劉韞滔，李林鍵，李 誠(chéng)，李 琴，曾 珍，劉愛平，李小林，唐自鐘，紀(jì)昌聯(lián)

（1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，四川 雅安 625014；2.四川省食用菌研究所，四川 成都 610066；3.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，四川 雅安 625014；4.成都雅樂鮮生物科技有限公司，四川 成都 610400）

硒（Se）是人體所必需的一種微量元素，按化學(xué)形態(tài)主要分為無(wú)機(jī)硒和有機(jī)硒，無(wú)機(jī)硒主要指硒酸鈉、亞硒酸鈉和二氧化硒，而有機(jī)硒一般以硒蛋白和硒氨基酸等形式存在[1]。大量研究發(fā)現(xiàn)硒元素具有抗氧化、降血糖、抗癌、抑菌等多種生物活性[2-3]，若機(jī)體缺硒則會(huì)引發(fā)大骨節(jié)病、心血管疾病和癌癥等多種疾病[4]，所以合理地補(bǔ)充硒元素可以增強(qiáng)人體免疫力，從而有效預(yù)防甚至治療這些疾病。但是由于硒元素的推薦攝入量與可耐受最高攝入量非常接近，極易導(dǎo)致硒中毒，從而限制了其在膳食補(bǔ)充劑中的進(jìn)一步應(yīng)用。因此，研究開發(fā)高效低毒的富硒制劑意義重大。

硒多糖是一類由硒和多糖共價(jià)結(jié)合而形成的功能性多糖，與無(wú)機(jī)硒相比，硒多糖具有毒性低、副作用小、生物利用度高等優(yōu)點(diǎn)[5]，更易被機(jī)體吸收利用。有研究報(bào)道，通過(guò)亞硒酸酯化修飾獲得的硒多糖[6-8]不但保留了多糖的基本結(jié)構(gòu)和生物功能，而且使其更容易被吸收利用，提高了硒元素的生物利用度，從而表現(xiàn)出比硒元素和多糖本身更高的抗氧化、降血糖和免疫調(diào)節(jié)活性。例如，F(xiàn)eng Haibo等[9]制備的川明參硒化多糖可以促進(jìn)脾細(xì)胞增殖，增加T淋巴細(xì)胞的活性，顯著提高免疫活性。納米硒是一種紅色膠體狀態(tài)的單質(zhì)硒，與硒酸鹽和亞硒酸鹽化合物相比，納米硒具有更高的生物活性、安全性以及生物相容性，納米硒的功能活性通常具有尺寸效應(yīng)，即粒徑越小，活性越高。但是化學(xué)合成的納米硒并不穩(wěn)定，在水溶液中極易發(fā)生聚集或轉(zhuǎn)化為其他不活躍的形式，從而影響其生物活性[10-13]。因此，為提高納米硒的穩(wěn)定性，近年來(lái)，多種多糖已被廣泛用于修飾還原反應(yīng)中最初形成的納米硒粒子。

牛肝菌是牛肝菌科的大型野生藥食兩用真菌，其肉質(zhì)肥美、營(yíng)養(yǎng)豐富，被譽(yù)為“四大名菌”之一，含有多糖、多酚等活性物質(zhì)，具有較好的抗氧化功能。主要分為白、紅、黃、黑牛肝菌和美味牛肝菌[14-15]。其中黃牛肝菌（Suillellus luridus）主要分布在我國(guó)云南和四川兩省，不僅富含蛋白質(zhì)、碳水化合物、礦物質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，同時(shí)含有多種活性成分。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，黃牛肝菌傘多糖（polysaccharides fromSuillellus luridus，SLPC）表現(xiàn)出較好的抗氧化、抗糖尿病等生理活性[16]。如果能將具有強(qiáng)抗氧化活性的SLPC與硒元素結(jié)合，很可能會(huì)顯著提高多糖和硒單獨(dú)表現(xiàn)出來(lái)的生物活性。然而目前鮮見關(guān)于這方面的研究報(bào)道，因此一方面可以通過(guò)亞硒酸酯化修飾SLPC制備硒多糖，降低硒的毒性和副作用，提高多糖的生物活性；另一方面SLPC也可作為分散劑，對(duì)納米硒進(jìn)行表面修飾，制備納米硒-多糖復(fù)合物，提高硒納米粒子穩(wěn)定性的同時(shí)增加其生物活性，從而為富硒產(chǎn)品的開發(fā)提供新思路。

