劉鳴昊， 劉素彤， 張麗慧， 顧亞嬌， 尚東方， 肖 準(zhǔn)， 趙文霞

河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 脾胃肝膽科， 鄭州 450000

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是最常見(jiàn)的慢性肝病之一，疾病譜從單純性脂肪變到脂肪性肝炎，晚期纖維化和肝硬化[1]。非酒精性脂肪性肝炎(NASH)是最嚴(yán)重的NAFLD形式，也是臨床干預(yù)的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)。研究[2]表明，肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)積累引發(fā)的細(xì)胞程序性死亡是導(dǎo)致肝組織損傷和炎癥的可能原因。而鐵死亡是NASH中最先發(fā)生的細(xì)胞死亡形式。特異性抑制鐵死亡，肝組織炎癥幾乎被完全抑制[3]。鐵死亡可能是NAFLD向NASH轉(zhuǎn)化的重要機(jī)制。本綜述概括了鐵死亡的發(fā)生機(jī)制及在NAFLD/NASH中的作用(圖1)，并對(duì)鐵死亡的研究提供實(shí)驗(yàn)建議。

鐵死亡是一種鐵依賴性、以脂質(zhì)活性氧(ROS)堆積為特點(diǎn)的非凋亡形式的細(xì)胞死亡方式[4]。其發(fā)生機(jī)制已被部分揭示[5]：其一，超載的鐵離子通過(guò)芬頓反應(yīng)產(chǎn)生大量羥基自由基，從而催化一系列氧化應(yīng)激反應(yīng)，造成細(xì)胞核、細(xì)胞膜、細(xì)胞器、蛋白質(zhì)等破壞；其二，脂代謝途徑通過(guò)誘發(fā)脂質(zhì)過(guò)氧化最終導(dǎo)致鐵死亡；其次，大量的抗氧化劑GSH被脂質(zhì)過(guò)氧化物和氫過(guò)氧化物消耗，造成GPX4失活。其中GSH的耗竭和GPX4的失活被認(rèn)為是鐵死亡過(guò)程中促進(jìn)脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的必要因素。System Xc-作為抗氧化系統(tǒng)上游關(guān)鍵蛋白，主要調(diào)節(jié)谷氨酸與半胱氨酸的轉(zhuǎn)運(yùn)平衡和參與GSH的合成。鐵穩(wěn)態(tài)失衡、脂質(zhì)過(guò)氧化及SLC7A11-GSH-GPX4軸失衡為鐵死亡發(fā)生的“三大標(biāo)志”。

1 鐵穩(wěn)態(tài)失衡與鐵死亡

鐵作為一種必需的微量元素，對(duì)維持機(jī)體正常生理功能至關(guān)重要。例如氧氣運(yùn)輸，線粒體呼吸，DNA復(fù)制和細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)。正常狀態(tài)下[6]，由小腸上皮細(xì)胞吸收的或紅細(xì)胞降解釋放的Fe2+被氧化為Fe3+，F(xiàn)e3+經(jīng)膜上轉(zhuǎn)鐵蛋白及其受體作用后被內(nèi)吞入細(xì)胞內(nèi)，繼而被還原為Fe2+，在二價(jià)金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1的作用下以鐵蛋白輕鏈多肽、鐵蛋白重鏈多肽組成的鐵儲(chǔ)存蛋白復(fù)合物的形式儲(chǔ)存在細(xì)胞內(nèi)不穩(wěn)定鐵池中。剩余的部分Fe2+則被氧化為Fe3+轉(zhuǎn)出胞內(nèi)，以轉(zhuǎn)鐵蛋白-Fe3+復(fù)合物的形式參與體內(nèi)的鐵循環(huán)過(guò)程，以維持體內(nèi)鐵的動(dòng)態(tài)平衡[7]。但是，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)存在過(guò)量的游離Fe2+時(shí)，將通過(guò)芬頓反應(yīng)導(dǎo)致羥基自由基的形成[8]。誘導(dǎo)DNA，蛋白質(zhì)和脂質(zhì)的破壞引起細(xì)胞毒性。 除了鐵池積累外，影響鐵穩(wěn)態(tài)的相關(guān)基因也參與鐵死亡。例如NCOA4[9]，一種負(fù)責(zé)將鐵蛋白重鏈多肽招募到自噬小體從而使溶酶體降解鐵蛋白、釋放鐵的運(yùn)載蛋白，導(dǎo)致游離鐵釋放貨物受體。當(dāng)鐵含量豐富時(shí)，NCOA4與E3泛素連接酶 HERC2相互作用，促進(jìn)NCOA4的泛素化和降解。當(dāng)NCOA4或自噬相關(guān)基因(autophagy-related gene,ATG)(例如 ATG3、ATG5、ATG7 和 ATG13)基因敲減后，則能夠抑制由Ⅰ型鐵死亡激活劑Erastin誘導(dǎo)的鐵蛋白降解、鐵積累和脂質(zhì)過(guò)氧化及鐵死亡，而NCOA4的過(guò)表達(dá)能夠促進(jìn)鐵死亡的發(fā)生。研究[10]發(fā)現(xiàn)，Beclin1可以通過(guò)直接與System Xc-核心成分溶質(zhì)載體家族T成員11(SLC7A11)結(jié)合抑制System Xc-活性，促進(jìn)Erastin誘導(dǎo)的鐵死亡。在Beclin1過(guò)表達(dá)處理的細(xì)胞中，鐵含量增加，GSH耗竭嚴(yán)重，同時(shí)脂質(zhì)氧化應(yīng)激反應(yīng)加重，Beclin1-SLC7A11復(fù)合物表達(dá)增多，促進(jìn)細(xì)胞死亡；相反，Beclin1基因敲減后，鐵沉積減少，鐵蛋白表達(dá)增加，抗氧化劑GSH增加，脂質(zhì)氧化應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)蛋白SLC11A2、SLC40A1等表達(dá)減少，同時(shí)阻礙Beclin1-SLC7A11復(fù)合物形成，細(xì)胞鐵死亡減少。同樣，體內(nèi)或體外實(shí)驗(yàn)中均發(fā)現(xiàn)，Beclin1 激活肽 Tal-Beclin1 干預(yù)能夠促進(jìn) Erastin 誘導(dǎo)的鐵死亡，進(jìn)而促進(jìn)癌細(xì)胞死亡[11]。

