高衛(wèi)鍇 李茂森 李超 黃純楊 劉福童 馮煉 馮小芽 任天寶 李宙文

摘要：為探究不同海拔條件下植煙土壤真菌群落結(jié)構(gòu)特征，以及驅(qū)動(dòng)真菌群落的主要生態(tài)因子，選取3個(gè)不同海拔高度ZL（800 m）、ZS（1 000 m）、ZH（1 200 m）的烤煙成熟期根際土壤，采用18S rRNA高通量測(cè)序?qū)ν寥勒婢M(jìn)行分析。結(jié)果表明，中低海拔土壤pH值和速效養(yǎng)分含量顯著高于高海拔;中低海拔土壤真菌α多樣性顯著低于高海拔土壤;3個(gè)海拔條件下土壤優(yōu)勢(shì)菌門為子囊菌門、擔(dān)子菌門和毛霉菌門等，其中，1 200? m海拔擔(dān)子菌門的豐度較800 m海拔提高了100.00%;1 000 m海拔捕蟲霉門的相對(duì)豐度相較于1 200 m海拔提高了238.26%;聚類熱圖分析結(jié)果表明，擔(dān)子菌門、Aphelidea與微生物量氮含量呈顯著或極顯著正相關(guān)，與速效鉀含量和土壤溫度呈顯著負(fù)相關(guān);芽枝霉門與pH值呈顯著正相關(guān)，與微生物量碳氮比呈極顯著正相關(guān);捕蟲霉門與堿解氮含量呈顯著負(fù)相關(guān);FUNGuild分析結(jié)果表明，1 000 m海拔土壤腐生營(yíng)養(yǎng)型真菌相對(duì)豐度最高，達(dá)30.79%;1 200 m海拔病理營(yíng)養(yǎng)型真菌豐度最高，達(dá)4.45%?？緹煶墒炱诟H土壤真菌多樣性在不同海拔條件下表現(xiàn)出顯著差異，土壤溫度、速效鉀含量和微生物量氮含量是引起土壤真菌群落結(jié)構(gòu)及多樣性變異的主要生態(tài)因子。

關(guān)鍵詞：植煙土壤;海拔;真菌群落;環(huán)境因子;營(yíng)養(yǎng)類群

中圖分類號(hào)： S154;S572.061? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2022）08-0221-07

海拔是烤煙種植區(qū)域類型選擇的重要影響因素之一[1-2]，海拔高度的變化常常會(huì)導(dǎo)致環(huán)境發(fā)生顯著變化，光、溫、水、土等資源也會(huì)隨之改變，影響土壤的發(fā)育和理化性質(zhì)[3-4]。真菌是土壤微生物的重要組成部分，其多樣性和群落結(jié)構(gòu)與土壤養(yǎng)分轉(zhuǎn)化[5]、土傳病害[6]與植物健康[7]有著直接的關(guān)系。研究真菌在土壤中的結(jié)構(gòu)組成，驅(qū)動(dòng)了土壤微環(huán)境的改良，物種多樣性的維持，以及對(duì)保持生態(tài)平衡具有重要意義[8-10]。貴州省遵義煙區(qū)是我國(guó)主要的烤煙種植區(qū)之一，海拔一般在800～1 300 m之間[11]，土壤微生物與氣候、植被類型及土壤性質(zhì)等密切相關(guān)，而海拔變化往往在較短范圍內(nèi)引起溫度、降水、植被類型和土壤性質(zhì)等生物和非生物因子的顯著變化[12-15]。近年來(lái)，隨著測(cè)序技術(shù)的高速發(fā)展，不同海拔高度條件下土壤微生物變化規(guī)律已有大量的研究，且研究結(jié)果更加的多元化。李敏等對(duì)土壤真菌的研究發(fā)現(xiàn)，1 500 m與1 800 m的松根圍土壤真菌群落結(jié)構(gòu)存在顯著差異，且土壤因子可以顯著影響真菌群落結(jié)構(gòu)[16]。Murugan等對(duì)阿爾卑斯山的研究發(fā)現(xiàn)，高海拔土壤中的真菌數(shù)量高于低海拔土壤[17]。人類活動(dòng)也會(huì)影響微生物的海拔分布狀況[18]。張倩研究發(fā)現(xiàn)，自然條件土壤與水稻土真菌群落組成存在顯著差異[19]。袁雅威研究發(fā)現(xiàn)湖南省張家界煙區(qū)土壤真菌數(shù)量隨著海拔的升高有降低的趨勢(shì)，高海拔地區(qū)植煙土壤的生物活性明顯降低[20]。

