陳子雯 楊春華 權(quán) 睿 王常清

(湖北省恩施土家族苗族自治州中心醫(yī)院1 西藥房，2 中藥房，恩施市 445000，電子郵箱：Chenzw_12345@163.com)

糖尿病和抑郁癥均是常見的慢性病，2018年全球有超過5億人患有2型糖尿病，且近年糖尿病合并抑郁癥患者的數(shù)量呈現(xiàn)增長趨勢[1-2]。既往研究表明，抑郁癥與糖尿病存在雙向關(guān)聯(lián)，抑郁癥是2型糖尿病發(fā)展的主要危險(xiǎn)因素，糖尿病患者的抑郁癥患病率是普通人群的兩倍[3]。研究顯示，合并糖尿病并發(fā)癥、家庭月收入低、經(jīng)歷生活不良事件和社會支持差是糖尿病患者合并抑郁癥的危險(xiǎn)因素[4]。但糖尿病與抑郁癥之間的病理生理聯(lián)系尚未明確。

2型糖尿病并發(fā)的抑郁癥以自殺傾向和抑郁復(fù)發(fā)為特征，因此尋找有效的藥物預(yù)防2型糖尿病患者抑郁癥發(fā)作具有重要意義[5]。青蒿素是一種倍半萜內(nèi)酯，為無色針狀晶體，具有過氧化物基團(tuán)，其分子式為C15H22O5[6]。雙氫青蒿素(dihydroartemisinin，DHA)是青蒿素的衍生物，青蒿素和DHA具有抗瘧[7-8]、抗腫瘤[9]、抗炎[10]和抗肥胖[11]作用。研究表明，DHA可以減輕肝細(xì)胞脂肪變性和肝纖維化[12-13]。但DHA對糖尿病的作用尚未有研究報(bào)告。本研究以鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)/慢性不可預(yù)測輕度應(yīng)激(chronic unpredictable mild stress，CUMS)誘導(dǎo)糖尿病并發(fā)抑郁癥大鼠模型，探究DHA對模型大鼠的神經(jīng)保護(hù)和糖脂代謝的影響。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器 DHA購自上海源葉科技有限公司(批號：B21182)，STZ、脫氧核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end labeling，TUNEL)試劑盒購自美國Sigma公司(批號：V900890、QIA39)；大鼠胰島素試劑盒購自德國Merck公司(批號：EZRMI-13K)；5-羥色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)、5-羥吲哚乙酸(5-hydroxyindoleacetic acid，5-HIAA) 酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)試劑盒購自武漢華美生物工程有限公司(批號：CSB-E08364r、CSB-E13983r)；放射免疫沉淀裂解緩沖液、蘇木精-伊紅 (hematoxylin-eosin，HE)染色試劑盒購自北京索萊寶公司(批號：R0010、G1120)；二喹啉甲酸試劑盒購自上海碧云天公司(批號：P0012)；抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)抗體、磷酸腺苷激活的蛋白激酶α1亞單位(adenosine 5′-monophosphate-activated protein kinase α1 subunit，AMPKα1)抗體、過氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因子1α(peroxisome proliferator γ activated receptor coactivator 1α，PPARGC1A)抗體、抗葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4(glucose transporter 4，GLUT4)抗體購自英國Abcam公司(批號：ab181602、ab32047、ab191838、ab216661)；抗谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體1(glutamate transporter 1，GLT-1)抗體、抗腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF )抗體及辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔二抗購自北京博奧森公司(批號：bs-1751R、bs-4989R、bs-0295G)；總膽固醇、三酰甘油、HDL-C和LDL-C試劑盒購自南京建成生物工程研究所(批號：A111-1-1、A110-1-1、A112-1-1、A113-1-1)。Varioskan LUX多功能酶標(biāo)儀購自美國Thermo Fisher公司；CT-X10試紙操作型血糖儀購自德國Elegance公司；Tanon 4800 Multi凝膠成像儀購自上海天能公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物 健康的無特定病原體級雄性SD大鼠35只，7～8周齡，體質(zhì)量為(200±20)g，購自第二軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，動物生產(chǎn)許可證號為SCXK(滬)2012-0003。大鼠均在溫度(24±2)℃、濕度50%左右、光照為12/12 h光-暗環(huán)境下適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。

