能的關系對動物繁殖性能具有重要的調控作用，在卵巢組織中的表達水平以及基因多態(tài)性均與家畜的繁殖力有關。研究發(fā)現，洛克豬和豫南黑豬群體外顯子區(qū)存在T98C 位點多態(tài)位點，AA 型個體的總產仔數顯著高于AB 型；蘇淮豬基因3'-UTR 區(qū)c.*273A＞G，其多態(tài)性與產仔數性狀顯著關聯，AA 型個體產仔數高于GG 型。在綿羊群體中，基因對產羔性能的影響也有研究，Χu 等發(fā)現湖羊多羔母羊卵泡中的mRNA 表達量顯著高于單羔個體；張壯彪等發(fā)現基因在繁殖性能高的小尾寒羊輸卵管、卵巢、下丘腦、垂體、大腦中的表達量均高于蘇尼特羊；Zhang 等發(fā)現小尾寒羊的基因啟動子區(qū)g.58171886A＞C 突變位點多態(tài)性與產羔性狀顯著關聯，CC 型個體產羔數顯著高于AC 型和AA 型。上述結果表明，基因對綿羊產羔性能的影響非常重要，可作為綿羊繁殖性狀的候選基因。

本研究發(fā)現，基因的g.58171856C＞G 位點在5 個綿羊群體中均表現為低度多態(tài)（PIC＜0.25），表明該位點在上述綿羊群體中具有較小的選擇潛力。經卡方適合性檢驗分析，該位點在5 個綿羊群體均處于哈代-溫伯格平衡狀態(tài)（＞0.05），說明該位點在選擇過程中適應性較強。進一步與產羔數關聯分析發(fā)現，該位點不同基因型之間均與產羔數無顯著差異，即該位點不適用于上述5 個綿羊群體多羔性狀的選育，這與上述討論結果存在差異，可能原因是所選群體不同造成的。

4 結 論

本研究發(fā)現，基因g.48462350C＞T 和基因g.63454744T＞G 以及基因g.58171856C＞G位點多態(tài)性與上述5 個綿羊群體產羔數均不顯著，不適用于在5 個綿羊群體中多羔性狀的選育。