土壤微生物是生態(tài)系統(tǒng)過(guò)程中必不可少的參與者，控制著陸地生物圈中最大有機(jī)質(zhì)庫(kù)的周轉(zhuǎn)[15]?；诟咄繙y(cè)序的微生物組學(xué)技術(shù)極大地推動(dòng)了對(duì)土壤中未知微生物類群及功能的認(rèn)識(shí)，尤其是根際微生物多樣性、菌落結(jié)構(gòu)和功能，對(duì)植物營(yíng)養(yǎng)元素吸收機(jī)制研究發(fā)揮了重要的作用[6]?？緹煶墒炱谑怯绊憻熑~質(zhì)量的關(guān)鍵時(shí)期，其中根際微生物群落結(jié)構(gòu)是重要的影響因素之一。因此，研究不同海拔條件下真菌群落時(shí)空特征對(duì)煙株的生長(zhǎng)發(fā)育和物質(zhì)代謝具有重要的意義。本研究通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)結(jié)合FUNGuild數(shù)據(jù)庫(kù)分析貴州省遵義煙區(qū)不同海拔梯度上的土壤真菌群落結(jié)構(gòu)和營(yíng)養(yǎng)類群，通過(guò)研究真菌群落結(jié)構(gòu)和營(yíng)養(yǎng)類群受氣候、環(huán)境因子的調(diào)控機(jī)制，進(jìn)一步明確對(duì)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)海拔格局的認(rèn)識(shí)，有助于更好地預(yù)測(cè)和解析作物成熟期土壤微生物群落的功能屬性或多樣性，也為不同海拔梯度下植煙土壤微生態(tài)調(diào)控提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)區(qū)概況

2020年在貴州省遵義市播州區(qū)下轄鴨溪鎮(zhèn)鴨溪基地單元進(jìn)行取樣，該地區(qū)年平均氣溫14.6 ℃，無(wú)霜期280 d，年降水量為1 043.4 mm，年平均相對(duì)濕度為82%。地形以低山丘陵、崗前緩坡為主，海拔在800～1 200 m之間，土壤以水稻土、山地黃壤為主。主栽烤煙品種為云煙87，在4月中旬進(jìn)行移栽。3個(gè)海拔處理的烤煙大田生育期基本相同。取樣地點(diǎn)共有3處，分別為鴨溪鎮(zhèn)江北咀（海拔 819 m，106°42′51″E，27°27′17″N）;樂(lè)山鎮(zhèn)新華村（海拔1 022.32 m，106°36′47″E，27°36′49″N）;樂(lè)山鎮(zhèn)新土村（海拔1 220 m，106°38′13″E，27°41′3″N）。

1.2 測(cè)定項(xiàng)目與方法

1.2.1 供試土壤與樣品采集

2020年9月1日，在遵義市鴨溪基地單元沿著海拔高度，按200 m高度差進(jìn)行采樣，共3個(gè)樣地，分別為海拔800 m（ZL）、1 000 m（ZS）、1 200 m（ZH）。根據(jù)5點(diǎn)取樣法確定取樣點(diǎn)，將取得的樣品混勻后，送往上海美吉生物公司，對(duì)采集的土壤樣品進(jìn)行真菌多樣性檢測(cè)，剩余土壤風(fēng)干后研磨，進(jìn)行土壤基礎(chǔ)理化性質(zhì)分析。

1.2.2 土壤理化性質(zhì)檢測(cè)

參照《土壤農(nóng)業(yè)化學(xué)分析方法》[21]分析土壤理化性質(zhì)，對(duì)樣品做3次平行測(cè)定。采用三氯甲烷熏蒸-硫酸鉀浸提法測(cè)定微生物量碳氮（MBC、MBN）含量[22]。

1.2.3 土壤真菌多樣性檢測(cè)

