邵順儒 郭清城 侯盛 袁秀珍 徐忠升 范文強 張蕙 朱紅帥 邵景德

摘要：建立CMAB008單抗陽離子交換層析介質(zhì)壽命確認方案，采用實際生產(chǎn)的工藝參數(shù)進行縮小模型試驗，以考察Nuvia S層析介質(zhì)循環(huán)到100次后性能指標(biāo)是否還滿足層析需要。按試驗方案對Nuvia S層析介質(zhì)循環(huán)到100次，分別在使用前和循環(huán)使用20、40、50、70、90次后對層析柱進行柱效測試，以考察隨循環(huán)次數(shù)的增加，層析介質(zhì)對層析柱對稱因子、理論塔板數(shù)的影響;對循環(huán)1、50、51、100次的層析柱進行動態(tài)載量測試，以考察洗脫峰的ProteinA殘留、HCP殘留、DNA殘留、毛細管電泳純度、SEC-HPLC純度、活性、得率;以不同上樣量20 g/L（循環(huán)8、48、88次）、40 g/L（循環(huán)9、49、89次）、80 g/L（循環(huán)61、62、63次），不同流速110 cm/h（循環(huán)10、50、92次）、149 cm/h（循環(huán)61、62、63次）、170 cm/h（循環(huán)11、59、93次）上樣以考察陽離子交換層析洗脫峰SEC-HPLC純度、得率。結(jié)果表明，使用前和循環(huán)使用20、40、50、70、90次后柱效測試中，所有對稱因子、理論塔板數(shù)均在可接受的標(biāo)準(zhǔn)范圍內(nèi);循環(huán)1、50、51、100次的層析柱動態(tài)載量測試結(jié)果均高于起始動態(tài)載量的80%，洗脫峰的ProteinA、HCP、DNA殘留檢測未有增高趨勢，毛細管電泳純度、SEC-HPLC純度、活性以及得率未有下降趨勢;上樣測試結(jié)果顯示，洗脫峰的SEC-HPLC純度無明顯變化趨勢，均大于98%，得率均大于85%。這些試驗結(jié)果均符合CMAB008原液純化工藝要求。結(jié)果證明，Nuvia S層析介質(zhì)在循環(huán)到100次時性能指標(biāo)沒有下降，可以保證純化CMAB008單抗產(chǎn)品的質(zhì)量。

關(guān)鍵詞：CMAB008單抗;層析介質(zhì)壽命;縮小模型;性能指標(biāo)

中圖分類號：R318.08 ??文獻標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2022）08-0069-04

