王義精 高莉娜 郝淼淼 王雪晶 滕軍放

帕金森?。≒arkinson disease，PD）是以神經(jīng)元內(nèi)α-突觸核蛋白（α-synuclein，α-syn）異常沉積及中腦多巴胺能神經(jīng)元大量喪失為特點的神經(jīng)退行性疾病[1]。在生理情況下，α-syn的合成與降解存在動態(tài)平衡[2]。以往的研究表明絕大多數(shù)PD患者中清除蛋白的泛素-蛋白酶體催化活性喪失和溶酶體數(shù)量減少，導致α-syn沉積，損害細胞正常功能[3-5]。最近關(guān)于PD患者及動物模型的研究均表明腦膜淋巴管引流功能障礙，并且已通過動物實驗證實腦膜淋巴管是細胞外α-syn及其異構(gòu)體從大腦中清除的重要途徑[6-7]。類淋巴系統(tǒng)是通過血管周圍間隙（perivascular spaces，PVS）完成腦脊液（cerebrospinal fluid，CSF）與組織間液（interstitial fluid，ISF）交換，并將大腦代謝廢物通過腦膜淋巴管引流出大腦的轉(zhuǎn)運系統(tǒng)[8]。正常的PVS在MRI上一般看不到，擴大的 PVS（enlarged PVS，EPVS）可以在MRI中顯像[9]?，F(xiàn)有研究認為EPVS與類淋巴功能障礙有關(guān)。通過計數(shù)常規(guī)T2或T1加權(quán)MRI基底節(jié)區(qū)（basal ganglia，BG）、半卵圓中心（centrum semiovale，CSO）EPVS的數(shù)量可間接反映類淋巴系統(tǒng)功能[9-10]。為探索PD患者是否有類淋巴功能異常，腦膜淋巴管功能障礙是否會對類淋巴系統(tǒng)產(chǎn)生影響，本研究通過臨床觀察與動物實驗相結(jié)合研究PD類淋巴系統(tǒng)功能及與腦膜淋巴管之間的關(guān)系，為闡明PD的發(fā)生發(fā)展提供參考。

1 對象與方法

1.1 臨床研究

1.1.1 研究對象 本研究為回顧性研究。納入2021年1月至2021年8月鄭州大學第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科就診的30例PD患者，均符合國際帕金森病和運動障礙協(xié)會（Movement Disorder Society，MDS）2015年發(fā)布的帕金森病的臨床診斷標準[11]。35例健康對照來自體檢中心招募，納入標準：無腦血管疾病、高血壓、糖尿病，無創(chuàng)傷性腦損傷、腦部占位性病變等其他神經(jīng)精神系統(tǒng)病變。PD組年齡平均（54.1±5.8）歲，男15例，女15例；對照組年齡平均（55.9±4.0）歲，男19名，女16名。兩組年齡、性別差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。PD組病程為（60.8±18.4）個月。

1.1.2 EPSV的判定與計數(shù) 采用德國西門子3.0 T磁共振掃描儀 (Skyra，Siemens Healthcare，Erlangen，Germany)進行頭部MRI掃描，20通道頭頸聯(lián)合線圈掃描。MRI平掃應用SE及TSE序列，常規(guī)軸位、矢狀位掃描，T1加權(quán)像（T1WI）的重復時間（repetition time，TR）/回波時間（echo time，TE）為260 ms/2.46 ms，T2WI的 TR/TE 為 3800 ms/93 ms，T2液體衰減反轉(zhuǎn)恢復（FLAIR）序列的TR/TE為3800ms/93 ms，F(xiàn)L2D T1WI的TR/TE為 380 ms/2.5 ms，層厚5 mm，層距1 mm，矩陣256×256，視野（filed of view，F(xiàn)OV）240 mm×240 mm。EPSV在T2WI上呈高信號，T1WI上為低信號，與血管走行平行時呈線形，與血管走行垂直時呈圓形。選擇BG、CSO部位計數(shù)兩個部分的EPSV數(shù)量。

1.2 動物實驗

1.2.1 動物分組與模型制備 健康雄性8周齡C57BL/6J小鼠90只，購買于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。適應性飼養(yǎng)1周后進行實驗。實驗動物隨機分為3組：對照組、模型組與實驗組，每組30只。實驗組小鼠每日舒尼替尼（60 mL/kg）灌胃，對照組、模型組小鼠等量磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffered saline，PBS）灌胃。連續(xù)2周后，模型組與實驗組小鼠紋狀體注射α-syn預制纖維（α-syn preformed fibrils，α-syn PFFs）構(gòu)建PD模型。α-syn單體（美國rPeptide公司）以1 mg/mL的濃度重懸攪拌并用超聲細胞破碎儀處理制備α-syn PFFs。以前囟為標志，注射坐標定位為前囟+0.3 mm，旁開±2.0 mm，深度-3.0 mm。兩側(cè)各注射2.5 μL。注射4個月。對照組以同樣的方法注射等量PBS。之后實驗組每隔5 d 1次舒尼替尼（60 mL/kg）灌胃處理，對照組與模型組予等量PBS。