土壤DNA提取和PCR擴(kuò)增：使用 E.Z.N.A.Soil DNA Kit試劑盒（OMEGA公司）對(duì)土壤進(jìn)行總DNA提取，利用NanoDrop 2000超微量分光光度計(jì)（賽默飛世爾科技公司）檢測(cè)DNA純度，檢測(cè)合格后用338F和806R引物對(duì) V3～V4 可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增[9]。

IlluminaMiseq測(cè)序：使用瓊脂回收盒回收PCR產(chǎn)物，混合后送往IlluminaMiSeq平臺(tái)進(jìn)行基因序列測(cè)定[9]。

1.3 數(shù)據(jù)分析及統(tǒng)計(jì)

采用Excel 2016分析數(shù)據(jù)，方差分析采用最小顯著性差異法用DPS 16.0軟件分析，熱圖分析根據(jù)物種豐度的相似性進(jìn)行聚類，用R軟件的vegan包繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同海拔條件下植煙土壤理化指標(biāo)

從表1可以看出，ZS處理土壤pH值和有機(jī)碳含量顯著高于其他2個(gè)處理;低海拔土壤（ZS、ZL）溫度顯著高于高海拔（ZH）;土壤堿解氮含量隨著海拔的升高表現(xiàn)為先降低后升高的趨勢(shì)，ZL、ZH處理之間無(wú)顯著差異;ZS處理土壤有效磷含量顯著低于ZL和ZH處理，分別降低32.62%和40.75%。土壤速效鉀含量隨著海拔的升高顯著降低，微生物量氮含量隨著海拔的升高而顯著升高，土壤微生物量碳含量隨著海拔的升高表現(xiàn)出先升高后降低的趨勢(shì)，均達(dá)到顯著差異，土壤微生物量碳氮比變化與其一致。

2.2 不同海拔條件下土壤真菌α多樣性

對(duì)9個(gè)土壤樣本進(jìn)行檢測(cè)，共獲得519 700條有效序列，所有樣本平均OTU數(shù)為204個(gè)，3個(gè)海拔處理的共有OTU數(shù)為120個(gè)，高海拔處理OTU數(shù)量顯著高于低海拔處理（圖1）。

從表2可以看出，Simpson指數(shù)、Shannon指數(shù)、ACE指數(shù)和Chao指數(shù)均在ZL處理和ZH處理之間表現(xiàn)出顯著性差異，其中ZH處理的Shannon、ACE和Chao指數(shù)顯著大于ZS處理，而Simpson指數(shù)呈相反的表現(xiàn)。ZS處理Shannon指數(shù)顯著高于ZL處理，而ACE和Chao指數(shù)無(wú)顯著性差異。

2.3 土壤真菌群落結(jié)構(gòu)分析

2.3.1 不同海拔條件下門水平真菌群落相對(duì)豐度? 研究結(jié)果表明，共獲得27 個(gè)門水平真菌菌群，將平均相對(duì)豐度<1%類群歸為其他，得到 8 個(gè)類群（圖2）。其中相對(duì)豐度較高的菌門分別為子囊菌門、擔(dān)子菌門、毛霉菌門、一種未分類的超類群和捕蟲霉門。

不同海拔高度門水平上土壤真菌豐度表現(xiàn)出差異（圖3），子囊菌門在3個(gè)海拔高度下表現(xiàn)出顯著差異性，其相對(duì)豐度以ZL處理最高，相較于ZS處理提高了7.41%;ZH處理?yè)?dān)子菌門豐度較ZL處理提高了100.00%;ZS處理的捕蟲霉門的相對(duì)豐度相較于ZH處理提高了238.26%。

2.3.2 不同海拔條件下土壤真菌β多樣性

從圖4-a可以看出，對(duì)樣本距離矩陣進(jìn)行聚類分析，構(gòu)建樣本層級(jí)聚類樹后高海拔地區(qū)樣本單獨(dú)聚在一起，中低海拔樣本具有一定的重疊，表明海拔條件在一定區(qū)域內(nèi)改變了植煙土壤真菌群落結(jié)構(gòu)。由圖4-b可以看出，PC1 軸和 PC2 軸的貢獻(xiàn)值分別為57.77%和24.18%。ZL處理樣本點(diǎn)距 ZS處理樣本點(diǎn)較近，說(shuō)明ZL與ZS處理的土壤真菌群落結(jié)構(gòu)具有一定的相似性，ZL處理與ZH處理的距離較遠(yuǎn)，說(shuō)明海拔條件顯著影響了真菌群落結(jié)構(gòu)，且隨著海拔的高度差變大，影響也隨之變大。

