董瑩，時紹鵬，宋誠，劉春紅，徐顏軍，劉鴻，王興祖

(1.浙江浙能技術(shù)研究院有限公司，杭州 311121；2.工業(yè)新水源技術(shù)浙江省工程研究中心，杭州 311121；3.中國科學(xué)院 重慶綠色智能技術(shù)研究院 水污染過程與防治研究中心，重慶 400714;4.中國科學(xué)院大學(xué) 資源與環(huán)境學(xué)院，北京 100049)

煤炭行業(yè)是中國當(dāng)前經(jīng)濟發(fā)展的重要組成部分，也是重要的戰(zhàn)略資源[1]。然而，煤氣化項目需水量巨大，同時也會產(chǎn)生大量工業(yè)廢水，這些廢水成分復(fù)雜，污染程度高，對生態(tài)環(huán)境破壞極大[2-4]。目前，煤氣化廢水深度處理并回用主要采用預(yù)處理、生化處理和深度處理的組合工藝，由于煤氣化廢水生化處理單元效率低，造成后續(xù)深度處理負荷偏高、綜合處理成本居高不下[5-6]。進一步提高生化單元處理效率，降低深度處理單元的運營成本，成為整個煤氣化廢水處理過程節(jié)能降耗的關(guān)鍵[7-8]。

生物強化技術(shù)是通過投加具有特定功能的微生物、營養(yǎng)物或基質(zhì)類似物，增強處理系統(tǒng)對特定污染物的降解能力，提高降解速率，達到有效處理難降解有機物廢水的目的[9]。通過向煤化工廢水中投放具有特殊功能的微生物可以有效地提高難降解有機物的生物處理效果，并維持廢水處理系統(tǒng)在不利環(huán)境條件下的運行穩(wěn)定性[2,10]。此外，表面活性劑類物質(zhì)可以作為微生物促生劑，克服疏水性有機物較差的生物利用度和提高營養(yǎng)攝取率，從而用于強化焦化廢水、石油烴類廢水等的生物處理[11-13]。但在連續(xù)流煤氣化廢水處理系統(tǒng)中，往往需要頻繁投加生物菌劑或促生劑來達到較高的處理效果[14-15]。這主要歸因于微生物與環(huán)境、微生物與促生劑以及微生物之間的作用關(guān)系錯綜復(fù)雜，只有在充分把握菌劑的降解能力、促生劑的作用原理以及微生物交互作用的基礎(chǔ)上，才有可能充分發(fā)揮生物強化的效能[16-17]。

針對煤氣化廢水生化尾水殘余有機物濃度高、難生物降解等問題，采用微生物促生劑和微生物菌劑聯(lián)合投加的方式強化煤氣化尾水的進一步處理，同時運用分子生態(tài)學(xué)方法解析了該體系中微生物群落的交互作用以及關(guān)鍵代謝途徑，為實際煤氣化廢水的生物強化處理提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 廢水與污泥

實驗廢水來自某煤氣化廢水處理廠兩級缺氧/好氧(A/O)工藝出水，實驗接種污泥來自該廠O池，接種污泥 SS=10.4 g/L，VSS=8.7 g/L。

1.2 促生劑與菌劑

實驗采用的促生劑與菌劑主要組成見表1。促生劑主要成分包埋于聚乳酸當(dāng)中，比例為1∶100，包埋后的促生劑研磨成粒徑小于50目的粉末。菌劑分別為降解木質(zhì)素、吡啶、1,5-萘二磺酸鈉和原油的微生物富集培養(yǎng)物。

1.3 實驗方法

反應(yīng)體系為250 mL錐形瓶，廢水添加量為100 mL，錐形瓶用透氣硅膠塞封口，以維持體系的好氧狀態(tài)。接種污泥為某煤氣化廢水處理廠O池污泥，各反應(yīng)體系污泥接種量均為1 mL，初始pH值均為8.41。實驗方式為反復(fù)批式實驗，促生劑和菌劑均在培養(yǎng)初期一次性投加，后續(xù)周期中不再追加。定期取樣檢測體系上清液COD，然后用煤氣化廢水置換上清液，開始下一周期培養(yǎng)。錐形瓶置于生化培養(yǎng)箱中(30±0.5)℃避光靜置培養(yǎng)，每隔一段時間取樣測定水質(zhì)指標。