1.3 建立糖尿病并發(fā)抑郁癥大鼠模型 將大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為對照組(n=7)和糖尿病組(n=28)。對照組給予日常飲食，糖尿病組給予高脂食物(55%的脂肪、25%的蛋白質(zhì)和20%的碳水化合物)，兩組大鼠飼養(yǎng)2周后，禁食12 h，糖尿病組大鼠連續(xù)2 d腹腔內(nèi)注射新鮮制備的溶于0.1 mol/L檸檬酸鹽緩沖液(pH值=4.5)的1 mg/mL STZ(40 mg/kg)，對照組大鼠腹腔內(nèi)注射等量的檸檬酸鹽緩沖液。1周后使用試紙操作型血糖儀(美國碩騰公司)隨機(jī)測量糖尿病組3只大鼠空腹血糖，高于16.7 mmol/L即判定為糖尿病模型建模成功，立即開始進(jìn)行CUMS誘導(dǎo)，對照組不予誘導(dǎo)。CUMS誘導(dǎo)方法為28 d內(nèi)隨機(jī)接受以下7種刺激：(1)傾斜45° 24 h；(2)4℃冰水游泳5 min；(3)禁食和禁水24 h；(4)夾尾2 min；(5)潮濕墊料24 h；(6)擁擠24 h (14只大鼠/籠)；(7)束縛應(yīng)激6 h。每天接受其中1種應(yīng)激源，連續(xù)兩天不重復(fù)相同刺激。28 d后進(jìn)行蔗糖偏好試驗(yàn)，結(jié)果提示糖尿病組28只大鼠均成功建成抑郁癥模型。

1.4 動物分組及給藥處理 糖尿病并發(fā)抑郁癥模型大鼠建模成功后，采用隨機(jī)數(shù)字表法分成CUMS組、CUMS+DHA 25 mg/kg組、CUMS+DHA 50 mg/kg組、CUMS+DHA 100 mg/kg組，每組7只。上述DHA劑量依據(jù)Yang等[13]的研究確定。CUMS建模成功1周后按分組給予大鼠腹腔注射相應(yīng)劑量的DHA 4 mL，同期對照組與CUMS組給予等量生理鹽水，均為1次/d，連續(xù)給藥4周。

1.5 血清和組織樣本收集 DHA給藥4周后，禁食12 h后，使用試紙操作型血糖儀檢測所有大鼠空腹血糖。用30 mg/kg戊巴比妥鈉麻醉大鼠后采集腹主動脈血5 mL，4℃下以3 000 r/min離心15 min，取上清-80℃儲存以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)。立即處死大鼠并將大腦迅速取出，置于冰上，分離海馬區(qū)組織，一部分海馬區(qū)組織保存于4%多聚甲醛溶液，一部分海馬區(qū)組織用液氮快速冷凍并在-80℃下保存。

1.6 HE染色觀察大鼠海馬區(qū)損傷情況 將固定于4%多聚甲醛溶液中的大鼠腦海馬區(qū)組織常規(guī)脫水制成石蠟切片，然后脫蠟、蘇木精染色、1%鹽酸酒精分化、0.6%氨水返藍(lán)、0.5%伊紅染色，接著常規(guī)脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，在光學(xué)顯微鏡(日本奧林巴斯公司，型號BX43)下(×200)觀察神經(jīng)元形態(tài)變化。

1.7 大鼠血清5-HT和5-HIAA水平的測定 取1.5保存的大鼠血清，檢測5-HT和5-HIAA水平，操作按試劑盒說明書進(jìn)行。

1.8 蛋白免疫印跡法檢測大鼠海馬組織GLT-1、BDNF和代謝通路相關(guān)蛋白的相對表達(dá)水平 使用放射免疫沉淀裂解緩沖液提取1.5中-80℃保存的海馬區(qū)組織總蛋白，用二喹啉甲酸試劑盒測量蛋白質(zhì)濃度并調(diào)平后，用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì)，然后將其轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜(上海Millipore公司，批號：03010040001)上，用含有5%脫脂牛奶的TBST緩沖液封閉1 h后，與AMPKα1( 1 ∶1 000)、PPARGC1A(1 ∶1 000)、GLUT4(1 ∶1 000)、GLT-1(1 ∶1 000)、BDNF(1 ∶1 000)一抗4℃孵育過夜。TBST洗滌3次，并與辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗(1 ∶3 000)37℃孵育2 h。電化學(xué)發(fā)光液(上海碧云天公司，批號：P0018FM)顯影并用Image J軟件分析蛋白條帶的灰度值，以GAPDH為內(nèi)參，計(jì)算GLT-1、BDNF和代謝通路相關(guān)蛋白的相對表達(dá)水平。

