吳永祥，王 玉，袁德現(xiàn)，張金鑫，儲(chǔ)雷鳴，王婷婷，姜 薇，孫漢巨，金聲瑯,*

（1.黃山學(xué)院生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，安徽 黃山 245041；2.黃山學(xué)院旅游學(xué)院，安徽 黃山 245041；3.合肥工業(yè)大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，安徽 合肥 230009）

臭鱖魚是我國(guó)黃山地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵食品，其歷史悠久、營(yíng)養(yǎng)豐富、風(fēng)味獨(dú)具[1]。臭鱖魚的加工方法以傳統(tǒng)自然發(fā)酵為主，即利用新鮮鱖魚內(nèi)在的微生物水解及酶類自溶，配以適量香辛料，在低鹽低溫條件下短期腌制發(fā)酵而成[2-3]。發(fā)酵后的臭鱖魚由于魚體蛋白質(zhì)發(fā)生水解，產(chǎn)生游離氨基酸、小分子肽、核苷酸等呈味物質(zhì)及醛、醇、酮等風(fēng)味物質(zhì)，賦予其“初聞?dòng)挟愇叮钚崞嫦?，肉質(zhì)白嫩如蒜瓣，入口潤(rùn)滑，生津吐香”的獨(dú)特風(fēng)味與口感[4-6]。其現(xiàn)已成為市場(chǎng)高銷量產(chǎn)品，2019年單品銷售額高達(dá)30億 元，其生產(chǎn)量和銷售量逐年遞增[7]。目前，臭鱖魚在加工過(guò)程中采取腌制發(fā)酵完成后直接冷藏，其體內(nèi)微生物未被殺滅，當(dāng)貯藏環(huán)境回到適宜溫度，微生物仍會(huì)繼續(xù)發(fā)酵，產(chǎn)生不愉快臭味，并導(dǎo)致腐敗等問(wèn)題，使其品質(zhì)下降，保質(zhì)期縮短，嚴(yán)重制約了臭鱖魚產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[8-9]。

熱處理是食品加工過(guò)程中的常用方法，此法雖能有效殺滅微生物，延長(zhǎng)保質(zhì)期，但對(duì)產(chǎn)品色澤、感官品質(zhì)與風(fēng)味物質(zhì)等易產(chǎn)生不良影響，也會(huì)降低營(yíng)養(yǎng)及食用價(jià)值[10]。因此，研究臭鱖魚非熱殺菌、菌群結(jié)構(gòu)變化與品質(zhì)間的關(guān)系是臭鱖魚加工產(chǎn)業(yè)提升的重要基礎(chǔ)。超高壓（ultra high pressure，UHP）技術(shù)是一種新型的食品非熱殺菌技術(shù)，其將食品密封包裝于含有水或其他介質(zhì)的密封容器中，在100 MPa以上的靜壓力下保持一段時(shí)間，起到殺菌鈍酶的效果，從而有效改善食品品質(zhì)與延長(zhǎng)貨架期[11-12]。與傳統(tǒng)的熱處理相比，超高壓在適當(dāng)壓力與保壓時(shí)間下能更好地保持食品原有的感官品質(zhì)與風(fēng)味[13]。Hughes[14]與郭麗萍[15]等研究發(fā)現(xiàn)，300 MPa超高壓處理10 min，能很好地保持鮑魚和鱸魚理化與感官品質(zhì)。Lingham等[16]研究發(fā)現(xiàn)，牡蠣在450 MPa和500 MPa的超高壓處理下，需氧細(xì)菌和耐冷細(xì)菌的總數(shù)顯著下降，脂質(zhì)氧化延緩，其貨架期得到有效延長(zhǎng)。這些研究為超高壓技術(shù)在水產(chǎn)品加工中的應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)。目前，國(guó)內(nèi)對(duì)臭鱖魚的研究主要集中在臭鱖魚發(fā)酵過(guò)程中營(yíng)養(yǎng)成分、質(zhì)構(gòu)特性與揮發(fā)性成分的動(dòng)態(tài)變化[5,17-18]，而有關(guān)超高壓處理對(duì)臭鱖魚微生物多樣性和品質(zhì)的影響鮮有報(bào)道?；诖?，本實(shí)驗(yàn)以超高壓處理前后的臭鱖魚為研究對(duì)象，通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)解析臭鱖魚細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成，研究超高壓處理對(duì)臭鱖魚的色澤、持水性、體積皺縮比與感官品質(zhì)的影響，并開展微觀組織結(jié)構(gòu)觀察，同時(shí)結(jié)合傅里葉變換紅外光譜分析臭鱖魚魚肉蛋白的結(jié)構(gòu)變化，旨在為超高壓技術(shù)在臭鱖魚加工中的應(yīng)用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

