江秀玲 胡有根 彭建明 羅雪 蘇蘭娣 湯元杰

【摘要】目的：探討 miR-21對食管癌細胞增殖及凋亡影響與分子機制。方法：將食管癌細胞分成 miR-21- NC 組、miR-21組、LY294002組、LY294002+miR-21組、對照組5組，檢測 miR-21表達情況及食管癌細胞系中 PI3K、Akt 與 p-Akt 表達情況。結(jié)果：食管癌細胞系的 miR-21相對表達量明顯高于正常食管上皮細胞系（P<0.05）; miR-21組在 miR-21相對表達量高于對照組、miR-21-NC 組（P<0.05）;在 Eca-109細胞增殖率上，結(jié)果顯示而 miR-21組的細胞增值率要遠比對照組、miR-21-NC 組的指標更高，對比差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）; LY294002組在 Eca-109細胞增值率上比對照組低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）; LY294002+miR-21組在 Eca-109細胞增值率上比 LY294002組明顯更高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;miR-21組細胞中 PI3K、p-Akt 相對表達量均高于對照組， LY294002組 PI3K、p-Akt 相對表達量均低于對照組（P<0.05）。結(jié)論： miR-21可通過調(diào)節(jié) PI3K/Akt 信號通路，促進食管癌細胞的增殖及凋亡，為食管癌靶向治療提供一定理論依據(jù)。

【關(guān)鍵詞】miR-21;食管癌;細胞增殖;凋亡; PI3K/Akt 信號通路

【中圖分類號】R735.1【文獻標識碼】A 【文章編號】2096-5249（2022）05-0015-03

食管癌現(xiàn)階段有著越來越高的發(fā)病率，該病隸屬食管腫瘤病變[1]。近年來隨著醫(yī)學技術(shù)的不斷發(fā)展，食管癌發(fā)病率雖然有所降低，經(jīng)手術(shù)及放化療治療提升療效，但是患者的預后仍舊比較差[2]。在分子生物技術(shù)發(fā)展背景下，醫(yī)學工作者積極尋求針對有效抑制食管癌細胞增殖及凋亡的治療靶點，目前根據(jù)相關(guān)研究得知，顯示微小RNA（microRNA）可引起食管癌的發(fā)生發(fā)展。 miR-21作為在食管癌病變組織、血清、唾液中高表達的物質(zhì)，可促進食管癌細胞的增殖及凋亡，并且在后續(xù)的相關(guān)研究中也顯示，miR-21對 PI3K/Akt 信號通路也有一定的影響[3]，但是具體作用機制上尚且存在一些爭議，故本次研究就此進行了具體的探討，報告如下。

1 資料與方法

1.1一般資料

試驗材料為人正常食管上皮細胞系、食管癌細胞系。試劑與材料：培養(yǎng)基、培養(yǎng)板;抑制劑;反轉(zhuǎn)錄酶;鼠抗人磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）、蛋白激酶B（Akt）、磷酸化蛋白激酶B（p-Akt）多克隆抗體;低溫高度離心機、熒光定量 PCR儀器;流式細胞儀; miR-21、miR-21- NC及引物序列。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)

取正常食管上皮細胞系、食管癌細胞系，室溫下緩慢解凍，將解凍后的細胞系加胰蛋白酶，加入物質(zhì)后制備為細胞懸浮液，制成的懸浮液進一步將其接種至培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基的組成成分為10%胎牛血清+100mg/mL 鏈霉素+100 U/mL 青霉素，接種的培養(yǎng)基則是置入到培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，培養(yǎng)箱的環(huán)境控制為溫度37℃，5%CO2、濕度適宜。為了確保培養(yǎng)效果，培養(yǎng)基需要定時的更換，更換頻率為2 d一次，期間需要注意對培養(yǎng)瓶內(nèi)的基本情況檢查，當發(fā)現(xiàn)瓶底的細胞數(shù)量繁殖至覆蓋瓶底85%的時候即可向其中加入胰蛋白酶做進一步處理，具體是實施細胞培養(yǎng)及凍存處理。