1.9 TUNEL染色法檢測海馬組織細(xì)胞凋亡 將1.6的海馬區(qū)組織石蠟切片脫蠟，按照TUNEL試劑盒說明書進(jìn)行染色，封片后在光學(xué)顯微鏡下(×200)觀察凋亡細(xì)胞。隨機(jī)選取5個(gè)視野計(jì)數(shù)TUNEL陽性細(xì)胞(染色為棕色的細(xì)胞)的數(shù)量。

1.10 大鼠血清胰島素水平的測定 取1.5中-80℃保存的血清，使用大鼠胰島素試劑盒檢測大鼠血清胰島素水平。

1.11 大鼠血清總膽固醇、三酰甘油、LDL-C和HDL-C水平的檢測 取1.5中-80℃保存的大鼠血清，按照試劑盒說明書檢測總膽固醇、三酰甘油、LDL-C和HDL-C水平。

1.12 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以(x±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 5組大鼠海馬神經(jīng)元形態(tài)病理變化 對照組海馬神經(jīng)元呈圓形，結(jié)構(gòu)清晰完整，排列良好；CUMS組海馬神經(jīng)元核固縮，染色加深，呈不規(guī)則、多邊形和梭形，且神經(jīng)元數(shù)量減少，排列松散；與CUMS組比較，CUMS+DHA 25 mg/kg組的神經(jīng)元形態(tài)無明顯差異，但CUMS+DHA 50 mg/kg組和CUMS+DHA 100 mg/kg組的大部分神經(jīng)元結(jié)構(gòu)完整，數(shù)量增多，核固縮較少見。見圖1。

圖1 5組大鼠海馬組織神經(jīng)元形態(tài)病理變化(HE染色，×200)

2.2 5組大鼠血清5-HT和5-HIAA水平的比較 與對照組比較，CUMS組大鼠血清5-HT和5-HIAA水平降低(均P<0.05)；CUMS+DHA 50 mg/kg組和CUMS+DHA 100 mg/kg組大鼠血清5-HT和5-HIAA水平均高于CUMS組(均P<0.05)，但CUMS組與CUMS+DHA 25 mg/kg組的5-HT和5-HIAA水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；在DHA干預(yù)組中，隨著DHA劑量增加，5-HT和5-HIAA水平逐漸升高(均P<0.05)。見表1。

表1 5組大鼠血清5-HT和5-HIAA水平的比較(x±s，ng/mg)

2.3 5組大鼠海馬組織中GLT-1和BDNF蛋白相對表達(dá)水平的比較 與對照組比較，CUMS組大鼠海馬組織中GLT-1和BDNF蛋白的表達(dá)下調(diào)(均P<0.05)；與CUMS組相比，CUMS+DHA 50 mg/kg組和CUMS+DHA 100 mg/kg組大鼠海馬組織中GLT-1和BDNF蛋白的表達(dá)上調(diào)(均P<0.05)；在DHA干預(yù)組中，隨著DHA劑量增加，GLT-1和BDNF蛋白的表達(dá)均呈上升趨勢。見圖2和表2。

圖2 5組大鼠海馬組織中GLT-1和BDNF的表達(dá)注：A為對照組，B為CUMS組，C為CUMS+DHA 25 mg/kg組，D為CUMS+DHA 50 mg/kg組，E為CUMS+DHA 100 mg/kg組。

表2 5組大鼠海馬組織中GLT-1和BDNF蛋白相對表達(dá)水平的比較(x±s)

2.4 5組大鼠代謝通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平的比較 與對照組比較，CUMS組大鼠海馬組織中磷酸化AMPKα1(phosphorylated AMPKα1，p-AMPKα1)/AMPKα1比值降低、PPARGC1A和GLUT4蛋白的表達(dá)均下調(diào)(均P<0.05)；與CUMS組比較，CUMS+DHA 50 mg/kg組和CUMS+DHA 100 mg/kg組大鼠海馬組織中p-AMPKα1/AMPKα1比值升高、PPARGC1A和GLUT4蛋白的表達(dá)上調(diào)(均P<0.05)，但CUMS組與CUMS+DHA 25 mg/kg組的p-AMPKα1/AMPKα1比值、PPARGC1A和GLUT4蛋白表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)；在DHA干預(yù)組中，隨著DHA劑量增加，上述指標(biāo)均呈升高趨勢(均P<0.05)。見圖3和表3。

圖3 5組大鼠海馬組織p-AMPKα1、AMPKα1、PPARGC1A和GLUT4蛋白的表達(dá)注：A為對照組，B為CUMS組，C為CUMS+DHA 25 mg/kg組，D為CUMS+DHA 50 mg/kg組，E為CUMS+DHA 100 mg/kg組。