在促生劑和菌劑單一強化實驗中，促生劑投加量為0.5 g/L，菌劑投加量為0.5 mL/L。在促生劑與菌劑的聯(lián)合強化實驗中，促生劑和菌劑的投加量與單一強化相同，復(fù)配方案見表2。在促生劑和菌劑投加量優(yōu)化實驗中，設(shè)定0、0.1、0.5、1.0、2.0 g/L共5個聯(lián)合投加濃度，促生劑與菌劑的質(zhì)量比例為1∶1。

表2 促生劑和菌劑復(fù)配方案Table 2 Coupling scheme of growth promoting agent and bacterial consortia

1.4 分析方法

水質(zhì)分析。COD、氨氮、硝態(tài)氮、亞硝態(tài)氮和總磷均采用國家規(guī)定的標準方法測定。庫倫生化需氧量(BODq)采用BOD-Q水質(zhì)測定儀(LL-IS型，重慶中科德馨環(huán)?？萍加邢薰?測定。水樣的氣質(zhì)聯(lián)用(Gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS)分析。將煤氣化廢水水樣以0.45 μm微濾膜過濾，然后將500 mL濾液加入到1 L容量瓶中，并分別在中性(pH=7.0)、堿性(pH=12.0)和酸性(pH=2.0)條件下以二氯甲烷萃取水樣，每種條件下重復(fù)三次。合并上述有機相溶液，并用600 ℃烘干的無水硫酸鈉對萃取液進行脫水。采用Hei-VAP Precision(ML)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將脫水后的萃取液濃縮至 2～3 mL。濃縮后的萃取液采用Agilent 7890A-5977A氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀分析。進樣量：1 μL；進樣口溫度：250℃；分流比：無分流；色譜柱：DB-5(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；柱溫：初溫50 ℃保持2 min，然后以10 ℃/min程序升溫至250 ℃；載氣流速：1 mL/min；氣質(zhì)接口溫度：250 ℃；電子能量：70 V；掃描質(zhì)量：15～500；溶劑延遲：3 min；譜庫：NIST 2011。

微生物多樣性分析。將污泥樣品送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進行16S rDNA高通量分析，所用引物為515F/907R。采用Cytoscape 3.8.0軟件，基于Pearson和Spearman相關(guān)性，進行微生物交互分析?；赑ICRUSt2功能預(yù)測數(shù)據(jù)，采用Gephi 0.9.1軟件，對微生物MetaCyc 途徑進行分析。采用FAPROTAX軟件及其Python腳本，對微生物功能進行預(yù)測。

2 結(jié)果與討論

2.1 現(xiàn)場A/O工藝中污染物及微生物分析

煤氣化廢水生化處理出水見表3。煤氣化廢水經(jīng)過現(xiàn)場兩級A/O工藝處理后，廢水中的COD濃度仍達343.71 mg/L，處于較高濃度。此類水若直接進入后續(xù)高級氧化單元將明顯增加該單元負荷，導(dǎo)致高級氧化藥劑等費用升高，有必要對該水做進一步生化處理以減輕后續(xù)深度處理負荷，降低整套工藝的運營成本。同時，廢水中的BODq濃度為0.56 mg/L，可生化性較差，采用單純菌劑投加的方式可能難以取得較好的強化效果。廢水中氨氮、總氮和總磷的濃度分別為53.44、75.16、0.45 mg/L，可滿足微生物生長需要。通過GC-MS分析可知(圖1)，經(jīng)過兩級A/O處理，廢水中仍含有多種芳環(huán)類、直鏈烴類和氮雜環(huán)類等化合物，典型的有機物有苯并三唑(圖1(a))、鄰二甲苯(圖1(b))和十九烷(圖1(c))等。

表3 煤氣化廢水生化處理出水水質(zhì)Table 3 Water quality of secondary effluent from coal gasification wastewater treatment plants