1.2.2 miR-21表達水平檢測

取正常食管上皮細胞系、食管癌細胞系，提取細胞總 RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶轉(zhuǎn)錄獲得 cDNA，獲得上下游備用的引物，對于上游引物涵蓋如下的序列：5-AGCTGTACAAGTAAGTTATCAAATCCTGCCTGACTG-3。下游引物則是涵蓋以下序列：5-GGGAGAG GGGCTTAGTCCTCCCTCCATACTGCTG3。經(jīng)最大二階導數(shù)法得出細胞中歐 miR-21相對表達量。反應(yīng)總體系為50μL，其中模板cDNA 為1μL，上下游引物含量均各自為2μL，混合液量為12μL，其中加無菌的蒸餾水到總量為50μL。反應(yīng)的條件主要是95℃溫度下持續(xù)5 min預變形處理，之后在67℃溫度下持續(xù)延伸15 s，維持連續(xù)40循環(huán)的反應(yīng)處理。

1.2.3對pre-miR-21、pre-miR-21-NC慢病毒載體的構(gòu)建方法

構(gòu)建上應(yīng)用方式，具體是通過TRIzolreagent的方式，將人食管癌細胞中Eca-109的RNA提取出來，之后就將提取出的RNA 反轉(zhuǎn)錄呈為cDNA。合成與食管癌細胞Eca-109嵌合miRNA 序列，將不能相匹配的 miR-21-NC序列用作陰性的對照指標。 miR-21-NC 的引物主要是：5-GTT CTT GCTTCG GCA GAA CATATA CTA AAA TTG GAA CGA TAC AGA GAA GATTAG CAT GGC CCC TGC GCAAGG ATG ACA CGC? AAA ATC GTG AAG CGT TCCACA TTT TT-3。序列均是攜帶有FITC的標識，這樣主要是方便對轉(zhuǎn)染的效率進行鑒定。根據(jù)序列以擴增miR-21，經(jīng)DNA 產(chǎn)物純化試劑盒做純化處理，借助T4 DNA 連接酶對miR-21序列、GV254序列、miR-21-NC序列做酶切處理及酶接處理，根據(jù)以上的處理，建構(gòu)慢病毒載體為備用。

1.2.4細胞分組及處理

獲取對數(shù)細胞便于后續(xù)接種處理，接種的部位為包括24孔的培養(yǎng)板，待細胞融合度達到90%的時候分成以下5組： miR-21-NC組（慢病毒載體pre-miR-21- NC 和 Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染液轉(zhuǎn)染細胞）、 miR-21組（慢病毒載體pre-miR-21和 Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染液轉(zhuǎn)染細胞）、LY294002組（75μmol / L LY294002培養(yǎng)細胞）、LY294002+miR-21組（75μmol / L LY294002培養(yǎng)細胞+慢病毒載體pre-miR-21轉(zhuǎn)染細胞）、對照組（DMSO 培養(yǎng)細胞）。上述分組上為確保數(shù)據(jù)科學性，均是選擇9孔，給予各組相應(yīng)的細胞載體配合干預，進行細胞轉(zhuǎn)染，選擇對應(yīng)樣品。針對對照組予以 DMSO 培養(yǎng)細胞，對細胞進行處理上，均是持續(xù)進行48h的培養(yǎng)，在48h 的培養(yǎng)結(jié)束后就可做清洗處理，經(jīng)過清洗的培養(yǎng)基經(jīng)流式細胞儀進行測定，測定的為顏色綠色的熒光細胞，并且還要進一步進行處理，處理內(nèi)容為獲得最合適轉(zhuǎn)染濃度數(shù)值范圍，以此作為參照。