自1972年基因工程技術(shù)問世以來，現(xiàn)代生物工程又經(jīng)歷飛速發(fā)展近50年，新世紀人們把更多的關(guān)注投向生物工程產(chǎn)業(yè)，使生物工程產(chǎn)業(yè)迅速崛起，特別是現(xiàn)代醫(yī)藥生物工程產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速，基因診斷、基因治療、人類基因組計劃、生物芯片、轉(zhuǎn)基因動物、RNA干擾、基因工程抗體、人源化抗體、治療性疫苗和抗體[1]等成果層出不窮，技術(shù)日新月異，令人目不暇接。一大批基因工程藥物如雨后春筍般不斷涌現(xiàn)，給人類健康和疾病治療帶來新的治療模式，社會對生物制品的需求與日俱增?！端幤纷怨芾磙k法》要求藥品安全、有效、質(zhì)量可控[2]。生物制品不僅要保證藥品的有效性，同時也不能影響其生產(chǎn)工藝穩(wěn)定性[3]。在現(xiàn)代化的生物制品生產(chǎn)過程中，在工藝上要經(jīng)過膜過濾法[4]、色譜法[5-6]、超短時微波加熱法、巴氏消毒法、干熱法、有機溶劑/去污劑（S/D）法和低pH值孵放法[7]等至少2種以上的方法進行病毒的去除/滅活[8-9]，還要經(jīng)過層析法通過高度的純化得到安全、有效、質(zhì)量可控的產(chǎn)品?，F(xiàn)代的層析技術(shù)非常廣泛，層析技術(shù)是原液純化的關(guān)鍵步驟，通過對收集到的中間產(chǎn)品進行純化以得到符合工藝要求的高純度的生物制品。對于純化技術(shù)使用的層析介質(zhì)的管理目前是藥品監(jiān)督管理部門日常監(jiān)督檢查、GMP合規(guī)檢查、藥品注冊現(xiàn)場核查關(guān)注的重點。層析介質(zhì)的清洗、儲存、使用次數(shù)均需要通過驗證進行確認，這在現(xiàn)行的2010年版GMP附錄生物制品中有明確的要求[10]。層析介質(zhì)成本昂貴，減少國家有限資源的浪費及降低企業(yè)生產(chǎn)成本都需要層析介質(zhì)反復(fù)使用多次，但經(jīng)過層析介質(zhì)多次使用，其純化能力會發(fā)生改變，使純化效果變差，以致影響層析樣品的質(zhì)量，造成最終使用的制劑有安全隱患。層析介質(zhì)的關(guān)鍵性能指標(biāo)主要包括目標(biāo)產(chǎn)品的純度、收率，動態(tài)載量減少，去除目標(biāo)雜質(zhì)（內(nèi)毒素、宿主蛋白和宿主DNA等）的能力，層析柱在使用中的物理性（裝柱高度/上樣柱壓、上樣液的流動速度等）的改變等[11]，因此層析介質(zhì)的使用壽命需要經(jīng)過嚴格和科學(xué)的驗證，這不但保證了藥品的質(zhì)量，而且還減少國家有限資源的浪費，同時降低企業(yè)生產(chǎn)成本。

本試驗建立CMAB008單抗純化的陽離子交換層析介質(zhì)壽命確認方案，按方案取相應(yīng)循環(huán)后的陽離子交換層析進行，動態(tài)載量測試，陽離子交換層析洗脫峰的ProteinA、HCP、DNA殘留檢測，SEC-HPLC 純度、活性檢測;檢測不同上樣量、不同流速陽離子交換層析洗脫峰SEC-HPLC純度、得率;考察經(jīng)過100個循環(huán)后的層析介質(zhì)是否仍滿足生產(chǎn)工藝需求，也為其他生物制品的層析介質(zhì)壽命研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 層析設(shè)備及介質(zhì) AKTA-avant150層析系統(tǒng)、XK16/40層析柱、Tricorn 10/20層析柱、Nuvia S層析介質(zhì)。

1.1.2 主要試劑 NaOH、乙酸鈉、乙酸、氯化鈉。按生產(chǎn)工藝的要求配制沖洗液、平衡液、洗脫液、再生液、消毒液、保存液;陽離子交換層析上樣液為筆者所在公司CMAB008產(chǎn)品完成親和層析的中間產(chǎn)品。

1.2 方法

工業(yè)化生產(chǎn)時的層板柱內(nèi)徑400 mm，柱高 700 mm。實際使用時一般裝柱高度160～240 mm。本試驗采用與生產(chǎn)相同的柱高，通過縮小柱直徑的方式，實現(xiàn)線性的模型縮小來測試Nuvia S層析介質(zhì)的使用壽命，計劃按實際工藝流程，進行100個循環(huán)的試驗。前50個循環(huán)以XK16/40型號層析柱進行驗證，后50個循環(huán)以Tricorn 10/20型號層析柱進行驗證。