發(fā)酵后臭鱖魚由黃山市胡興堂桃花流水食品有限公司提供，樣品體態(tài)均勻，質(zhì)量為（500±50）g。

細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒 美國(guó)Omega公司；DNA凝膠回收試劑盒 天根生化科技（北京）有限公司；所有提取用無(wú)機(jī)、有機(jī)溶劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

MiSeq高通量測(cè)序平臺(tái) 美國(guó)Illumina公司；CR-10 plus色差儀 日本柯尼卡美能達(dá)公司；S-3400N掃描電子顯微鏡 日本日立公司；GY-4數(shù)顯式硬度計(jì)北京金科利達(dá)電子科技有限公司；Nicolet 380傅里葉變換紅外光譜儀 美國(guó)Thermo Fisher公司；F-C200/1000-600立式食品冷等靜壓機(jī) 四川佰瑞隆機(jī)械設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 臭鱖魚加工的主要工藝

以新鮮鱖魚為原材料，宰殺后去除內(nèi)臟、魚鱗和鰓，洗凈后將其整齊碼放至專用腌制桶內(nèi)。采用傳統(tǒng)水腌發(fā)酵法：向腌制桶內(nèi)加入提前配制好的質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%的食鹽水和一定量的花椒，在上層魚體上放置按壓板，按壓板上加砝碼（按壓質(zhì)量為魚質(zhì)量的80%），以將魚體全部浸于腌制液液面以下，并于12 ℃發(fā)酵9 d。發(fā)酵成熟的臭鱖魚經(jīng)真空包裝后于－18 ℃保存，備用。

1.3.2 發(fā)酵后臭鱖魚的超高壓處理

將發(fā)酵后的臭鱖魚逐條裝入超高壓專用塑料袋中，抽真空并封口，放入超高壓加壓艙內(nèi)。依據(jù)Hughes[14]和Lingham[16]等的研究結(jié)論，并綜合參考感官品質(zhì)和菌落總數(shù)等指標(biāo)，設(shè)定加壓壓力分別為300 MPa和500 MPa，保壓時(shí)間均為10 min。超高壓設(shè)備所采用的溫度為室溫，傳壓介質(zhì)為水。達(dá)到設(shè)定的保壓時(shí)間后，在3 s內(nèi)卸壓。以未超高壓處理的發(fā)酵后臭鱖魚為對(duì)照組。

1.3.3 菌落總數(shù)的測(cè)定

菌落總數(shù)的測(cè)定按照GB 4789.2—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測(cè)定》來(lái)執(zhí)行。

1.3.4 DNA提取和擴(kuò)增

隨機(jī)選取不同處理組樣品的不同部位魚肉組織在無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)剪取，各自隨機(jī)混合。稱取魚肉20 g，采用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒對(duì)樣品中的細(xì)菌DNA進(jìn)行提取。由1.0%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同）的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)提取效果，并置于－20 ℃保存?zhèn)溆肹19]。