本研究以SLPC為原料，采用HNO3-Na2SeO3法進(jìn)行亞硒酸酯化修飾制備硒化多糖（selenide polysaccharides fromSuillellus luridus，Se-SLPC），利用高效液相色譜、傅里葉變換紅外光譜、核磁共振等對(duì)Se-SLPC的理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)特性進(jìn)行表征；以SLPC為分散劑，以VC還原亞硒酸鈉制備納米硒-多糖復(fù)合物（nano-seleniumpolysaccharides fromSuillellus luridus，SLPC-SeNPs），通過(guò)納米粒度儀和透射電子顯微鏡對(duì)SLPC-SeNPs的粒徑和表面形貌進(jìn)行表征。此外，評(píng)價(jià)Se-SLPC和SLPCSeNPs的體外抗氧化活性，探討多糖結(jié)構(gòu)和生物活性之間的構(gòu)效關(guān)系，旨在為黃牛肝菌資源開發(fā)提供理論參考，也為研發(fā)安全高效的補(bǔ)硒制劑提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃牛肝菌子實(shí)體采自于四川省。選取黃色（包括褐黃色、橘黃色、暗黃色等）、傘形完整無(wú)外傷的菌株，加冰袋運(yùn)至四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院。

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、鄰苯三酚（分析純） 上海泰坦科技股份有限公司；2,2’-聯(lián)氮-雙-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)（2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS） 生工生物工程（上海）股份有限公司；亞硒酸鈉（分析純） 山東西亞化學(xué)工業(yè)有限公司；抗壞血酸（分析純） 上海?？瞪锛夹g(shù)有限公司；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

NICOLET IS10傅里葉變換紅外光譜儀 美國(guó)賽默飛儀器有限公司；Nano-Zs90納米粒度儀 英國(guó)Malvern公司；Libra 200FE透射電子顯微鏡 德國(guó)卡爾蔡司股份公司；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 河南予華儀器有限公司；DSA100-GL1超聲波清洗機(jī) 福州德森精工有限公司；AB1104-N電子分析天平、DELTA320 pH計(jì)瑞士Mettler Toledo公司；400 MHz型核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）儀 德國(guó)Bruker公司。

1.3 方法

1.3.1 黃牛肝菌傘多糖的分離純化

根據(jù)本課題組前期報(bào)道的方法[17]分離純化得到SLPC。

1.3.2 亞硒酸酯化多糖的制備

參考Liu Yuntao等[18]的方法，稱取200 mg SLPC置于300 mL三頸燒瓶中，加入100 mL體積分?jǐn)?shù)0.5%的HNO3溶液，磁力攪拌15 min使多糖完全溶解。加入200 mg亞硒酸鈉，再加入1.00 g BaCl2，70 ℃磁力攪拌7 h后冷卻至室溫。用飽和Na2CO3溶液調(diào)節(jié)該反應(yīng)液pH值至6.0后，加入10.0 mL 1.0 mol/L的Na2SO4溶液，振蕩均勻后離心（3 000 r/min、10 min）去沉淀，上清液透析（截留分子質(zhì)量1 kDa）后減壓濃縮，加入3 倍體積無(wú)水乙醇充分沉淀，離心（3 000 r/min、10 min）取沉淀冷凍干燥后即得Se-SLPC。