在江蘇泰州邁博太科藥業(yè)有限公司應(yīng)用AKTA-avant150層析系統(tǒng)，進行試驗，試驗時間為2017年7—9月。按照和生產(chǎn)工藝相同的參數(shù)進行100個循環(huán)，每個循環(huán)都有完整的步驟：消毒、沖洗、前平衡、上樣、上樣后平衡洗滌、洗脫收集、再生、消毒、保存。第8、48、88次循環(huán)層析介質(zhì)上樣量20 g/L;第9、49、89次循環(huán)層析介質(zhì)上樣量 40 g/L;其他非動態(tài)載量測試循環(huán)層析介質(zhì)上樣量80 g/L。線性流速采用工藝流速的上下限及生產(chǎn)流速，其中上下限分別做3組有效數(shù)據(jù)的驗證循環(huán)。第10、50、92次循環(huán)流速改為110 cm/h;第11、59、93次循環(huán)流速改為170 cm/h;其他非動態(tài)載量測試循環(huán)流速為生產(chǎn)流速149 cm/h。為了評估Nuvia S層析介質(zhì)的性能，按設(shè)計的驗證方案取樣檢測。每個循環(huán)的流程及參數(shù)見表1。取樣和測試項目見表2。

2 結(jié)果與分析

2.1 柱效測試結(jié)果

循環(huán)1～50次使用XK16/40型號層析柱，裝柱高度237 mm，柱體積47.6 mL;循環(huán)51～100次使用Tricorn 10/20型號層析柱，裝柱高度210 mm，柱體積16.5 mL，裝柱高度符合商業(yè)生產(chǎn)時的要求（160～240 mm）。對使用前和20、40、50、70、90次循環(huán)后進行柱效測試，測試結(jié)果為對稱因子、理論塔板數(shù)均在可接受的標(biāo)準(zhǔn)范圍內(nèi)（表3），說明經(jīng)過近90次循環(huán)后，層板介質(zhì)性能沒有明顯變化趨勢。

2.2 動態(tài)載量測試結(jié)果

從Nuvia S層析介質(zhì)循環(huán)1、50、51、100次后的檢測數(shù)據(jù)（表4）可以看出，活性（生物學(xué)活性、結(jié)合活性）、SEC-HPLC純度（聚體、單體）、毛細管電泳純度、DNA去除率、HCP去除率、ProteinA去除率均無明顯下降趨勢，且1、50、51、100次循環(huán)后動態(tài)載量測試結(jié)果均滿足Nuvia S層析使用壽命確認方案的可接受標(biāo)準(zhǔn)。

2.3 不同上樣量測試結(jié)果

根據(jù)Nuvia S層析介質(zhì)使用壽命確認方案中的要求，測試不同的上樣量（20、40、80 g/L）對陽離子交換層析工藝、質(zhì)量的影響，從表5可以看出，SEC-HPLC 純度（聚體、單體）、得率均滿足工藝和質(zhì)量要求。

2.4 不同流速測試結(jié)果

根據(jù)Nuvia S層析介質(zhì)使用壽命確認方案中的要求，測試不同流速（110、149、170 cm/h）對陽離子交換層析工藝、質(zhì)量的影響，從表6可以看出，SEC-HPLC純度（聚體、單體）、得率均滿足工藝和質(zhì)量要求。