注：a,System Xc—GSH-GPX4軸與鐵死亡發(fā)生機(jī)制；b，脂質(zhì)過(guò)氧化與鐵死亡發(fā)生機(jī)制；c，鐵穩(wěn)態(tài)失衡與鐵死亡發(fā)生機(jī)制。NCOA4，自噬特異性識(shí)別蛋白核受體輔激活因子4；TCA循環(huán)，三羧酸循環(huán)；Fe2+，二價(jià)亞鐵離子；Fe3+，三價(jià)鐵離子；GSH，谷胱甘肽；GPX4，谷胱甘肽過(guò)氧化酶4。

2 脂質(zhì)過(guò)氧化驅(qū)動(dòng)鐵死亡的發(fā)生

鐵死亡由致命的脂質(zhì)過(guò)氧化作用驅(qū)動(dòng)，可以通過(guò)藥物或遺傳手段直接阻斷脂質(zhì)過(guò)氧化來(lái)阻止其發(fā)生。脂質(zhì)過(guò)氧化又分自發(fā)氧化和酶催化。脂質(zhì)的自發(fā)氧化[12]是一種自由原子團(tuán)驅(qū)動(dòng)的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。 多不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids，PUFA)的氫被羥基獲取后形成以碳為中心的脂質(zhì)原子團(tuán)(L-)。氧分子與L-的迅速反應(yīng)產(chǎn)生脂質(zhì)過(guò)氧化原子團(tuán)(LOO-)。隨后，LOO-從臨近的PUFA獲取氫形成氫過(guò)氧化物(LOOH)和一個(gè)新的L-，LOOH在Fe2+的協(xié)作下轉(zhuǎn)化成烷氧基原子團(tuán)(LO-)。這些新的L-與LO-可以與鄰近的PUFA反應(yīng)引起另一次鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。這個(gè)自發(fā)的過(guò)程是由鐵和氧氣催化的，當(dāng)阻止脂質(zhì)過(guò)氧化的分子監(jiān)護(hù)機(jī)制失靈時(shí)，膜被毀掉、細(xì)胞死亡。酶催化的脂質(zhì)過(guò)氧化是PUFA被引導(dǎo)到膜磷脂和中性脂質(zhì)中， 產(chǎn)生大量脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物4-羥基壬烯酸(4-HNE)和丙二醛、磷脂LOOH以及各種被氧化和修飾的蛋白質(zhì)[13]。這些產(chǎn)物可能導(dǎo)致膜結(jié)構(gòu)完整性被破壞，從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡。這個(gè)過(guò)程需要脂代謝的酶催化才能完成。脂酰輔酶A合成酶長(zhǎng)鏈家族成員4(acyl-CoA synthetase long-chain family member 4，ACSL4)和溶血磷脂酰膽堿酰基轉(zhuǎn)移酶3(lysophosphatidylcholine acyltransferase 3，LPCAT3)是驅(qū)動(dòng)鐵死亡的重要脂代謝酶[14]。ACSL4催化長(zhǎng)鏈PUFA(包括花生四烯酸20∶4和腎上腺酸22∶4)和輔酶A連接。這些產(chǎn)物會(huì)被LPCAT3酶重新酯化為磷脂，從而增加細(xì)胞內(nèi)長(zhǎng)鏈PUFA在脂質(zhì)和膜結(jié)構(gòu)中的摻入[15]。