1.3.3 納米硒多糖的制備

參考Liu Yuntao等[12]的方法，將5 mL SLPC溶液（1.0 mg/mL）與5.0 mL 0.01 mol/L亞硒酸鈉在25 ℃下磁力攪拌混合均勻，超聲（80 W、40 kHz）處理60 min。然后，將5.0 mL現(xiàn)配的抗壞血酸溶液（0.04 mol/L）緩慢加入到上述混合物中，用NaOH和CH3COOH調(diào)節(jié)反應(yīng)體系的pH值至7.0，待反應(yīng)2 h后即得到SLPC-SeNPs復(fù)合體。利用納米粒度儀測(cè)定剛制備的SLPC-SeNPs復(fù)合體的粒徑。同時(shí)用等體積的超純水代替SLPC溶液，以相同方法制備無(wú)SLPC作分散劑的SeNPs作為對(duì)照。

1.3.4 含硒量的測(cè)定

硒化多糖的含硒量由電感耦合等離子體質(zhì)譜分析測(cè)定。儀器工作參數(shù)：入射功率1 100 W、等離子體氣流量15 L/min、載氣流量1.06 L/min、輔助氣體流量1.2 L/min、氦氣流量0.5 mL/min、霧化室溫度為2 ℃、采樣深度2.5 mm、采樣速率0.5 L/min。

1.3.5 分子質(zhì)量測(cè)定

樣品分子質(zhì)量由高效液相凝膠滲透色譜分析測(cè)定。色譜條件：TSK Gel G 5000 PWxl色譜柱（7.8 mm×30 cm），2410型示差折光檢測(cè)器，以超純水作為流動(dòng)相，流速為0.8 mL/min，柱溫為30 ℃，進(jìn)樣量為10 μL。

取不同分子質(zhì)量的葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品2 mg溶于1 mL超純水中，振蕩混勻，按照上述儀器條件進(jìn)行測(cè)定，以保留時(shí)間為橫坐標(biāo)，lgmw為縱坐標(biāo)，繪制葡聚糖分子質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)曲線。稱取2 mg硒多糖樣品按照上述操作步驟測(cè)定分析。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線和樣品的保留時(shí)間，得出樣品的分子質(zhì)量。

1.3.6 單糖組成測(cè)定

采用氣相色譜分析測(cè)定單糖組成，根據(jù)Liu Yuntao[19]和Gao Yingying[20]等的方法，采用糖腈乙酸酯衍生化法對(duì)水解產(chǎn)物進(jìn)行衍生化：稱取10.0 mg的Se-SLPC樣品溶于2.0 mL 2 mol/L三氟乙酸中，110 ℃水解2 h后除去剩余的三氟乙酸，樣品進(jìn)行真空干燥后加入具塞試管內(nèi)，加入10.0 mg鹽酸羥胺和0.5 mL吡啶，置于90 ℃烘箱內(nèi)加熱30 min后，冷卻至室溫，加入0.5 mL乙酸酐，90 ℃反應(yīng)30 min，所得產(chǎn)物進(jìn)行氣相色譜分析。氣相色譜條件：PEG-20M毛細(xì)管柱（30 m×0.53 mm），檢測(cè)器為火焰離子化檢測(cè)器；升溫程序?yàn)槌跏紲囟?50 ℃保持3 min，以3 ℃/min的升溫速率升至240 ℃，保持20 min，氮?dú)饬髁?0 mL/min、氫氣流量30 mL/min、空氣流量400 mL/min。以葡萄糖、半乳糖、海藻糖、吡喃木糖、阿拉伯糖和甘露糖為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)保留時(shí)間和峰面積確定單糖種類和各單糖的相對(duì)含量。

1.3.7 傅里葉變換紅外光譜分析

Se-SLPC的紅外光譜圖由傅里葉變換紅外光譜儀進(jìn)行測(cè)定，取1.0 mg樣品與溴化鉀粉末以質(zhì)量比1∶100混合，研磨均勻后壓片檢測(cè)，掃描波數(shù)范圍為4 000～400 cm－1。

1.3.8 核磁共振分析

取50.0 mg的Se-SLPC樣品用D2O溶解后凍干（重復(fù)3次），溶于1.0 mL D2O中加入核磁管中。采用400 MHz型NMR儀在室溫下分析1H NMR和13C NMR譜。