3 討論與結(jié)論

在生物制藥領(lǐng)域，層析純化是關(guān)鍵步驟，層析介質(zhì)循環(huán)使用次數(shù)直接影響分離提純效果[12]。根據(jù)不同產(chǎn)品特性和物料性質(zhì)，介質(zhì)壽命均不相同。離子交換層析技術(shù)是蛋白類樣品純化處理經(jīng)常使用的層析技術(shù)[13]。對40種基因重組蛋白質(zhì)和94 種非重組蛋白質(zhì)生產(chǎn)過程調(diào)查統(tǒng)計結(jié)果表明，在共有426次層析工序中離子交換層析比例占有40%[14]。單克隆抗體制劑的原液在生產(chǎn)過程中離子交換層析，一般用在親和層析之后，用于去除親和層析沒有除去的聚體、DNA殘留、病毒顆粒以及親和層析介質(zhì)中脫落的蛋白A配基。陽離子交換層析還可替代親和層析用在單克隆抗體制劑原液在生產(chǎn)過程中的純化捕集。現(xiàn)在大約有6%的單克隆抗體制劑采用了陽離子交換層析捕集純化抗體[15]。與親和層析相比，陽離子交換層析不但有較高的蛋白結(jié)合容量，解決單克隆抗體純化過程中要分多次上樣問題，而且陽離子交換層析介質(zhì)成本遠低于親和層析介質(zhì)。本研究以Nuvia S層析介質(zhì)為例，通過小規(guī)模的試驗，來檢測介質(zhì)壽命。陽離子交換層析的原理是通過電荷差異進行陽離子捕獲，核酸和內(nèi)毒素帶負電，大部分不結(jié)合陽離子交換層析，相反，不少單抗屬于堿性蛋白質(zhì)，可在合適的pH值下結(jié)合陽離子交換層析，讓核酸和內(nèi)毒素穿透。針對其純化原理，研究介質(zhì)壽命驗證方法，為研究不同用途的層析介質(zhì)壽命提供思路與數(shù)據(jù)支持。介質(zhì)壽命驗證是藥品研發(fā)，尤其是生物制品的重點關(guān)注內(nèi)容。企業(yè)在做介質(zhì)壽命驗證時，建議采用等比例縮小純化規(guī)模確定每步純化所用介質(zhì)的使用次數(shù)，確保層析介質(zhì)壽命在使用期限內(nèi)使用，介質(zhì)符合生產(chǎn)需求，防止交叉污染，保障產(chǎn)品的質(zhì)量。層析介質(zhì)在每次使用時，未被洗脫和流穿的物質(zhì)或雜質(zhì)會吸附在填料上，需要采用特定的清洗和再生程序?qū)游鼋橘|(zhì)進行清洗、再生、保存，以恢復(fù)介質(zhì)最初狀態(tài)。長期使用的介質(zhì)，會逐漸失去效力，如清洗后污染物殘留量、介質(zhì)使用參數(shù)變化、產(chǎn)品重要指標(biāo)（ 純度） 和收率均不在控制范圍之內(nèi)，則說明介質(zhì)的壽命已到期。本試驗中按設(shè)計的驗證方案層析介質(zhì)循環(huán)到100次，按驗證方案對相關(guān)的工藝參數(shù)、質(zhì)量指標(biāo)進行測試，與產(chǎn)品實際商業(yè)生產(chǎn)的工藝參數(shù)、質(zhì)量指標(biāo)作對比，如不在工藝參數(shù)、質(zhì)量指標(biāo)要求范圍內(nèi)，則說明介質(zhì)應(yīng)該更換了，只有對層析介質(zhì)進行及時更換，才能確保生物制品質(zhì)量。本研究結(jié)果顯示，Nuvia S陽離子層析介質(zhì)經(jīng)過100次循環(huán)后動態(tài)載量測試結(jié)果高于起始動態(tài)載量的80%，柱效沒有下降趨勢，陽離子交換層析洗脫峰的ProteinA、HCP、DNA殘留檢測未有增高趨勢，SEC-HPLC純度（聚體、單體）、活性（生物學(xué)活性、結(jié)合活性）以及得率未有下降趨勢;分別以不同上樣量20 g/L（循環(huán)8、48、88次）、40 g/L（循環(huán)9、49、89次）、80 g/L（循環(huán)61、62、63次），不同流速110 cm/h（循環(huán)10、50、92次）、149 cm/h（循環(huán)61、62、63次）、170 cm/h（循環(huán)11、59、93次）進行驗證，陽離子交換層析洗脫峰檢測結(jié)果顯示SEC-HPLC純度（聚體、單體）無明顯變化趨勢，均大于98%，得率均大于85%。這些試驗數(shù)據(jù)均符合CMAB008原液純化工藝及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求。試驗證明，Nuvia S陽離子層析介質(zhì)經(jīng)過100次循環(huán)后還可以保持純化效果，因此暫定該Nuvia S陽離子層析介質(zhì)使用壽命為100次循環(huán)，在商業(yè)生產(chǎn)過程中，對這次試驗中確定的使用次數(shù)進行監(jiān)測和確認。

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