研究[16]證實(shí)，在三陰性乳腺癌的一個(gè)細(xì)胞亞群中，ACSL4的表達(dá)水平與其對(duì)于鐵死亡誘導(dǎo)劑的敏感性相關(guān)，且在耐藥的間充質(zhì)癌細(xì)胞和透明細(xì)胞性腎癌細(xì)胞中觀察到了類似的相關(guān)性。抑制ACSL4表達(dá)或許是細(xì)胞對(duì)鐵死亡脫敏的主要機(jī)制。相反，增加ACSL4表達(dá)或提高其活性，可能會(huì)在多種病理生理?xiàng)l件下促進(jìn)鐵死亡，例如缺血-再灌注損傷(一種與鐵死亡誘導(dǎo)密切相關(guān)的病理狀態(tài))以及對(duì)輻射的響應(yīng)[17]。另外，某些脂加氧酶(LOX，非血紅素依賴性的靶向PUFA的雙加氧酶)，能夠直接氧化生物膜中的PUFA及含PUFA的脂質(zhì)，提示LOX可能介導(dǎo)鐵死亡的誘導(dǎo)過(guò)程[18]。敲除Alox15或應(yīng)用LOX抑制劑黃岑素(baicalein)可以保護(hù)小鼠免受缺血性腦損傷[19]。最近的研究[20]表明細(xì)胞色素P450氧化還原酶在啟動(dòng)脂質(zhì)過(guò)氧化中發(fā)揮作用。P450通過(guò)促進(jìn)PUFA脫氫或者通過(guò)將Fe3+還原為Fe2+，直接或間接啟動(dòng)脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)。

3 System Xc--GSH-GPX4軸

System Xc-系統(tǒng)由二硫鍵連接的異二聚體SLC7A11(xCT)和SLC3A2(4F2hc)組成，它可以輸入細(xì)胞外氧化形式的半胱氨酸，即胱氨酸，交換細(xì)胞內(nèi)的谷氨酸[21]。胱氨酸是GSH合成所必需的，抑制胱氨酸的輸入，可以最大程度地耗竭細(xì)胞內(nèi)GSH的水平。GPX4可以抑制復(fù)雜脂質(zhì)(如磷脂和膽固醇)的氫過(guò)氧化反應(yīng)，即使當(dāng)磷脂和膽固醇被嵌入到膜和脂蛋白中時(shí)也可以發(fā)揮抑制作用。通過(guò)耗竭細(xì)胞內(nèi)的GSH(GPX4必備的協(xié)同分子)等直接或間接靶向膜的機(jī)制。GSH是三肽形式的抗氧化劑，可以作為硒依賴性GPX4的協(xié)同分子，輔助GPX4減少脂質(zhì)氫過(guò)氧化物。因此，通過(guò)Erastin耗竭GSH間接滅活GPX4，導(dǎo)致有毒的脂質(zhì)自由基ROS的積累，進(jìn)而促進(jìn)脂質(zhì)過(guò)氧化[22]。在細(xì)胞中過(guò)表達(dá)GPX4使得細(xì)胞抵抗RSL3誘導(dǎo)的鐵死亡，而敲低GPX4促進(jìn)鐵死亡[23]。其他化合物如ML162、withaferin A(WA)和食品藥品管理局批準(zhǔn)的抗癌藥altretamine也可以通過(guò)滅活GPX4誘導(dǎo)鐵死亡[24]。FIN56[25]通過(guò)結(jié)合并激活參與膽固醇合成的鯊烯合酶促進(jìn)鐵死亡。這將導(dǎo)致對(duì)一些代謝物，如脂溶性抗氧化劑輔酶Q10(coQ10)和Sec-tRNA的抑制，導(dǎo)致耗竭或滅活GPX4。類似地，敲除GPX4會(huì)導(dǎo)致脂質(zhì)氧自由基的迅速累積，而這些脂質(zhì)氧自由基可以被親脂原子團(tuán)陷阱和鐵螯合劑抑制。