1.2.5 MTT試驗測定Eca-109細胞增殖情況

培養(yǎng)時間已滿就可以去除培養(yǎng)板做接下操作，主要是將原培養(yǎng)基去掉，對每一孔均是向內(nèi)部加入 DMEM培養(yǎng)液100μL，在避光條件下加 MTT溶液10μL，將溶液放到合適的培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)箱環(huán)境的溫度主要是37℃，其中涵蓋濃度為5%的 CO2，持續(xù)放置4 h將細胞培養(yǎng)板取出，對各孔添加的培養(yǎng)液清除完全，清除的各孔則予以150μL 的二甲基亞砜溶液充填到清除的各孔當中，進行持續(xù)振蕩處理，到其中紫色結(jié)晶完全的被溶解結(jié)束，利用酶標儀在570 nm 波長的范圍之間，對各個孔吸光度情況進行精確測定。通過酶標儀以570 nm 波長范圍測定各孔吸光度情況，對測定情況記錄，并且以對照組細胞增殖100%對各組細胞增值率計算。

1.2.6檢測食管癌細胞系中PI3K、Akt與p-Akt表達情況

在食管癌細胞系內(nèi)，混合細胞裂解液，加入的量結(jié)合需求確定，經(jīng)裂解液的融合使得其中總蛋白泌出，對蛋白樣品做加熱以及煮沸處理，同時還做進一步離心，獲取蛋白樣品，經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)模后加入鼠抗人 PI3K、 Akt、p-Akt 多克隆抗體，充分混合置入大合適條件下存儲，具體在溫度4℃環(huán)境下過夜，之后則是置于 37℃溫度下1小時，其中混合發(fā)光液做顯影獲得所需影像信息，對灰度值測定，測定的方法主要是用軟件，進行表達情況的觀察，主要觀察 PI3K、Akt、p-Akt 蛋白水平，最終結(jié)果通過多次測定結(jié)果平均值表示。

1.3統(tǒng)計學分析

采用 SPSS 21.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)處理。計量資料用（±s）表示，使用 t檢驗。以 P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1正常食管上皮細胞系、食管癌細胞系中的miR-21相對表達量

miR-21表達情況上，同正常食管上皮細胞系進行對比，食管癌細胞中的miR-21數(shù)值明顯更高，存在組間差異（P<0.05），見表1。

2.2各組食管癌細胞系miR-21相對表達量

miR-21-NC組、LY294002組與對照組在miR-21相對表達量上比較，差異無統(tǒng)計學意義（P<0.05）;miR-21組與LY294002+miR-21組在miR-21相對表達量高于對照組、miR-21-NC 組與LY294002組（P<0.05），見表2。2.3 MTT實驗測定人食管癌細胞Eca-109增殖情況MTT 的試驗測定指標上，表現(xiàn)為Eca-109細胞增值率上，對照組、 miR-21-NC 組比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）;而miR-21組的細胞增值率要遠比對照組、miR-21-NC組的指標更高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;LY294002組在Eca-109細胞增值率上比對照組低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;LY294002+miR-21組在 Eca-109細胞增值率上比 LY294002組明顯更高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見表3。

2.4各組食管癌細胞系PI3K、Akt、p-Akt表達情況

miR-21組細胞中PI3K、p-Akt表達水平均高于對照組， LY294002組PI3K、p-Akt表達水平要較對照組的水平更低（P<0.05），miR-21-NC 組、LY294002+miR-21組在PI3K、Akt、p-Akt表達水平上均與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）見表4。

3? 討論

食管癌主要分成食管鱗癌及食管腺癌，主要由亞硝酸鹽及遺傳等因素所致，近年來研究表明miR-21同食管癌發(fā)生發(fā)展、預后有緊密聯(lián)系[4-5]。張瑩等[6]的研究中，探討miR-21對食管癌細胞增殖和凋亡影響及分子機制，在研究結(jié)果中，發(fā)現(xiàn)細胞中P13K、p-Akt數(shù)值上，表現(xiàn)為LY294002+miR-21組要比于LY294002組明顯更高，這一結(jié)果主要是提示miR-21通過對P13K/Akt調(diào)節(jié)，引導信號的表達，這樣就為食管癌細胞大量增殖提供基礎(chǔ)，同時也對癌細胞凋亡進行阻止，使得食管癌長期存在。 miRNA作為一種內(nèi)源性調(diào)控因子，其中的一個重要成員就是miR-21，miR-21可見機體多個部位的表達，多個組織中均可見這一因子，該因子關(guān)系到機體生長發(fā)育、細胞分裂、組織分化等等，調(diào)節(jié)人體代謝。國內(nèi)外的研究中也已經(jīng)正式，對于食管癌的患者， miR-21參與細胞分裂、增殖以及凋亡的全程，但是具體關(guān)于參加增殖及凋亡的機制尚不明確[7-8]。在本研究中，顯示食管癌細胞系中，在miR-21表達上明顯較正常食管上皮細胞更高，提示在進行食管癌的診斷上，臨床中可以將miR-21作為關(guān)鍵診斷靶點。分析原因主要是miR-21是引起食管癌增殖及轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵通路，若miR-21表達量減少使得食管癌細胞也可發(fā)生凋亡，因此miR-21也是重要的治療靶點。