采用338F（5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’）和806R（5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’）為引物擴(kuò)增細(xì)菌的16S rDNA V3～V4區(qū)序列[20]。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行2.0%瓊脂糖凝膠電泳，并使用瓊脂糖DNA回收試劑盒對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行切膠回收。

1.3.5 高通量測(cè)序

在低溫條件下，將PCR產(chǎn)物送至上海美吉生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。根據(jù)Illumina MiSeq平臺(tái)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程構(gòu)建PE 2×300 bp的文庫(kù)。文庫(kù)合格后，利用Illumina MiSeq平臺(tái)分別對(duì)未經(jīng)超高壓處理和超高壓處理的臭鱖魚進(jìn)行細(xì)菌基因序列的高通量測(cè)序。

1.3.6 品質(zhì)指標(biāo)的測(cè)定

1.3.6.1 色澤

測(cè)定前撥開臭鱖魚魚肉表皮，暴露出肌肉。利用便攜式色差儀，分別在對(duì)照組、不同超高壓處理組的臭鱖魚肌肉處隨機(jī)選取3個(gè)點(diǎn)測(cè)定，并記錄L*（亮度）、a*（紅綠度）、b*（黃藍(lán)度）值，計(jì)算其平均值。白度按照公式（1）計(jì)算。

1.3.6.2 持水性

參考楊文鴿等[21]的方法進(jìn)行持水性測(cè)定。將臭鱖魚魚肉切成5 mm厚的片狀，稱量（記為m1/g）并保證質(zhì)量相同，置于雙層濾紙之間，向其施加質(zhì)量5 kg的砝碼，并保持2 min，再次稱量樣品質(zhì)量（記為m2/g），重復(fù)3次，取平均值。持水性以壓出的水分質(zhì)量進(jìn)行計(jì)算，如式（2）所示。

1.3.6.3 體積皺縮比

參考Wang Yuchuan等[22]的方法進(jìn)行體積皺縮比測(cè)定。分別取5 g樣品，投入量筒中通過(guò)排水法測(cè)量體積，各樣品重復(fù)3次，再取平均值，按式（3）計(jì)算體積皺縮比。

式中：V1表示不同超高壓處理組臭鱖魚的體積/mL；V2表示對(duì)照組臭鱖魚的體積/mL。

1.3.6.4 微觀組織觀察

將臭鱖魚魚肉用刀片切成3 mm×3 mm×1.5 mm薄片，冷凍干燥后將各組樣品薄片分別固定在樣品托上，離子濺射儀噴金后，于300 倍條件下觀察，加速電壓為15.0 kV。

1.3.6.5 傅里葉變換紅外光譜測(cè)定

參考文獻(xiàn)[23-24]，分別提取各組樣品魚肉的肌原纖維蛋白。取真空干燥后的肌原纖維蛋白粉末與溴化鉀混合研磨并壓片，于恒溫箱內(nèi)平衡5 min。利用傅里葉變化紅外光譜儀進(jìn)行掃描，范圍4 000～400 cm－1，分辨率4 cm－1，采集紅外光譜圖。

1.3.7 感官分析

由8名經(jīng)過(guò)專業(yè)訓(xùn)練的人員組成感官評(píng)定小組。分別選取各組魚肉樣品進(jìn)行熟制烹飪，盛放在相同的容器中編碼，通過(guò)色澤、氣味、口感、組織狀態(tài)與接受程度5個(gè)指標(biāo)進(jìn)行評(píng)定[25-26]。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如表1所示。

表1 臭鱖魚的感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Criteria for sensory evaluation of stinky mandarin fish

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Origin 8.5軟件作圖。數(shù)據(jù)間的差異顯著性運(yùn)用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件中的Duncan’s多重比較法進(jìn)行方差分析，P＜0.05表示顯著性差異。結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 超高壓處理對(duì)臭鱖魚微生物指標(biāo)的影響