表3 5組大鼠海馬組織AMPKα1比值、PPARGC1A和GLUT4蛋白相對表達(dá)水平的比較(x±s)

2.5 5組大鼠海馬組織細(xì)胞凋亡情況的比較 與對照組比較，CUMS組大鼠腦組織凋亡細(xì)胞數(shù)目增多(P<0.05)；與CUMS組比較，CUMS+DHA 50 mg/kg組和CUMS+DHA 100 mg/kg組大鼠腦組織凋亡細(xì)胞數(shù)目減少(均P<0.05)，但CUMS+DHA 25 mg/kg組與CUMS組凋亡細(xì)胞數(shù)目差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；在DHA干預(yù)組中，隨DHA劑量增加，凋亡細(xì)胞數(shù)呈下降趨勢(均P<0.05)。見圖4和表4。

圖4 5組大鼠海馬組織細(xì)胞凋亡情況(TUNEL染色，×200)

表4 5組大鼠海馬組織凋亡細(xì)胞數(shù)目的比較(x±s，個(gè))

2.6 5組大鼠血清代謝指標(biāo)的比較 與對照組比較，CUMS組大鼠總膽固醇、三酰甘油、LDL-C、空腹血糖、胰島素水平升高，HDL-C水平降低(P<0.05)；與CUMS組相比，CUMS+DHA 50 mg/kg組和 CUMS+DHA 100 mg/kg組大鼠總膽固醇、三酰甘油、LDL-C、空腹血糖、胰島素水平下降，HDL-C水平升高(均P<0.05)，但CUMS組與CUMS+DHA 25 mg/kg組上述指標(biāo)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)；在DHA干預(yù)組中，隨著DHA劑量增加，總膽固醇、三酰甘油、LDL-C、空腹血糖、胰島素水平均呈下降趨勢(均P<0.05)。見表5和表6。

表5 5組大鼠總膽固醇、三酰甘油、LDL-C和HDL-C水平的比較(x±s，mmol/L)

表6 5組大鼠空腹血糖和胰島素水平的比較(x±s)

3 討 論

合適的糖尿病動物模型在證明糖尿病并發(fā)抑郁癥的潛在機(jī)制中起著重要作用。高脂食物和STZ誘導(dǎo)的2型糖尿病大鼠模型與人類的臨床情況非常相似，已受到廣泛認(rèn)可[14]。本研究通過高脂食物/STZ誘導(dǎo)糖尿病大鼠模型并施以CUMS刺激進(jìn)一步誘導(dǎo)抑郁癥，發(fā)現(xiàn)與對照組相比，CUMS組大鼠空腹血糖>16.7 mmol/L，且蔗糖偏好度降低，海馬神經(jīng)元核固縮，神經(jīng)元結(jié)構(gòu)異常，數(shù)量減少，排列松散，表明糖尿病并發(fā)抑郁癥大鼠模型構(gòu)建成功。

2型糖尿病以胰島素抵抗為特征，而胰島素抵抗的標(biāo)志性特征包括高水平的血糖和血清胰島素[15]。本研究中，糖尿病并發(fā)抑郁癥大鼠的空腹血糖和血清胰島素水平明顯升高，表明產(chǎn)生胰島素抵抗。給予 腹腔注射25 mg/kg、50 mg/kg、100 mg/kg的DHA進(jìn)行治療后，與CUMS組相比，CUMS+DHA 50 mg/kg組和CUMS+DHA 100 mg/kg組大鼠的空腹血糖和血清胰島素水平均下降，且呈劑量依賴性，這提示一定劑量的DHA可有效控制糖尿病并發(fā)抑郁癥大鼠的血糖，減輕胰島素抵抗。研究顯示，2型糖尿病患者的胰島素抵抗與三酰甘油、膽固醇和相關(guān)脂蛋白升高有關(guān)[15-17]。本研究中，與對照組比較，CUMS組大鼠血清總膽固醇、三酰甘油和LDL-C水平升高，HDL-C水平降低(P<0.05)；與CUMS組相比，CUMS+DHA 50 mg/kg組和CUMS+DHA 100 mg/kg組大鼠血清總膽固醇、三酰甘油和LDL-C水平下降，HDL-C水平升高(P<0.05)，呈劑量依賴性。說明DHA可有效改善糖尿病并發(fā)抑郁癥大鼠的血脂代謝紊亂。