4 鐵死亡與NAFLD/NASH

越來(lái)越多的證據(jù)[26]表明，鐵死亡在NAFLD/NASH中的潛在生理作用。早在2012年就有學(xué)者[27]發(fā)現(xiàn)，NAFLD患者血清鐵>1.5倍正常值上限與患者肝臟鐵沉積和組織學(xué)炎癥密切相關(guān)，認(rèn)為血清鐵水平的升高是NAFLD向NASH及纖維化進(jìn)展的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。馮燁等[28]也發(fā)現(xiàn)，NASH患者的血清鐵蛋白水平明顯升高，認(rèn)為NASH和肝臟鐵代謝異常之間存在某種聯(lián)系。服用維生素E能夠改善NASH患者的肝臟鐵積聚和脂質(zhì)過(guò)氧化，并降低血清轉(zhuǎn)氨酶水平，減少肝脂肪變性，從而改善NASH 。Violi等[29]給予蛋氨酸/膽堿缺乏飲食(MCD)誘導(dǎo)的NASH模型小鼠RSL3(一種鐵死亡誘導(dǎo)劑)后發(fā)現(xiàn)肝臟脂肪變性有所加劇，而給予用亞硒酸鈉(GPX4激活劑)或Fer-1治療后，NASH嚴(yán)重程度顯著降低。更有研究[30]表明，在缺乏膽堿、補(bǔ)充乙硫氨酸(CDE)飲食的NASH小鼠模型中，鐵死亡是引發(fā)NASH的先發(fā)事件，并且鐵死亡的發(fā)生先于其他類型的細(xì)胞死亡，而鐵死亡抑制劑可抑制此模型鼠肝臟細(xì)胞的鐵死亡，并抑制了隨后的免疫細(xì)胞浸潤(rùn)和炎癥反應(yīng)。

4.1 脂質(zhì)過(guò)氧化驅(qū)動(dòng)鐵死亡參與NAFLD/NASH NAFLD初期肝細(xì)胞內(nèi)脂滴沉積，誘發(fā)脂肪變性，肝細(xì)胞內(nèi)大量游離脂肪酸(FFA)轉(zhuǎn)變成脂酰CoA，然后進(jìn)入線粒體進(jìn)行β氧化。脂質(zhì)貯積增多，肝臟對(duì)FFA攝取的增加使線粒體β-氧化速度代償性增加，進(jìn)而增加ROS的產(chǎn)出，當(dāng)超過(guò)抗氧化物質(zhì)的清除能力導(dǎo)致ROS蓄積時(shí)，此時(shí)ROS與生物膜的磷脂、酶和膜受體相關(guān)的PUFA的側(cè)鏈及核酸等大分子物質(zhì)反應(yīng)形成有毒的脂質(zhì)，從而使細(xì)胞膜的流動(dòng)性和通透性、線粒體的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變，最終破壞膜的穩(wěn)定性[31]。這種脂類的氧化和抗氧化系統(tǒng)的失衡引起的脂類酸敗過(guò)程叫做脂質(zhì)過(guò)氧化。隨著NAFLD的發(fā)展，脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物會(huì)攻擊肝臟中最豐富的肝細(xì)胞，在Fe2+的參與下引發(fā)肝細(xì)胞程序性死亡，通過(guò)亞致死性和致死性應(yīng)激效應(yīng)引起肝細(xì)胞的損傷。脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)不僅造成肝細(xì)胞的損傷還可以消耗細(xì)胞內(nèi)的抗氧化物，導(dǎo)致GSH和維生素E缺乏，形成氧化失衡的惡性循環(huán)。

4.2 鐵過(guò)載誘發(fā)鐵死亡參與NAFLD/NASH發(fā)生 肝臟是機(jī)體重要的儲(chǔ)鐵器官，肝組織鐵代謝失調(diào)導(dǎo)致大量游離鐵的產(chǎn)生，使肝內(nèi)細(xì)胞對(duì)鐵死亡的敏感性顯著提升[32]。胞內(nèi)不穩(wěn)定Fe2+增多后通過(guò)芬頓反應(yīng)促進(jìn)了羥基自由基的形成，誘導(dǎo)了長(zhǎng)鏈PUFA的消耗，促進(jìn)輕度小泡產(chǎn)生和大泡脂肪變性從而誘發(fā)肝脂肪變性和炎癥。有證據(jù)[33]表明體內(nèi)鐵儲(chǔ)存量和胰島素信號(hào)之間存在相關(guān)性，鐵超裁可能加劇胰島素抵抗，而后者是NAFLD/NASH的主要特征。脫鐵治療對(duì)NAFLD、糖尿病有顯著療效?？筛纳埔葝u素抵抗，促進(jìn)胰島素分泌、肝臟酶水平異常。此外，鐵過(guò)載能夠激活肝星狀細(xì)胞，而后者是肝臟纖維形成的核心并最終導(dǎo)致肝硬化[34]。