超高壓處理前后臭鱖魚中菌落總數(shù)變化的結(jié)果見(jiàn)表2。與未經(jīng)超高壓對(duì)照組相比，臭鱖魚經(jīng)超高壓300、500 MPa處理后，菌落總數(shù)由（6.37±0.04）（lg（CFU/g））分別降低至（5.85±0.06）（lg（CFU/g））和（3.87±0.10）（lg（CFU/g））。結(jié)果表明，隨著超高壓壓力的增大，臭鱖魚菌落總數(shù)顯著降低（P＜0.05），殺菌效果顯著增強(qiáng)，500 MPa處理后臭鱖魚的菌落總數(shù)達(dá)到最低值，滅菌率高達(dá)99.68%。大量研究表明，超高壓處理能有效破壞微生物的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致細(xì)胞滲透與細(xì)胞結(jié)構(gòu)損壞，起到殺死或鈍化細(xì)菌活性的作用[10,12,16]。

表2 超高壓處理前后臭鱖魚中菌落總數(shù)的變化Table 2 Change in total viable count of stinky mandarin fish before and after UHP treatment

2.2 超高壓處理前后臭鱖魚的細(xì)菌Alpha多樣性分析結(jié)果

超高壓處理前后臭鱖魚細(xì)菌菌群測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果見(jiàn)表3。各組樣品的微生物覆蓋率均大于99.90%，說(shuō)明樣本中序列基本完全被測(cè)出，測(cè)序結(jié)果代表了樣本中微生物的真實(shí)情況，可用于樣品細(xì)菌多樣性分析。Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)可用于反映微生物群落的豐度[27]。超高壓處理前后臭鱖魚樣品的細(xì)菌豐度差異較明顯，500 MPa超高壓處理組的微生物豐度最低，其Chao1和ACE指數(shù)分別為49.33和47.16。Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)是反映微生物多樣性的指數(shù)，相比于對(duì)照組，超高壓處理后的臭鱖魚細(xì)菌群落多樣性明顯降低，說(shuō)明超高壓處理對(duì)部分微生物生長(zhǎng)起到了抑制作用。

表3 超高壓處理前后臭鱖魚中細(xì)菌Alpha多樣性分析Table 3 Alpha diversity index of bacterial community in stinky mandarin fish before and after UHP treatment