2.4 土壤真菌群落與環(huán)境因子的相關(guān)性分析

從圖5可以看出，在門水平上相對(duì)豐度前20名的真菌門類與環(huán)境因子之間的相關(guān)關(guān)系。微生物量氮含量、pH值、溫度和速效鉀含量對(duì)不同海拔條件下真菌群落結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出顯著性影響。其中一種未分類的真核生物與溫度和速效鉀含量呈顯著或極顯著正相關(guān)，與微生物量氮含量呈極顯著負(fù)相關(guān);擔(dān)子菌門則與溫度和速效鉀含量呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，與微生物量氮含量呈極顯著正相關(guān);Aphelidea與速效鉀含量呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，與微生物量氮含量呈顯著正相關(guān);芽枝霉門與pH值和微生物量碳氮比分別呈顯著或極顯著正相關(guān)，捕蟲霉門與堿解氮含量呈顯著負(fù)相關(guān)。

2.5 不同海拔條件下土壤真菌營(yíng)養(yǎng)類型

從圖6可以看出，土壤中可鑒定真菌共存在6種營(yíng)養(yǎng)類型。其中病理-腐生-共生過(guò)渡型豐度在全部樣本中占比最高，達(dá)到19.45%～47.50%。ZS處理腐生營(yíng)養(yǎng)型真菌相對(duì)豐度最高，達(dá)到30.79%，較ZL、ZH處理海拔分別升高了186.77%、8.04%;ZH處理海拔病理營(yíng)養(yǎng)型真菌豐度最高，達(dá)4.45%，相較于ZL、ZS處理分別升高了18.76%、56.61%。