1.2.2 免疫熒光檢測LYVE-1、AQP4表達 小鼠腦及顱骨分別在30%蔗糖甲醛、4%多聚甲醛中固定12 h。分離硬腦膜加入小鼠抗淋巴管內(nèi)皮透明質(zhì)酸受體-1（lymphatic vessel endothelial receptor-1，LYVE-1）抗體（美國R&D公司）；鼠腦OCT包埋后冰凍切片機切成20 μm厚的切片加入抗水通道蛋白4（aquaporin 4，AQP4）抗體（美國Millipore公司），4℃過夜，洗滌后與熒光染料偶聯(lián)的二抗孵育3 h，甘油封片、熒光顯微鏡觀察。

1.2.3 顱內(nèi)示蹤劑注射及體外熒光成像 小鼠麻醉后分別向小腦延髓池、單側(cè)紋狀體內(nèi)注射3 μL濃度為0.05 g/mL的伊文思藍（Evans blue，EB）溶液，觀察示蹤劑在腦實質(zhì)的引流、清除情況。分別在注射后0.5 h灌注取腦，4%多聚甲醛固定24 h，OCT包埋切成100 μm厚的切片[12]，hochest染核后用熒光顯微鏡觀察。

1.2.4 免疫組織化學檢測pα-syn表達 小鼠腦使用4%多聚甲醛固定24 h，石蠟包埋，切片。經(jīng)脫蠟、水化、高溫高壓抗原修復后封閉，隨后加入鼠源性抗磷酸化α-syn抗體（美國Millipore公司），4℃過夜，洗滌后用辣根過氧化物酶標記的二抗孵育1 h，洗滌后DAB顯色、復染，脫水透明封片，顯微鏡下觀察拍片。

1.3 統(tǒng)計學方法 本研究采用GraphPad Prism 8.0對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。計量資料用±s表示。EPVS數(shù)量呈非正態(tài)分布，以中位數(shù)（上下四分位數(shù)）[M（QL,QU）]表示，組間比較采用Mann-Whitney U檢驗。免疫組化與熒光圖片采用ImageJ軟件進行定量分析腦膜淋巴管、類淋巴功能及AQP4極性[13]。應用單因素方差分析比較三組小鼠免疫熒光區(qū)域面積及示蹤劑滲透差異。兩兩比較采用LSD-t檢驗。檢驗水準α=0.05，雙側(cè)檢驗。

2 結(jié)果

2.1 臨床研究結(jié)果 PD組（30例）BG、CSO部位EPSV數(shù)量分別為7（5，9）、10（7，12）。對照組（35例）BG、CSO部位EPSV數(shù)量分別為 1（0，2）、2（1，3）。PD組EPSV數(shù)量多于對照組，且差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）。見圖1。

圖1 典型部位EPSV圖示

2.2 動物實驗結(jié)果

2.2.1 腦膜淋巴管結(jié)構(gòu) α-syn PFFs注射4個月后，模型組及實驗組mLVs結(jié)構(gòu)發(fā)生不同程度破壞，見圖2。對照組、模型組及實驗組LYVE-1陽性面積比例分別為（11.12%±1.32%）、（8.36%±0.74%）和（2.50%±0.54%）。與對照組相比，實驗組（P＜0.01）及模型組（P＜0.001）差異均具有統(tǒng)計學意義。

圖2 腦膜中LYVE-1陽性淋巴管免疫熒光染色結(jié)果 比例尺2 mm。

2.2.2 類淋巴系統(tǒng)功能及AQP4極性 α-syn PFFs紋狀體注射4個月后，與對照組小鼠相比，實驗組小鼠類淋巴功能明顯受損，示蹤劑在腦實質(zhì)的引流、分布、清除明顯減少，AQP4極性明顯降低。而模型組小鼠類淋巴功能、AQP4極性僅輕度受損。見圖3、表1。

表1 類淋巴引流、清除功能及AQP4極性結(jié)果

圖3 模型組與實驗組類淋巴引流、清除功能受損、AQP4極性降低 A.小腦延髓池注射EB 30 min后腦實質(zhì)的分布情況，比例尺1.6 mm；B.單側(cè)紋狀體注射EB 30 min后腦實質(zhì)的分布情況，比例尺1.6 mm；C.AQP4極性水平情況，比例尺50 μm。