圖1 A/O工藝出水GC-MS分析Fig.1 GC-MS analysis of effluent from A/O

從現(xiàn)場A/O工藝中取泥進行微生物16S rDNA高通量測序分析，結(jié)果如圖2所示。從屬水平來看，A段和O段中的微生物組成較為接近，優(yōu)勢菌屬為CandidatusCompetibacter、Ferruginibacter、UnclassifiedComamonadaceae、Limnobacter、Ottowia和Defluviimonas。CandidatusCompetibacter和Defluviimonas為典型的好氧型聚糖菌，能在營養(yǎng)豐富時合成聚羥基脂肪酸酯，以度過有機碳源匱乏的不利時期[18]。CandidatusCompetibacter和Defluviimonas的大量存在可能與工藝進水水質(zhì)周期波動引起的污泥間歇饑餓有關(guān)。同時，Defluviimonas也被報道能夠降解稠環(huán)芳烴類化合物[19]。Ferruginibacter常在處理各類廢水的活性污泥中被發(fā)現(xiàn)，能夠分泌大量胞外聚合物，被認為與污泥絮體和生物膜的形成有關(guān)[20]，也有研究報道Ferruginibacter能夠降解農(nóng)藥“阿特拉津”等難降解有機物[21-22]。Limnobacter屬于化能有機營養(yǎng)異養(yǎng)型微生物，能夠降解脂肪族和芳香族等多種難降解性化合物，常見于受原油污染的環(huán)境中[23]?；谝陨纤|(zhì)和微生物分析，選擇降解吡啶、磺酸萘和原油類的菌群開展后續(xù)的生物強化研究。

2.2 單一促生劑和菌劑的強化

從實驗室現(xiàn)有庫中選定菌劑和促生劑，考察單一促生劑和菌劑對實際煤氣化廢水的生物強化效果。反復(fù)批式實驗結(jié)果表明(圖3)，單獨投加原油降解菌群(菌劑4)對廢水的COD去除效果最高，在3個周期中，出水COD濃度維持在170～190 mg/L之間(圖3(a))；與只投加污泥的空白相比，平均COD去除率提高了19.7%。菌劑1～3的強化效果略差，其出水COD始終在200 mg/L以上，但在3個周期中均表現(xiàn)出一定強化效果。由于每周期結(jié)束時排出上清液，菌劑會有流失，因此，菌劑效果的維持應(yīng)該與菌劑在體系中的增殖有關(guān)。單獨投加促生劑在周期1中能夠顯著提高廢水的COD去除效果，出水COD濃度迅速下降到150 mg/L左右；但在后續(xù)周期2、周期3當(dāng)中出水COD濃度迅速升高，效果不能維持長久(圖3(b))，表明隨著周期更替，促生劑有明顯流失。綜上，單獨投加菌劑能夠維持生物強化的作用時間，但出水COD濃度仍較高；單獨投加促生劑能使初期出水COD濃度顯著下降，但效果不能維持長久。因此，后續(xù)實驗考慮二者聯(lián)合投加。

圖3 單一菌劑和促生劑對廢水COD去除的影響Fig.3 Effects of single bacterial consortia and growth promoting agent on COD removal from

2.3 促生劑和菌劑的聯(lián)合強化

為進一步提高強化效果，開展不同促生劑和菌劑的聯(lián)合強化實驗。結(jié)果表明(圖4)，促生劑和菌劑聯(lián)合使用可彌補單一菌劑或促生劑的不足，其中，投加復(fù)配3(原油降解污泥+吐溫80)的效果較好。從作用時間上看，投加復(fù)配3的組合強化作用時間可達到30 d左右；從出水來看，在測試的6個周期內(nèi)，出水平均COD濃度在150 mg/L左右，與未強化的污泥相比，COD平均去除率上升了21.5%。除了復(fù)配3，其它復(fù)配組均不能同時滿足降低出水COD濃度和延長作用時間的要求?？赡艿脑虬ǎ涸徒到饩鷮ν闊N、芳香烴等烴類具有較高的降解能力，對于本研究中采用的煤氣化廢水中的多種烷烴類化合物具有較好的處理效果；吐溫80為表面活性劑，該類化合物已被報道對煤氣化廢水的生化降解具有較好的促進效果，其作用原理包括提高細菌細胞與烷烴類的親和性、改善細胞膜通透性等[11-13]。因此，將原油降解菌群和吐溫80的復(fù)配3作為進一步研究的對象。

圖4 促生劑和菌劑聯(lián)合投加對COD去除的影響Fig.4 Effects of complex of growth promoting agent and bacterial consortia on the COD

