趙梓君，王 松

（西華大學建筑與土木工程學院，四川 成都 610039）

在堆肥過程中，氮素損失是一個非常關鍵的問題。大量研究結果表明，堆肥原料、堆肥方式的不同以及堆肥工藝參數(shù)控制的不同，氮素損失量平均可達40%[1]，糞便堆肥的氮損失可高達77%[2]。堆肥實際應用過程中氮素損失是不可避免的，其主要損失是堆肥高溫階段NH3的釋放[3-4]。在堆肥的升溫期間產生大量的銨態(tài)氮，至高溫期銨態(tài)氮的累積會使pH 增加，此時堆體的高pH 和高溫破壞了NH3和NH4＋在堆體水相中與NH3·H2O 的動態(tài)平衡，使NH3/銨態(tài)氮的平衡向生成NH3方向移動并加速了NH3的揮發(fā)[5-6]。由于普通的氨氧化細菌無法生存在堆肥的高溫期，只有嗜熱的自養(yǎng)型氨氧化細菌會在高溫期起作用，這樣仍舊會使得NH4＋轉化為NH3大量揮發(fā)，造成大量氮素損失。因此，對嗜熱異養(yǎng)氨氧化細菌進行研究，有利于減少堆肥中氮素損失，提高堆肥產品肥效。

目前已有學者從溫泉、深海熱液出口和畜禽糞便堆肥等地方發(fā)現(xiàn)并分離出嗜熱氨氧化細菌[7-9]。因此，本實驗擬從農村混合（化糞池水、秸稈以及土壤）好氧堆肥高溫期樣品分離鑒定出嗜熱異養(yǎng)氨氧化細菌，為后續(xù)學者進行研究提供一些經驗和思路。

1 材料與方法

1.1 采樣、培養(yǎng)及分析檢測

1.1.1 樣品采集

樣品取自湖南省長沙縣某農村地區(qū)采集pH 接近7、水體溫度為7.2 ℃的化糞池水樣、水稻秸稈以及土壤混合好氧堆肥的高溫期堆料。

1.1.2 培養(yǎng)基

異養(yǎng)氨氧化細菌培養(yǎng)基：乙酰胺2 g、NaOH1.6g、KH2PO48.2 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、KCl 0.5 g、CuSO4·5H2O 0.5 mg、CaSO4·2H2O 0.5 mg、ZnSO4·7H2O 0.5 mg、FeCl3·6H2O 0.5 mg、pH 值7.0、蒸餾水1 000 mL、121 ℃蒸汽滅菌30 min；固體另添加15 g～20 g瓊脂粉。

1.2 富集分離純化

1.2.1 富集

取本實驗堆肥高溫期樣品10 g 加入90 mL 放有玻璃珠的無菌水中，置于50 ℃的200 r/min 搖床中充分振蕩30 min 左右，使菌體膠團盡可能被打散；再將菌液樣品以25%比例加入上述液體培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)，溫度50 ℃，轉速200 r/min，其間同樣以25%比例轉接兩次新鮮培養(yǎng)基，經多次富集，得到7 d 富集液。

1.2.2 分離純化

異養(yǎng)氨氧化細菌的分離純化采用稀釋涂布平板法和平板劃線法，取0.05 mL～0.1 mL 稀釋富集液，均勻涂布在平板上，再將平板用保鮮膜封起來倒置于50 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至有菌落生成，記錄觀察菌落的生長情況；根據(jù)肉眼菌落數(shù)量、形態(tài)、顏色、表面狀況及染色特征，挑取有代表性的菌落在平板上劃線培養(yǎng)直至純化；將挑取純化出的各單菌落接種至異養(yǎng)氨氧化細菌液體培養(yǎng)基中，于50 ℃、130 r/min 搖床振蕩培養(yǎng)7 d后，吸取兩滴7 d培養(yǎng)物置于白瓷比色板上，滴加格利斯試劑兩滴，顏色顯示為紅色，該菌具有氨氧化能力。

1.3 菌株鑒定

形態(tài)學鑒定：挑取培養(yǎng)基上單菌落于載玻片上，通過革蘭氏染色，在顯微鏡下觀察。

16S rDNA 法：取適量菌液利用細菌基因組DNA提取試劑盒提取DNA，通過PCR 引物擴增細菌的16S rDNA，經過湖南省長沙擎風科技有限公司測序后，將測序結果提交NCBI 進行BLAST 進行對比，初步確定其種屬，再通過MEGA-X 進行系統(tǒng)發(fā)育分析，建立系統(tǒng)發(fā)育分析進化樹。

2 結果與分析

2.1 菌株分離純化

從農村混合好氧堆肥高溫期樣品中分離出一株具有氨氧化能力的嗜熱菌株，經過肉眼觀察分離純化后的單菌落多為圓形，呈現(xiàn)白色，且光滑，如圖1所示。通過顯微鏡觀察，該菌菌體呈桿狀，有芽孢，經過革蘭氏染色后呈現(xiàn)紅色，為革蘭氏陰性菌，如圖2 所示。

圖1 氨氧化細菌單菌落

圖2 革蘭氏染色

2.2 菌株鑒定

將16S rDNA 測序結果提交NCBI 進行BLAST分析，通過MEGA-X、DNAMAN 等軟件進行基因序列的比對與系統(tǒng)進化分析，并采用N-J（Neignbor-Johning）法建立系統(tǒng)進化樹，如圖3 所示。對該目的菌株(ZZJ)進行初步鑒定，結果表明：ZZJ 與KJ842637.1 Aeribacillus pallidus strain TS 12[10]以及MW282865.1 Aeribacillus pallidus strain SURF-15S[11]相似度為100%，因此初步鑒定為Aeribacillus pallidus strain。

圖3 菌株ZZJ 的系統(tǒng)進化樹

3 結論

本實驗從農村混合好氧堆肥高溫堆料中分離出一株嗜熱異養(yǎng)氨氧化細菌，通過16S rDNA 擴增，經NCBI Blast 檢索，該菌基因序列和KJ842637.1 Aeribacillus pallidus strain TS 12 以及MW282865.1 Aeribacillus pallidus strain SURF-15S 有100%相似度，初步鑒定為Aeribacillus pallidus strain，與目前已經發(fā)現(xiàn)的部分嗜熱氨氧化細菌的屬相同，屬于芽孢桿菌屬。