1.3.9 SLPC-SeNPs的表征

1.3.9.1 透射電子顯微鏡觀察

采用透射電子顯微鏡分別對(duì)SLPC-SeNPs和SeNPs的表面形貌進(jìn)行表征，放大倍數(shù)分別為20 000、40 000。

1.3.9.2 SLPC-SeNPs的穩(wěn)定性測(cè)定

采用馬爾文納米粒度儀的動(dòng)態(tài)光散射模式分別測(cè)定SLPC-SeNPs溶液在不同貯存時(shí)間（0、20、40、60、80、100、120 d）、溫度（4、25、37 ℃）和pH值（2、4、6、8、10、12）條件下的粒徑，根據(jù)粒徑變化探究SLPC-SeNPs的穩(wěn)定性。

1.3.10 體外抗氧化活性測(cè)定

1.3.10.1 DPPH自由基清除活性

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除率的測(cè)定根據(jù)Blois[21]的方法并略作修改，取不同質(zhì)量濃度多糖樣品及VC溶液各2.0 mL，分別加入2.0 mL 0.2 mmol/L DPPH-乙醇溶液，混合均勻后在室溫下避光靜置30 min，在517 nm波長(zhǎng)處測(cè)定樣品吸光度，以VC作為陽(yáng)性對(duì)照，按照公式（1）計(jì)算DPPH自由基清除率。

式中：A1為樣品+DPPH-乙醇溶液的吸光度；A2為樣品+無(wú)水乙醇的吸光度；A0為無(wú)水乙醇+DPPH-乙醇溶液的吸光度。

1.3.10.2 ABTS陽(yáng)離子自由基清除活性

ABTS陽(yáng)離子自由基清除率的測(cè)定根據(jù)的Cai Wenfei等[22]的方法并略作修改，取不同質(zhì)量濃度的多糖樣品溶液和VC溶液各1.0 mL，分別加入4.0 mL ABTS工作液，混合均勻后置于暗處反應(yīng)6 min，于734 nm波長(zhǎng)處測(cè)定樣品吸光度，以VC作為陽(yáng)性對(duì)照，以超純水代替多糖樣品溶液中的ABTS工作液作為空白樣品，按照公式（2）計(jì)算ABTS陽(yáng)離子自由基清除率。

式中：A為不含ATBS工作液樣品的吸光度；A0為空白樣品的吸光度；A1為含ATBS工作液樣品的吸光度。

1.3.10.3 O2－·清除活性

O2－·清除率測(cè)定參考Wu Yuntao等[23]的方法并稍作修改，取不同質(zhì)量濃度的多糖樣品溶液和VC溶液各1.0 mL，分別加入4.5 mL 10 mol/L Tris-HCl緩沖溶液（pH 8.2），在25 ℃水浴加熱20 min，然后加入0.2 mL 3 mmol/L鄰苯三酚溶液，混合均勻后在25 ℃水浴中加熱5 min，最后加入8.0 mmol/L HCl溶液終止反應(yīng)，于325 nm波長(zhǎng)處測(cè)定樣品吸光度，每隔30 s測(cè)一次，共測(cè)定5 min。繪制時(shí)間-吸光度曲線，斜率為鄰苯三酚的自氧化速率。以VC作為陽(yáng)性對(duì)照，按照公式（3）計(jì)算O2－·清除率。

式中：v為加入樣品后鄰苯三酚的氧化速率；v0為鄰苯三酚自氧化速率。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

所有實(shí)驗(yàn)做3次平行，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。用單因素方差分析（One-way analysis of variance，ANOVA）評(píng)估統(tǒng)計(jì)的顯著性，然后進(jìn)行Tukey檢驗(yàn)，P＜0.05被認(rèn)為具有顯著性差異。所有統(tǒng)計(jì)分析均使用SPSS 22.0軟件進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃牛肝菌子實(shí)體的形態(tài)學(xué)鑒定