5 鐵死亡與肝臟炎癥

研究發(fā)現(xiàn), 細(xì)胞發(fā)生鐵死亡后會(huì)釋放相關(guān)因子激活固有免疫系統(tǒng)，并通過(guò)識(shí)別不同模式細(xì)胞死亡的機(jī)制來(lái)激發(fā)炎癥反應(yīng)。在Qi 等[35]的NASH進(jìn)展小鼠模型中，使用GPX4抑制劑RSL-3(鐵死亡誘導(dǎo)劑) 治療后，促炎因子TNFα、IL-1β和IL-6水平均顯著升高，組織病理學(xué)顯示肝脂肪變性、小葉炎癥等明顯; 給予甲磺酸去鐵胺鹽可消除 RSL-3對(duì)小鼠的影響，使用亞硒酸鈉(GPX4 激活劑)或Liproxstatin-1(GPX4 激活劑)治療可抑制小鼠肝臟脂質(zhì)過(guò)氧化，同時(shí)降低NASH的炎癥程度。在Tsurusaki等[36]建立的NASH小鼠模型中，羅格列酮(ACSL4 抑制劑) 和去鐵酮 (鐵螯合劑) 的作用得到了驗(yàn)證，羅格列酮和去鐵酮聯(lián)合治療后小鼠肝損傷的血清標(biāo)志物水平顯著降低，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)被顯著抑制?？梢?jiàn)，鐵死亡抑制劑可以完全保護(hù)肝細(xì)胞免于死亡，并抑制免疫細(xì)胞浸潤(rùn)和炎癥反應(yīng)，表明鐵死亡是NASH發(fā)病的觸發(fā)因素。

6 鐵死亡的研究方法和技術(shù)手段

鐵死亡尚無(wú)法通過(guò)明確的特異性標(biāo)志物直接證明，只能利用輔助證據(jù)證明其發(fā)生。例如細(xì)胞水平檢測(cè)細(xì)胞活性、Iron Assay Kit(試劑盒)檢測(cè)細(xì)胞、組織中的鐵水平；ROS以及ROS的產(chǎn)物(4-HNE等)；分子水平檢測(cè)與鐵死亡相關(guān)的蛋白表達(dá)如GPX4、ACSL4、COX2等；形態(tài)學(xué)使用電鏡觀察線粒體形態(tài)、線粒體脊、膜密度等；TMRE熒光染料檢測(cè)線粒體膜電位——TMRE能夠特異性標(biāo)記有活性的線粒體，是一種細(xì)胞膜可穿透性的，正電荷的，橘紅色熒光染料。當(dāng)線粒體膜電位降低時(shí)，熒光減弱。另外較為直接的證據(jù)是能夠被鐵死亡抑制劑抑制，鐵死亡抑制劑主要包括鐵螯合劑(去鐵胺、環(huán)吡酮胺等)、抗氧化劑(Ferrostatin-1、Trolox、丁羥甲苯等)。

7 展望

大量研究證實(shí)，鐵死亡參與NAFLD/NASH的進(jìn)展。然而，還有很多問(wèn)題需要進(jìn)一步闡明。鐵死亡的生理功能是什么？脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)是如何通過(guò)損傷細(xì)胞膜導(dǎo)致鐵死亡發(fā)生的？這些影響脂代謝調(diào)控的酶是必需的嗎？目前還缺乏像反映細(xì)胞凋亡(如caspases家族激活)、自噬(如自噬溶酶體形成)等類似指標(biāo)來(lái)直觀反映鐵死亡的特異性標(biāo)志物。為了更詳盡地了解鐵死亡的機(jī)制及找到更準(zhǔn)確地判斷鐵死亡檢測(cè)方法，未來(lái)還需要更多的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)來(lái)支持有關(guān)鐵死亡的相關(guān)研究。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：趙文霞負(fù)責(zé)擬定題目和文章框架：劉素彤負(fù)責(zé)撰寫(xiě)論文；張麗慧、顧亞嬌、尚東方、肖準(zhǔn)負(fù)責(zé)修改論文；劉鳴昊負(fù)責(zé)擬定寫(xiě)作思路，指導(dǎo)撰寫(xiě)文章并最后定稿。