2.2.3 病理性pα-syn α-syn PFFs注射4個月后，實驗組小鼠皮層、紋狀體、黑質(zhì)pα-syn的沉積明顯多于模型組（P＜0.001）。見圖4、表2。

表2 pα-syn陽性染色面積

圖4 皮層、紋狀體與黑質(zhì)中pα-syn陽性包涵體免疫組化染色結(jié)果 比例尺50 μm。

3 討論

長期以來，由于中樞神經(jīng)系統(tǒng)與外周免疫系統(tǒng)缺乏直接聯(lián)系，一直被認為是免疫豁免器官[14]。2012年，一項研究表明CSF與ISF通過由動脈周圍間隙的CSF流入通道、依賴AQP4極性分布的經(jīng)腦實質(zhì)轉(zhuǎn)運通道、靜脈周圍間隙的ISF流出通道構(gòu)成的類淋巴系統(tǒng)完成腦實質(zhì)細胞外的物質(zhì)交換與廢物清除，其中AD的致病蛋白β-淀粉樣蛋白在類淋巴系統(tǒng)破壞后清除率降低55%[15]。最近多項研究已經(jīng)確認人和嚙齒類動物大腦中存在腦膜淋巴管[16-17]，負責將腦脊液中的大分子物質(zhì)及廢物通過頸深淋巴結(jié)從大腦中清除。腦膜淋巴管與類淋巴系統(tǒng)密切相關(guān)，兩者構(gòu)成連續(xù)的液體清除途徑，從大腦排出大分子和有毒的蛋白質(zhì)代謝物，同時與衰老、阿爾茨海默?。ˋlzheimer disease，AD）等神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[18]。

通過臨床觀察本研究發(fā)現(xiàn)PD患者EPVS數(shù)量明顯多于正常對照，間接反映了類淋巴系統(tǒng)功能障礙。為了探索其機制，本研究動物實驗向小鼠雙側(cè)紋狀體注射α-syn PFFs，4個月后PD模型小鼠出現(xiàn)腦膜淋巴管結(jié)構(gòu)破壞。通過向小腦延髓池、單側(cè)紋狀體注射EB，本研究發(fā)現(xiàn)動靜脈周圍間隙旁的類淋巴引流途徑受損也發(fā)生于α-syn誘導的PD模型中，但是不清楚首先受損的是腦膜淋巴管還是類淋巴系統(tǒng)，或者是兩者均獨立受到PD的影響。成年小鼠已形成的腦膜淋巴管依賴于血管內(nèi)皮生長因子 C（vascular endothelial growth factor C，VEGF-C）及其酪氨酸激酶受體VEGFR3信號的調(diào)節(jié)。舒尼替尼是一種酪氨酸激酶受體抑制劑，通過抑制VEGFR抑制腦膜淋巴管增生[19]。舒尼替尼處理后腦膜淋巴管結(jié)構(gòu)破壞加重，同時pα-syn在大腦內(nèi)的積聚增加，類淋巴途徑進出腦實質(zhì)的示蹤劑明顯減少。大腦中分布于血管周圍的星形膠質(zhì)細胞足突表面的AQP4對于通過類淋巴途徑完成的物質(zhì)轉(zhuǎn)運與廢物清除至關(guān)重要[20]。多項動物研究表明Aqp4基因敲除后類淋巴運輸顯著抑制[15,21-22]。通過檢測各組小鼠大腦中AQP4的極性水平，本研究發(fā)現(xiàn)在α-syn PFFs注射4個月后模型組小鼠大腦中AQP4極性水平降低，抑制腦膜淋巴管增生后實驗組小鼠AQP4極性水平顯著降低。推測腦膜淋巴管結(jié)構(gòu)破壞后，其清除功能障礙，積聚的α-syn可能通過誘導星形膠質(zhì)細胞表面AQP4的極性下調(diào)而加速類淋巴功能障礙，這又可以加重α-syn的沉積，兩者形成惡性循環(huán)，導致不可逆的神經(jīng)元變性與死亡。因此，進一步探索致病性α-syn與類淋巴系統(tǒng)障礙的相關(guān)性及其潛在機制有助于闡明PD發(fā)展的分子機制，從而找到打破惡性循環(huán)的突破點，為延緩甚至逆轉(zhuǎn)PD病程進展提供新的靶點。

綜上，本研究通過臨床觀察和動物實驗發(fā)現(xiàn)，PD患者EPVS數(shù)目增多，提示其類淋巴系統(tǒng)功能障礙，這可能是腦膜淋巴管受損，介導病理性α-syn沉積破壞AQP4極性引起的。