通過(guò)查閱《中國(guó)真菌志》[24]，對(duì)樣品進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定。如圖1所示，子實(shí)體中等大，菌蓋直徑約5～14 cm，呈半球形，菌蓋邊緣起初微向下卷，后漸平展；菌蓋平滑，表面有短絨毛，以中央最為濃密，菌蓋呈黃褐色，蓋肉呈黃色，厚約1～3 cm，有菌香氣息，傷后變藍(lán)；菌柄呈棒狀，或直或微微彎曲，長(zhǎng)約6～15 cm，粗約1～3 cm，柄上部呈黃色，向下逐漸變深，基部呈暗黃色。

圖1 黃牛肝菌子實(shí)體Fig. 1 Fruiting body of Suillellus luridus

2.2 Se-SLPC的理化性質(zhì)

以SLPC為原料所制得硒化多糖Se-SLPC的含硒量為1.62 mg/g。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)分子質(zhì)量葡聚糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線可求得Se-SLPC的平均分子質(zhì)量為8.2 kDa，由半乳糖（51.30%）、葡萄糖（34.22%）和少量甘露糖（13.48%）組成，其中半乳糖含量最高。有研究表明，以半乳糖或甘露糖為骨架的多糖具有多種生理活性，如免疫調(diào)節(jié)作用、抗氧化作用、抗炎作用和抗腫瘤活性等[25]。與SLPC（mw=9.4 kDa）[17]相比，Se-SLPC的單糖組成發(fā)生了變化，減少的阿拉伯糖可能是因?yàn)槲揎椷^(guò)程中較強(qiáng)的酸性環(huán)境破壞了多糖的結(jié)構(gòu)，部分支鏈被降解成單糖或者寡糖，在后續(xù)透析的過(guò)程中被除去[26-27]，從而導(dǎo)致分子質(zhì)量降低，單糖組成減少。

2.3 Se-SLPC的結(jié)構(gòu)表征

2.3.1 傅里葉變換紅外光譜分析結(jié)果

傅里葉變換紅外光譜是分析多糖結(jié)構(gòu)的工具之一，通常用來(lái)判定糖環(huán)的類型和官能團(tuán)的類型。根據(jù)本課題組前期研究可知，SLPC由α-吡喃葡聚糖和β-吡喃葡聚糖組成[17]。一般來(lái)說(shuō)如果在605（Se=O）、760 cm－1（C—O—Se）和1 610 cm－1（O—Se—O）附近出現(xiàn)吸收峰，則說(shuō)明亞硒酸基團(tuán)在多糖上發(fā)生了取代反應(yīng)[18,28]。如圖2所示，Se-SLPC在619 cm－1處出現(xiàn)一個(gè)新的信號(hào)峰，該吸收峰是由Se—O—C伸縮振動(dòng)造成的[18]，表明SLPC被成功硒化，其他吸收峰均可以與SLPC的紅外圖譜一一對(duì)應(yīng)。

圖2 SLPC和Se-SLPC的紅外光譜Fig. 2 Infrared spectra of SLPC and Se-SLPC

2.3.2 NMR分析結(jié)果

NMR能夠提供非常詳細(xì)的多糖結(jié)構(gòu)信息，包括單糖組成、α或β-異頭物的構(gòu)型、糖鏈的構(gòu)成和序列及其構(gòu)成多糖的糖單元。根據(jù)本課題組前期研究可知，SLPC的主鏈為→6)-α-D-Galp-(1→3)-α-D-Galp-(1→3,6)-α-D-Galpα-D-Galp-(1→6)-β-D-Glcp-(1→3)-β-D-Glcp-(1→3)-α-DGalp-(1→，支鏈由1,3-β-D-Glcp、1,3-α-L-Arap和1,3-α-DManp組成[17]。如圖3所示，與SLPC相比，Se-SLPC在C4位（δ74.78）發(fā)生了較大的化學(xué)位移，一般來(lái)說(shuō)，發(fā)生取代位置所對(duì)應(yīng)碳原子的化學(xué)位移會(huì)向低場(chǎng)移動(dòng)[29-30]，因此推測(cè)亞硒酸基團(tuán)可能在(1→6)-β-D-Glcp的C4位發(fā)生了取代；在δ79.88處出現(xiàn)一個(gè)新的信號(hào)峰，該峰是C3向低場(chǎng)移動(dòng)而產(chǎn)生的，SLPC的主鏈糖苷鍵連接方式主要為1,3-糖苷鍵，因此可能在糖苷鍵連接位點(diǎn)C3處發(fā)生了取代反應(yīng)[29]。綜上所述，Se-SLPC在C4位和糖苷鍵連接位點(diǎn)C3發(fā)生非選擇性取代。