AMPKα1是磷酸腺苷依賴的蛋白激酶，對機(jī)體保持葡萄糖平衡起到至關(guān)重要的作用，是研究糖尿病及其他代謝相關(guān)疾病的核心因子[18]。PPARGC1A是調(diào)節(jié)細(xì)胞能量代謝的重要輔助活化因子，其在糖代謝、脂代謝中發(fā)揮重要作用[19]。GLUT4是一種受胰島素信號傳導(dǎo)途徑調(diào)控的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，是葡萄糖代謝的限速因子[20]。本研究結(jié)果顯示，與對照組比較，CUMS組大鼠腦組織中p-AMPKα1/AMPKα1比值、PPARGC1A和GLUT4蛋白的表達(dá)下調(diào)(P<0.05)；與CUMS組比較，CUMS+DHA 50 mg/kg組和CUMS+DHA 100 mg/kg組大鼠腦組織中p-AMPKα1/AMPKα1比值、PPARGC1A和GLUT4蛋白的表達(dá)上調(diào)(P<0.05)。說明DHA可通過上調(diào)AMPKα1磷酸化水平與PPARGC1A和GLUT4的表達(dá)，使糖尿病并發(fā)抑郁癥大鼠的糖脂代謝恢復(fù)正常。

慢性應(yīng)激誘導(dǎo)的海馬結(jié)構(gòu)重塑和功能損傷，包括突觸可塑性改變、神經(jīng)發(fā)生減少、樹突狀萎縮增加和神經(jīng)元凋亡增加，這些改變都與抑郁癥和認(rèn)知缺陷密切相關(guān)[21]。本研究結(jié)果顯示，與對照組比較，CUMS組大鼠腦組織凋亡細(xì)胞數(shù)目增多(P<0.05)，海馬神經(jīng)元核固縮，染色加深，呈不規(guī)則、多邊形和梭形，且神經(jīng)元數(shù)量減少，排列松散；而與CUMS組比較，CUMS+DHA 50mg/kg組和CUMS+DHA 100 mg/kg組大鼠腦組織凋亡細(xì)胞數(shù)目減少(P<0.05)，大部分海馬神經(jīng)元結(jié)構(gòu)完整，數(shù)量增多，核固縮較少見。這說明DHA在有效調(diào)控糖尿病并發(fā)抑郁癥大鼠糖脂代謝的同時(shí)，還能夠抑制海馬神經(jīng)元凋亡以及減輕神經(jīng)損傷，從而減輕抑郁癥的癥狀。

5-HIAA是5-HT的代謝產(chǎn)物，兩者均為中樞神經(jīng)系統(tǒng)中重要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，參與調(diào)節(jié)情緒、睡眠、記憶、內(nèi)分泌等多種生命活動，與抑郁癥的發(fā)生密切相關(guān)[22]。BDNF是一種神經(jīng)營養(yǎng)蛋白，參與控制情緒、學(xué)習(xí)和認(rèn)知等活動，在復(fù)發(fā)性情緒障礙的發(fā)病中具有重要作用[23]，其在抑郁癥患者血清中的水平異常降低[24]。谷氨酸過量與抑郁癥的發(fā)生有關(guān)，GLT-1可降低突觸間隙過高的谷氨酸水平，減輕過高濃度的谷氨酸對神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的興奮毒性作用[25]。本研究結(jié)果顯示，與對照組比較，CUMS組大鼠血清5-HT、5-HIAA水平降低，海馬組織中GLT-1、BDNF蛋白表達(dá)下調(diào)(P<0.05)；與CUMS組相比，CUMS+DHA 50mg/kg組和CUMS+DHA 100 mg/kg組大鼠血清5-HT、5-HIAA水平升高，海馬組織中GLT-1、BDNF蛋白表達(dá)上調(diào)(P<0.05)，且呈現(xiàn)劑量依賴性。說明DHA可通過升高單胺類神經(jīng)遞質(zhì)水平以及GLT-1、BDNF蛋白的表達(dá)，阻止糖尿病并發(fā)抑郁癥大鼠抑郁癥的進(jìn)展。

綜上所述，DHA可通過調(diào)控代謝相關(guān)通路的蛋白表達(dá)，改善糖尿病并發(fā)抑郁癥大鼠的糖脂代謝紊亂和胰島素抵抗，同時(shí)可上調(diào)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)水平以及GLT-1、BDNF蛋白的表達(dá)，抑制海馬神經(jīng)元凋亡以及減輕神經(jīng)損傷，從而阻止大鼠抑郁癥的進(jìn)展。