3 討論與結(jié)論

真菌是土壤微生物的主要成員之一[23]，具有廣泛的生物多樣性。真菌具有高度的可塑性，并且能夠適應(yīng)各種不利條件。不僅具備生產(chǎn)多種胞外酶的能力，也能夠分解各種有機(jī)物質(zhì)、土壤成分，從而調(diào)節(jié)土壤碳氮的平衡[24-26]，同時(shí)，土壤真菌也是土壤主要病害來(lái)源，土壤中約70%的病害均來(lái)源于土壤真菌[27]。因此，改變土壤真菌多樣性在改善土壤質(zhì)量和提高農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)生產(chǎn)力的潛在應(yīng)用方面是非常有前途的發(fā)展方向。海拔驅(qū)動(dòng)微生物群落發(fā)生變化的規(guī)律及成因一直以來(lái)都是重要的研究方向，土壤真菌多樣性和群落結(jié)構(gòu)隨海拔的變化呈現(xiàn)多種模式。本研究中，3個(gè)不同海拔高度的土壤真菌Simpson指數(shù)、Shannon指數(shù)、ACE指數(shù)和Chao指數(shù)均表現(xiàn)出顯著性差異，其中高海拔真菌Shannon指數(shù)、ACE指數(shù)和Chao指數(shù)均高于低海拔，Simpson指數(shù)低于低海拔。這與李敏等研究結(jié)果[16]一致，與盛玉鈺等在神農(nóng)架的研究結(jié)果[28]相反，這可能是由于人類活動(dòng)引起的真菌多樣性的變化。目前，眾多研究表明，海拔高度驅(qū)動(dòng)了真菌群落結(jié)構(gòu)及多樣性的變化，本試驗(yàn)中，聚類樹圖和PCA分析均表明，高海拔土壤真菌群落結(jié)構(gòu)與中低海拔之間存在著較大的差異。研究發(fā)現(xiàn)，子囊菌門和擔(dān)子菌門均為3個(gè)海拔高度下植煙土壤的優(yōu)勢(shì)菌群，這與熊涵的研究結(jié)果[29]一致。研究表明，子囊菌門多數(shù)為腐生菌，主要作用是分解植物凋落物和降解土壤中的有機(jī)質(zhì)，本試驗(yàn)中子囊菌門之所以能占比最大，可能是因?yàn)槠錈o(wú)性繁殖能力很強(qiáng)，能產(chǎn)生大量的分生孢子，增長(zhǎng)迅速，使其在數(shù)量上占優(yōu)勢(shì)。本研究發(fā)現(xiàn)，中海拔地區(qū)土壤腐生營(yíng)養(yǎng)型真菌相對(duì)豐度較高，而高海拔地區(qū)土壤病理營(yíng)養(yǎng)型真菌相對(duì)豐度較高，這可能是土壤真菌參與了土壤的有機(jī)質(zhì)、動(dòng)植物分解過(guò)程，真菌能夠分解纖維素、化合物以及參與土壤的氨化作用，對(duì)于植物來(lái)說(shuō)是重要的氮素來(lái)源[29]。真菌群落組成與土壤有效養(yǎng)分具有親密的關(guān)系，土壤 pH 值作為影響植物群落組成的主要因素，可以通過(guò)改變植物群落結(jié)構(gòu)調(diào)控真菌群落結(jié)構(gòu)。土壤pH值和養(yǎng)分含量的變化規(guī)律被認(rèn)為是土壤真菌群落的主要調(diào)節(jié)者。王媛媛等研究吉林省的玉米土壤發(fā)現(xiàn)，土壤真菌群落多樣性與pH值顯著相關(guān)[30]。本研究發(fā)現(xiàn)擔(dān)子菌門、Aphelidea與微生物量氮含量有顯著或極顯著正相關(guān)關(guān)系，與速效鉀含量呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系;芽枝霉門與pH值表現(xiàn)出顯著的正相關(guān)關(guān)系，捕蟲霉門與堿解氮含量呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系。孫海等研究發(fā)現(xiàn)，擔(dān)子菌門、子囊菌門等與土壤pH值、速效鉀含量、總氮含量、微生物量氮含量等有顯著關(guān)系[31]。董林林等對(duì)人參根際真菌群落的研究發(fā)現(xiàn)，pH值與座囊菌綱和Alatospora的豐度顯著相關(guān)，速效鉀含量與座囊菌綱、Alatospora、毛霉目的豐度顯著相關(guān)，土壤總氮含量與糞殼菌綱、毛霉目的豐度顯著相關(guān)[32]。

作為烤煙種植區(qū)域的重要影響因素之一，海拔高度對(duì)植煙土壤的理化性質(zhì)及微生態(tài)環(huán)境有顯著影響。本研究發(fā)現(xiàn)，海拔升高引起了土壤速效鉀含量的降低，同時(shí)造成了土壤微生物量碳氮比的失衡，土壤病理營(yíng)養(yǎng)型真菌相對(duì)豐度升高，這些因素可能給烤煙生長(zhǎng)帶來(lái)不利的影響。生物炭作為一種土壤改良劑，在土壤微生態(tài)調(diào)控、固碳培肥等方面具有良好的效應(yīng)。馮慧琳等研究發(fā)現(xiàn)，施加生物炭可以顯著提高土壤速效養(yǎng)分含量，提升土壤碳氮比，顯著降低致病菌的相對(duì)豐度，減少烤煙病害[9，33]。Tianvao等研究表明，通過(guò)施用生物炭改善土壤理化特性從而構(gòu)建土壤真菌群落結(jié)構(gòu)[34-35]。目前，這些研究大多在同一海拔梯度上進(jìn)行，而關(guān)于施加生物炭對(duì)不同海拔梯度下植煙土壤理化性質(zhì)和微生態(tài)環(huán)境的影響有待于進(jìn)一步研究。

不同海拔梯度下植煙土壤真菌群落結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出一定的差異，高海拔真菌多樣性顯著高于低海拔;相關(guān)性分析結(jié)果表明，土壤溫度、速效鉀和微生物量氮含量是驅(qū)動(dòng)真菌群落結(jié)構(gòu)在海拔梯度上變化的主要驅(qū)動(dòng)因子;海拔高度的變化引起了環(huán)境因子的變異，進(jìn)而構(gòu)建了不同的土壤真菌群落結(jié)構(gòu)，本試驗(yàn)為不同海拔梯度條件下土壤微生態(tài)調(diào)控提供了理論參考。

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