圖3 Se-SLPC的NMR譜圖Fig. 3 NMR spectra of Se-SLPC

2.4 SLPC-SeNPs的形貌表征結(jié)果

用透射電子顯微鏡分別觀察SLPC-SeNPs和SeNPs的表面形貌特征，結(jié)果如圖4所示。由圖4A1、A2可以看出，SLPC-SeNPs呈規(guī)則的球狀，且復(fù)合體分布較為均勻；而沒有添加SLPC穩(wěn)定分散的SeNPs出現(xiàn)明顯的團(tuán)聚現(xiàn)象，且納米顆粒大小很不均勻（圖4B1、B2），證明SLPC可以很好地防止SeNPs聚集，這主要是因?yàn)樵诙嗵堑姆肿咏Y(jié)構(gòu)中存在著許多對(duì)納米硒形成、穩(wěn)定和生長(zhǎng)有重要作用的氨基、羥基或羧基基團(tuán)[25]，這些基團(tuán)可以吸附和包裹納米硒粒子，從而阻止納米硒粒子的團(tuán)聚。例如以殼聚糖[12]、茶多糖[31]以及蓮藕渣多糖[32]為分散劑分別制備的硒納米粒子呈均勻分散的球形結(jié)構(gòu)，且粒徑均小于未經(jīng)表面修飾的SeNPs。

圖4 SLPC-SeNPs與SeNPs的表面形貌Fig. 4 Surface morphology of SLPC-SeNPs and SeNPs

2.5 SLPC-SeNPs的穩(wěn)定性

納米粒子的粒徑及其穩(wěn)定性是衡量其生物活性和實(shí)際應(yīng)用的關(guān)鍵指標(biāo)，較小尺寸的納米粒子比較大的納米顆粒具有更高的活性[33]。本研究評(píng)價(jià)了貯存時(shí)間、溫度和pH值對(duì)SLPC-SeNPs穩(wěn)定性的影響。如圖5A所示，剛制備（0 d）的SLPC-SeNPs的粒徑為55.46 nm，隨著貯存時(shí)間的延長(zhǎng)，SLPC-SeNPs粒徑呈逐漸增大的趨勢(shì)，當(dāng)貯存時(shí)間延長(zhǎng)至100 d時(shí)，其粒徑顯著增大（P＜0.05），達(dá)到78.90 nm，說(shuō)明SLPC-SeNPs至少可以在4 ℃下穩(wěn)定存放80 d左右，具有一定的貯存穩(wěn)定性。貯存溫度對(duì)SLPC-SeNPs穩(wěn)定性的影響如圖5B所示，在4 ℃下貯存的SLPC-SeNPs粒徑?jīng)]有明顯變化；在25 ℃環(huán)境下，SLPCSeNPs的粒徑在前15 d無(wú)顯著變化（P＞0.05），25 d后顯著增大（P＜0.05）；而在37 ℃環(huán)境下，SLPC-SeNPs的粒徑隨著貯存時(shí)間的延長(zhǎng)而顯著增大（P＜0.05），由此可知，貯存溫度會(huì)影響SLPC-SeNPs的穩(wěn)定性。研究表明多糖的黏度會(huì)影響納米硒的穩(wěn)定性，例如胞外多糖就是因?yàn)槠漭^高的黏度從而可以用來(lái)穩(wěn)定納米硒粒子，而且多糖的黏度隨貯存溫度的升高而降低[12]，因此，SLPC-SeNPs在4、25 ℃和37 ℃下的穩(wěn)定性差異可能是因?yàn)镾LPC在4 ℃下的黏度高于在25 ℃和37 ℃下的黏度。新鮮制備的SLPC-SeNPs溶液體系的初始pH值約為6.8（對(duì)照），如圖5C所示，當(dāng)溶液pH值為2和4時(shí)，SLPCSeNPs的粒徑分別顯著增加至119.93 nm和104.48 nm，這可能是在強(qiáng)酸條件下SLPC的質(zhì)子化削弱了SLPC與SeNPs之間的靜電相互作用[34-35]，從而導(dǎo)致SLPC-SeNPs的聚集。而當(dāng)pH值在6～12范圍內(nèi)時(shí)SLPC-SeNPs的粒徑無(wú)顯著變化。