2.4 促生劑和菌劑投加量優(yōu)化

為指導(dǎo)后續(xù)的工程投加，開展了促生劑和菌劑投加量(復(fù)配3)的測試。結(jié)果表明，隨著復(fù)配3投加量的增加，出水COD濃度逐漸降低(圖5)。當(dāng)投加量為0.5 g/L時，在全部6個測試周期中，出水COD濃度維持在139～168 mg/L之間；與不加促生劑和菌劑的污泥相比，平均COD去除率提高了20.1%。從復(fù)配3的效價來看，隨著投加量的增加，復(fù)配3的效價迅速下降。當(dāng)投加量從0.1 g/L上升到2.0 g/L，復(fù)配3的效價從534 mg COD/mg復(fù)配3下降到38.5 mg COD/mg復(fù)配3。當(dāng)投加量超過0.5 g/L時，COD削減效果開始減弱；當(dāng)投加量達到2.0 g/L時，與0.5 g/L的投加量相比，平均COD去除率僅提高了2.3%。綜合COD去除效率與復(fù)配3效價兩方面考慮，將0.5 g/L作為復(fù)配3的最佳投加量。

圖5 促生劑濃度對廢水COD去除的影響Fig.5 Effects of concentrations of growth promoting agent on the COD

2.5 微生物群落結(jié)構(gòu)分析

為進一步了解復(fù)配3生物強化對微生物群落的影響，對促生劑和菌劑聯(lián)合強化后的微生物進行了16S rDNA對比分析。Alpha多樣性分析表明(表4)，經(jīng)過生物強化后，復(fù)配3組的Shannon指數(shù)(5.440)高于未強化的污泥空白(5.346)，而復(fù)配3組的Simpson指數(shù)(0.011)低于未強化的污泥空白(0.012)，表明復(fù)配3的投加增加了微生物多樣性。從屬水平微生物群落結(jié)構(gòu)來看(圖6)，有無促生劑/菌劑投加對微生物優(yōu)勢菌屬的影響不大，norank_f_SBR1031(4.4%～7.5%)、SM1A02(3.1%～10.4%)、norank_f_Pirellulaceae(3.6%～5.0%)、Limnobacter(2.6%～5.0%)、norank_f_Sutterellaceae(1.7%～3.8%)和norank_f_67-14(1.7%～3.4%)為所有樣品中的優(yōu)勢菌屬，表明煤氣化廢水污泥中的微生物菌群高度穩(wěn)定，生物強化的效果通過提高微生物多樣性并增強種間協(xié)同作用實現(xiàn)。同時，從微生物屬水平分析可知，煤氣化廢水處理的優(yōu)勢物種中存在大量未分類或未命名的微生物，由于這些微生物尚未分類和命名，其具體的功能特性尚無法獲知。

微生物交互分析表明(圖7)，Limnobacter和Gaiella具有較高的權(quán)重和緊密中心性，它們是煤氣化廢水處理系統(tǒng)中的關(guān)鍵物種。關(guān)鍵物種為特定環(huán)境體系中的核心微生物，能夠維持整個微生物群體的穩(wěn)定性。Limnobacter屬于化能有機營養(yǎng)型生物，可氧化還原態(tài)的硫化合物獲得能量，能夠降解多種脂肪族和芳香族化合物[24-25]，在原油污染的環(huán)境中具有較高的豐度。關(guān)于Gaiella生理特性的報道則十分有限。已知Gaiella是嗜熱油菌綱中的成員，該菌綱下的多個成員(如嗜熱油菌屬)對中長鏈烷烴具有特殊的親和性并能將其作為唯一碳源以供生長[26-27]。此外，近年來Gaiella被報道具有降解雜環(huán)類化合物的能力[28-29]。在研究中，廢水中含有多種中長鏈烴類和芳香族化合物，這些物質(zhì)難以被常規(guī)活性污泥所分解。推測Limnobacter和Gaiella能夠部分降解這些有機物，從而為其它微生物提供可降解的中間體，因此成為煤氣化廢水處理體系中整個菌群的關(guān)鍵物種。

表4 Alpha多樣性參數(shù)統(tǒng)計Table 4 Alpha diversity parameter result statistics

圖6 煤氣化廢水中屬水平的微生物豐度(>2%)Fig.6 Relative abundance of the main genera (>2%)identified in coal gasification