食管癌屬于多基因以及多因素引起的消化系統(tǒng)腫瘤疾病，關(guān)于疾病的病因尚且不明確，在相關(guān)的研究中，顯示食管癌的患者上調(diào)的miR-21的作用在于提供細胞增殖以及轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)，此外也能對食管癌細胞凋亡進行有效抑制，屬于關(guān)鍵過程[9]。而被 miR-21作用的細胞則是Eca-109，顯示在食管癌細胞中 Eca-109的 miR-21表達值明顯降低，這樣可進一步引起人食管癌細胞Eca-109凋亡[10]。本次研究的結(jié)果中，顯示經(jīng)慢病毒載體的構(gòu)建，在載體pre-miR-21上，能夠同時被轉(zhuǎn)染至食管癌細胞Eca-109，結(jié)果表明 LY294002組在 Eca-109細胞增值率上比對照組低， LY294002+miR-21組在 Eca-109細胞增值率上比 LY294002組明顯更高，根據(jù)這一結(jié)果，能夠發(fā)現(xiàn)miR-21是致癌的重要轉(zhuǎn)錄基礎(chǔ)，屬于食管癌持續(xù)增殖的關(guān)鍵，食管癌可在此基礎(chǔ)上持續(xù)發(fā)生及發(fā)展。

本次研究結(jié)果表明， miR-21組在miR-21相對表達量非常高，此外miR-21組的細胞內(nèi)PI3K、p-Akt 在相對的表達量指標上明顯更低對照組表達量，表明miR-21在食管癌細胞的增殖及凋亡過程中發(fā)揮重要作用。 PI3K/Akt 信號通路也是腫瘤發(fā)生的關(guān)鍵，在既往的研究中，發(fā)現(xiàn)PI3K/Akt 信號通路在一些常見疾病如卵巢癌、小腸癌等的組織部位呈現(xiàn)高表達情況，并且細胞活化明顯，起到的一個很重要的作用是誘導腫瘤增殖、侵襲以及凋亡[11]。在現(xiàn)有的研究中，結(jié)果顯示miR-21可調(diào)控多種靶基因物質(zhì)的表達，諸如PDCD4、PTEN、TIMP3、 PI3K、AKT等，其中PTEN 屬于PTEN/PI3K/Akt 信號通路重要的組成部分，關(guān)鍵性作用在于明顯的抑制患者腫瘤細胞信號通路PI3K/P-Akt 表達，如此對抑制腫瘤細胞增殖的價值突出，避免腫瘤轉(zhuǎn)移以及傾斜情況的發(fā)生[12]。而對于miR-21若是出現(xiàn)過表達情況，可增強PI3K/Akt 信號通路，這樣使得食管癌細胞也相應(yīng)的增殖及病變出現(xiàn)持續(xù)進展。

綜上所述，在食管癌的發(fā)生發(fā)展中，關(guān)鍵機制在于miR-21通過調(diào)節(jié)PI3K/Akt信號通路，如此為食管癌細胞發(fā)生及繁殖奠定基礎(chǔ)，并且還對細胞凋亡起到抑制的作用，如此提供給疾病治療重要靶點。

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（收稿日期：2021-10-23）