2.3 超高壓處理前后臭鱖魚的菌群結(jié)構(gòu)組成分析結(jié)果

從微生物分類門的水平上來(lái)看，對(duì)照組、300 MPa超高壓處理組和500 MPa超高壓處理組臭鱖魚樣品中分別含有5、4、4個(gè)門水平的細(xì)菌，主要包括變形菌門（Proteobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、Epsilonbacteraeota和梭桿菌門（Fusobacteria）等（圖1）。超高壓處理前后臭鱖魚中細(xì)菌群落組成基本相同，差異較大的是相對(duì)豐度。說(shuō)明超高壓處理改變了臭鱖魚菌群結(jié)構(gòu)，尤其對(duì)變形菌門生長(zhǎng)的抑制效果最為顯著，其相對(duì)豐度明顯降低。而厚壁菌門在超高壓處理后的相對(duì)豐度有所增加，這可能與臭鱖魚中厚壁菌門的基數(shù)不同以及厚壁菌門中乳桿菌和乳球菌大多為厭氧細(xì)菌，能夠在冷藏過(guò)程中的無(wú)氧環(huán)境下生長(zhǎng)有關(guān)[28]。由圖2可知，在屬水平上，對(duì)照組、超高壓處理組（300 MPa）和超高壓處理組（500 MPa）臭鱖魚的樣品中分別含有16、15、12種細(xì)菌。與臭鱖魚對(duì)照組相比，超高壓處理后臭鱖魚中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成發(fā)生了明顯變化，且隨著超高壓壓力的增大，臭鱖魚中細(xì)菌多樣性降低。500 MPa超高壓處理后臭鱖魚中主要菌群為漫游球菌屬（Vagococcus）和冷桿菌屬（Psychrobacter），其相對(duì)豐度分別為45.90%和44.86%。這與趙宏強(qiáng)等[29]通過(guò)高通量測(cè)序法研究超高壓處理對(duì)冷藏鱸魚片細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)影響的結(jié)果一致，漫游球菌屬和冷桿菌屬為超高壓處理后的主要優(yōu)勢(shì)菌屬。臭鱖魚對(duì)照組中Hafnia-Obesumbacterum、Proteus、Morganella、Kurthia、Myroides的相對(duì)豐度分別為2.85%、2.85%、3.57%、1.37%、1.81%；經(jīng)500 MPa超高壓處理后，其相對(duì)豐度明顯降低，前3種微生物分別降至0.06%、0.02%、0.01%，而后兩種微生物未被檢出，表明隨著超高壓壓力的增大，臭鱖魚中部分微生物的數(shù)量呈減少的趨勢(shì)。同時(shí)，本研究從超高壓處理前后的臭鱖魚中均檢測(cè)出乳桿菌屬（Lactobacillus）。大量研究表明，乳酸菌為臭鱖魚特殊風(fēng)味物質(zhì)形成的主要貢獻(xiàn)微生物，且能抑制臭鱖魚儲(chǔ)藏后期總揮發(fā)性鹽基氮、硫代巴比妥酸反應(yīng)物和生物胺的積累[9,30-31]。綜上，超高壓處理對(duì)臭鱖魚菌群結(jié)構(gòu)組成影響顯著。

圖1 門水平上的臭鱖魚細(xì)菌豐度分析Fig. 1 Relative abundance of bacteria in stinky mandarin fish at the phylum level

圖2 屬水平上的臭鱖魚細(xì)菌豐度分析Fig. 2 Relative abundance of bacteria in stinky mandarin fish at the genus level

2.4 超高壓處理對(duì)臭鱖魚魚肉色澤的影響

色澤是臭鱖魚重要的感官屬性，影響著產(chǎn)品的品質(zhì)。由表4可知，超高壓處理對(duì)臭鱖魚魚肉L*值和白度的影響顯著。與未經(jīng)超高壓對(duì)照組相比，臭鱖魚經(jīng)300、500 MPa超高壓處理后，白度由26.20±3.75分別顯著增加至31.47±1.32、36.44±1.00（P＜0.05），表明超高壓處理后的臭鱖魚變得更加白皙，且超高壓壓力越大，其白度增加幅度越大。經(jīng)超高壓處理后臭鱖魚魚肉的a*值和b*值相比對(duì)照組有所減小（P＞0.05）。郭麗萍[15]和Erkan[32]等的研究也表明，鱸魚和鯛魚的L*值和白度隨著壓力增加而增大，這與魚肉中類胡蘿卜素和血紅色素（即肌紅蛋白和血紅蛋白）在不同超高壓壓力條件下的變化有關(guān)。

表4 超高壓處理對(duì)臭鱖魚魚肉色澤的影響Table 4 Effect of UHP treatment on color parameters of stinky mandarin fish

2.5 超高壓處理對(duì)臭鱖魚魚肉持水性和體積皺縮比的影響

持水性為樣品束縛自身或外加水分的能力，持水性越大，表示樣品的保水性越好。由圖3可知，300 MPa和500 MPa超高壓處理組臭鱖魚樣品的持水性均顯著低于對(duì)照組（P＜0.05），且隨著超高壓壓力的增大，其持水性下降幅度逐漸明顯。這可能是發(fā)酵后臭鱖魚肌肉組織均勻，肌原纖維排列緊密，而超高壓處理能使臭鱖魚肌原纖維和部分蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，導(dǎo)致持水性的下降，趙宏強(qiáng)[33]和Lakshmanan[34]等利用超高壓處理魚肉后持水性變化結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