表1 SLPC、Se-SLPC、SLPC-SeNPs的抗氧化活性Table 1 Antioxidant activity of SLPC, Se-SLPC and SLPC-SeNPs

圖5 SLPC-SeNPs的穩(wěn)定性Fig. 5 Stability of SLPC-SeNPs

2.6 兩種富硒黃牛肝菌傘多糖體外抗氧化活性

硒化可以通過(guò)活化多糖異構(gòu)碳上的氫原子提高多糖的抗氧化活性，以VC作為陽(yáng)性對(duì)照，通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)分別評(píng)價(jià)SLPC、Se-SLPC和SLPC-SeNPs的抗氧化活性，結(jié)果如表1所示。在質(zhì)量濃度0.5～3.0 mg/mL范圍內(nèi)，SLPC、Se-SLPC、SLPC-SeNPs對(duì)DPPH自由基、ABTS陽(yáng)離子自由基和O2－·的清除能力均表現(xiàn)出質(zhì)量濃度依賴性，且Se-SLPC、SLPC-SeNPs的清除能力均強(qiáng)于SLPC。此外，SLPC-SeNPs的體外抗氧化活性整體上略強(qiáng)于Se-SLPC，可能是因?yàn)榧{米硒具有尺寸效應(yīng)和表面效應(yīng)[36]?？傊?，Se-SLPC和SLPC-SeNPs綜合了硒和SLPC的優(yōu)點(diǎn)，與單一的SLPC相比較大程度提高了抗氧化活性。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)以SLPC為原料，分別制備了Se-SLPC和SLPC-SeNPs兩種硒-多糖復(fù)合物，主要得出以下結(jié)論：Se-SLPC的含硒量為1.62 mg/g，由半乳糖、葡萄糖和甘露糖組成，平均分子質(zhì)量為8.2 kDa，NMR分析結(jié)果表明亞硒酸基團(tuán)在(1→6)-β-D-Glcp的C4位和糖苷鍵連接位點(diǎn)C3發(fā)生了取代。SLPC-SeNPs呈均勻規(guī)則的球形結(jié)構(gòu)，粒徑為55.46 nm，在4 ℃下能穩(wěn)定保持至少80 d。乳液、水凝膠等是良好的載體材料，一些復(fù)合型乳液或水凝膠具有耐強(qiáng)酸或是溫度、pH值響應(yīng)性釋放的功能。在后續(xù)的研究中可以考慮采用以多糖、蛋白質(zhì)、淀粉及其衍生物為原材料制備的乳液或水凝膠作為載體，以包埋、共價(jià)結(jié)合等形式與SLPC-SeNPs相互作用，減少SLPC-SeNPs在強(qiáng)酸環(huán)境中的聚集，從而提高富硒多糖的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。此外，Se-SLPC和SLPC-SeNPs的抗氧化活性均顯著高于SLPC，是具有良好應(yīng)用前景的補(bǔ)硒劑和抗氧化劑。