圖7 煤氣化廢水中的微生物互作網(wǎng)絡(luò)Fig.7 Microbial interaction network in coal

2.6 微生物功能預(yù)測

通過MetaCyc功能預(yù)測進一步對煤氣化廢水生物強化體系中的代謝途徑進行了解析，并構(gòu)建了MetaCyc途徑的交互網(wǎng)絡(luò)。結(jié)果表明(圖8)，香草醛和香草酸鹽降解超級途徑(PWY-6338)、香草醛和香草酸鹽降解途徑I(PWY-7097)及香草醛和香草酸鹽降解途徑II(PWY-7098)處于網(wǎng)絡(luò)關(guān)鍵節(jié)點上，可判定為煤氣化廢水中微生物代謝的關(guān)鍵途徑。在香草醛和香草酸鹽降解超級途徑中，香草醛經(jīng)過加氫、去甲基和開環(huán)等一系列復(fù)雜的代謝過程生成丙酮酸鹽，并最終進入TCA循環(huán)礦化。香草醛和香草酸鹽降解途徑I和II分別是超級途徑的分支和變異模式。由此推斷，香草醛和香草酸鹽可能是煤氣化廢水中多種復(fù)雜有機物降解的共同中間體或結(jié)構(gòu)類似物，該類化合物的降解對煤氣化廢水的深度處理具有重要意義。

圖8 基于PICRUSt2功能預(yù)測的微生物代謝互作分析Fig.8 Metabolic interactions network in microbial communities based on PICRUSt2-based functional

為進一步探索生物強化對煤氣化廢水系統(tǒng)中微生物功能的影響，采用FAPROTAX方法對微生物生態(tài)功能進行注釋。FAPROTAX功能預(yù)測結(jié)果表明(圖9)，復(fù)配1和復(fù)配2、復(fù)配3和復(fù)配4分別形成一簇，這與二者分別包含原油降解污泥和吡啶降解污泥相關(guān)。與未強化的污泥空白相比，復(fù)配3和復(fù)配4的錳氧化作用和甲烷營養(yǎng)作用增強；復(fù)配3的芳香化合物降解作用顯著增強，而黑暗氫氧化、木質(zhì)素水解和硫循環(huán)作用下降。甲烷與烷烴的共代謝現(xiàn)象最早發(fā)現(xiàn)于甲烷假單胞菌對烷烴的降解中[30]，后來陸續(xù)發(fā)現(xiàn)于甲烷和芳環(huán)類等難降解化合物的共降解中[31-32]，并被應(yīng)用于原油污染環(huán)境的修復(fù)。在研究中，與未強化的污泥空白相比，復(fù)配3投加后獲得了更高的COD去除率(圖4)，強化后微生物的甲烷營養(yǎng)作用和芳香化合物降解功能得到同步提高，表明復(fù)配3的強化作用與甲烷營養(yǎng)的共代謝有關(guān)。

圖9 FAPROTAX功能預(yù)測Fig.9 FAPROTAX-based functional

3 結(jié)論

1)煤氣化廢水現(xiàn)場處理工藝中微生物優(yōu)勢菌屬為CandidatusCompetibacter、Ferruginibacter、UnclassifiedComamonadaceae、Limnobacter、Ottowia和Defluviimonas，其中存在CandidatusCompetibacter和Defluviimonas等典型的聚糖菌。

2)單獨投加促生劑或菌劑對煤氣化廢水的強化效果不理想，聯(lián)合投加促生劑(終濃度0.5 g/L)和菌劑(終濃度0.5 mL/L)，可使COD平均去除率提高21.5%，有效作用周期達到30 d。

3)促生劑和菌劑強化對煤氣化廢水中優(yōu)勢菌屬的影響較小，但顯著增加了微生物多樣性，Limnobacter和Gaiella是煤氣化廢水處理系統(tǒng)中的關(guān)鍵物種。

4)香草醛和香草酸鹽降解途徑是煤氣化廢水處理系統(tǒng)中微生物的關(guān)鍵降解途徑，它可能是煤氣化廢水中多種復(fù)雜有機物降解的共同中間體或結(jié)構(gòu)類似物。