圖3 超高壓處理對(duì)臭鱖魚持水性和體積皺縮比的影響Fig. 3 Effect of UHP treatment on water-holding capacity and shrinkage rate of stinky mandarin fish

體積皺縮比反映臭鱖魚超高壓處理前后體積的變化程度，是重要的質(zhì)構(gòu)特性參數(shù)。體積皺縮比越接近于100%，表明樣品體積外形變化越小。如圖3所示，與未經(jīng)超高壓處理的對(duì)照組相比，臭鱖魚經(jīng)300、500 MPa超高壓處理后，體積皺縮比分別降低至（95.73±0.01）%、（92.68±0.02）%（P＜0.05）。隨著超高壓壓力的增大，臭鱖魚體積皺縮比的下降幅度逐漸明顯，這可能是超高壓處理促進(jìn)魚肉中分子間二硫鍵的形成，肌球蛋白分子發(fā)生聚集變性，導(dǎo)致魚肉皺縮及體積的減少[33]。

2.6 超高壓處理對(duì)臭鱖魚魚肉微觀組織結(jié)構(gòu)的影響

對(duì)不同超高壓壓力處理臭鱖魚魚肉的微觀組織結(jié)構(gòu)進(jìn)行掃描電子顯微鏡觀察，結(jié)果如圖4所示。與對(duì)照組相比，超高壓處理后臭鱖魚魚肉的組織結(jié)構(gòu)明顯不同。臭鱖魚對(duì)照組魚肉結(jié)構(gòu)較為疏松，肌纖維紋理較為清晰，呈較為完整、有序的排列。經(jīng)超高壓處理后臭鱖魚魚肉的肌纖維紋理變得模糊，表面肌纖維結(jié)構(gòu)緊致無(wú)序。隨著超高壓壓力的增大，肌纖維的肌節(jié)被完全破壞，肌纖維的輪廓變得更加模糊，組織結(jié)構(gòu)結(jié)合得更加緊密。馬海建等[35]也曾報(bào)道，超高壓壓力能破壞魚肉的肌原纖維，使蛋白質(zhì)的三級(jí)、四級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變而變性，蛋白質(zhì)分子間交聯(lián)，出現(xiàn)膠凝化。超高壓處理后臭鱖魚魚肉微觀組織結(jié)構(gòu)發(fā)生的顯著改變，從而影響了魚肉的持水性、體積皺縮比、硬度等質(zhì)構(gòu)特性。

圖4 超高壓處理對(duì)臭鱖魚魚肉微觀組織結(jié)構(gòu)的影響（×300）Fig. 4 Effect of UHP treatment on microstructure of stinky mandarin fish (× 300)

2.7 超高壓處理對(duì)臭鱖魚感官品質(zhì)的影響

感官評(píng)定是根據(jù)評(píng)定小組成員通過(guò)視覺(jué)、嗅覺(jué)、味覺(jué)及整體接受度對(duì)臭鱖魚進(jìn)行的綜合評(píng)價(jià)，結(jié)果見(jiàn)表5。與對(duì)照組相比，500 MPa超高壓處理對(duì)臭鱖魚的口感和組織狀態(tài)影響顯著，魚肉變得緊實(shí)而無(wú)彈性，骨肉不分離，無(wú)蒜瓣?duì)?，口感變差，接受程度差。超高壓處理?duì)臭鱖魚色澤與氣味也有一定的影響，但不明顯。300 MPa超高壓處理后的臭鱖魚感官接受度較好，肉質(zhì)白皙且有光澤，具有魚肉發(fā)酵后的特殊臭味，魚肉較緊致但有一定彈性，肉質(zhì)塊形較整齊，骨肉分離，蒜瓣?duì)钶^明顯。綜上，300 MPa超高壓處理后的臭鱖魚感官品質(zhì)較好。

表5 超高壓處理前后臭鱖魚的感官品質(zhì)分析Table 5 Sensory quality analysis of stinky mandarin fish before and after UHP treatment

2.8 超高壓處理前后臭鱖魚魚肉蛋白的傅里葉變換紅外光譜分析結(jié)果

紅外光譜可以顯示樣品中不同化合物的譜帶位置、數(shù)目、強(qiáng)度等信息，能定性分析該樣品官能團(tuán)的變化，進(jìn)而分析其結(jié)構(gòu)的變化。波數(shù)在1 700～1 600 cm－1為酰胺I帶，其伸縮振動(dòng)以C=O為主，常被用來(lái)分析蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化[36]。由圖5可知，與未經(jīng)超高壓的對(duì)照組相比，經(jīng)超高壓處理后的紅外光譜圖未出現(xiàn)新的吸收峰，但在1 638 cm－1處的酰胺I帶峰強(qiáng)度發(fā)生了變化。1 638 cm－1處酰胺I帶譜峰反映的是蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)中的β-折疊，說(shuō)明超高壓處理后臭鱖魚魚肉蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)中的β-折疊含量發(fā)生了變化。

圖5 超高壓處理前后臭鱖魚魚肉蛋白的傅里葉變換紅外光譜Fig. 5 Fourier transform infrared spectra of proteins in stinky mandarin fish before and after UHP treatment

采用適當(dāng)擬合、分峰和峰面積計(jì)算，通過(guò)分析1 700～1 600 cm－1處的酰胺I帶，可比較超高壓處理前后臭鱖魚蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋、β-折疊、無(wú)規(guī)卷曲和β-轉(zhuǎn)角含量的變化[37]。由圖6可知，與對(duì)照組相比，超高壓處理后臭鱖魚蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)中的α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角相對(duì)含量減少，無(wú)規(guī)卷曲和β-折疊相對(duì)含量增加，證明超高壓處理破壞了蛋白質(zhì)分子的有序結(jié)構(gòu)，呈現(xiàn)出無(wú)序結(jié)構(gòu)狀態(tài)。閆春子等[23]分析了超高壓對(duì)草魚肌原纖維蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響，結(jié)果表明α-螺旋含量不斷減少，無(wú)規(guī)卷曲和β-折疊含量相應(yīng)增加。本研究結(jié)果也證明了這點(diǎn)。綜上，超高壓處理可以使肌原纖維蛋白的α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角轉(zhuǎn)變?yōu)闊o(wú)規(guī)卷曲和β-折疊，臭鱖魚蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，從而影響臭鱖魚的質(zhì)構(gòu)特性及品質(zhì)。

圖6 超高壓處理前后臭鱖魚蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)相對(duì)含量的變化Fig. 6 Changes in secondary structure content of proteins in stinky mandarin fish before and after UHP treatment

3 結(jié) 論

本研究通過(guò)分析超高壓處理前后臭鱖魚中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的變化，發(fā)現(xiàn)超高壓處理對(duì)臭鱖魚中細(xì)菌豐富度和多樣性產(chǎn)生了顯著影響，雖然臭鱖魚中細(xì)菌多樣性降低，部分微生物被殺滅，但漫游球菌屬和冷桿菌屬仍為超高壓處理后的主要優(yōu)勢(shì)腐敗菌。說(shuō)明超高壓低溫殺菌存在一定的局限性，下一步研究將通過(guò)輔助添加天然植物抑菌劑等手段來(lái)協(xié)同殺滅或抑制微生物的生長(zhǎng)繁殖。超高壓處理對(duì)臭鱖魚品質(zhì)變化影響顯著，以300 MPa處理10 min的臭鱖魚質(zhì)構(gòu)特性與感官品質(zhì)較好。本研究結(jié)果為今后臭鱖魚質(zhì)量安全監(jiān)控及靶向研究臭鱖魚的殺菌與品質(zhì)保持關(guān)鍵技術(shù)提供了理論依據(jù)。