高素素，王馨，王亞玲 ，陳春英

1國(guó)家納米科學(xué)中心，北京 100190

2廣東粵港澳大灣區(qū)國(guó)家納米科學(xué)創(chuàng)新研究院，廣州 510700

3中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100049

1 引言

新型冠狀病毒(COVID-19)在全球范圍內(nèi)的大流行，截止2022年2月24日已有超過(guò)4.3億例確診病例，其中包括590多萬(wàn)例死亡病例，共接種疫苗超過(guò)84億針次。冠狀病毒是一大類病毒家族，其中一些可導(dǎo)致人類的呼吸系統(tǒng)疾病，從輕微的感冒到嚴(yán)重的急性呼吸道感染及其他并發(fā)癥，如2003年首次發(fā)現(xiàn)的嚴(yán)重急性呼吸綜合征(SARS)，2012年發(fā)現(xiàn)的中東呼吸綜合征(MERS)以及2019年至今由SARS-CoV-2冠狀病毒引發(fā)的COVID-19大流行。冠狀病毒(CoV)可分為四類：α-CoV、β-CoV、γ-CoV與δ-CoV，目前已知的所有能導(dǎo)致人類疾病的冠狀病毒都屬于α與β-CoV，包括輕癥狀株HCoV-OC43、HCoV-HKU1、HCoV-229E、HCoV-NL63和嚴(yán)重癥狀株MERS-CoV、SARS-CoV、SARS-CoV-2，而γ與δ-CoV主要感染禽類動(dòng)物[1]。冠狀病毒是一種正義RNA病毒，因其具有日冕狀外觀而得名，其基因組一般為27-32 kb，如圖1所示，主要編碼四種結(jié)構(gòu)蛋白：刺突蛋白(S，Spike Protein)、核衣殼蛋白(N，Nucleocapsid Protein)、膜蛋白(M，Membrane Protein)與包膜蛋白(E，Envelope Protein)[2]。SARSCoV和SARS-CoV-2通過(guò)將其S蛋白上的受體結(jié)合域(RBD)與宿主細(xì)胞表面受體血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2(ACE2，Angiotensin Converting Enzyme 2)結(jié)合而感染人體[3]。由于具有介導(dǎo)病毒與宿主細(xì)胞的吸附和融合，誘導(dǎo)宿主免疫反應(yīng)和病毒中和抗體的作用，S蛋白是疫苗設(shè)計(jì)中的重要抗原特異性靶點(diǎn)，包括全長(zhǎng)S蛋白、S1亞基、RBD和S2亞基。

圖1 冠狀病毒結(jié)構(gòu)[3]

目前，疫苗作為最強(qiáng)有力的技術(shù)平臺(tái)，極大地降低了人類冠狀病毒在世界范圍內(nèi)的傳播率和致死率，主要包括傳統(tǒng)的減毒活疫苗、滅活疫苗、亞單位疫苗與新型的核酸疫苗、基因工程亞單位疫苗、多糖疫苗和基因工程載體活疫苗。然而，SARS-CoV-2基因組的一些適應(yīng)性突變有可能改變其致病潛能，從而增加傳播能力或疾病嚴(yán)重程度。目前，備受關(guān)注的SARS-CoV-2變異株(Variants of concern，VOC)包括Alpha、Beta、Gamma、Delta和Omicron，其流行病學(xué)特征、傳播性和免疫逃逸變化還需進(jìn)一步研究[4]。伴隨著病毒不斷的突變和進(jìn)化，上市疫苗在應(yīng)對(duì)SARS-CoV-2變異株的過(guò)程中還需更新?lián)Q代。盡管疫苗在預(yù)防人類冠狀病毒感染方面取得了初步成功，但對(duì)于一些免疫原性較差的滅活疫苗和亞單位疫苗來(lái)說(shuō)，佐劑是其中不可或缺的關(guān)鍵成分。佐劑，即免疫增強(qiáng)劑，能夠提升機(jī)體對(duì)于抗原免疫響應(yīng)的速度、強(qiáng)度、廣度與持久度，從而減少抗原劑量與注射次數(shù)。然而，目前傳統(tǒng)的商業(yè)化佐劑面臨諸多問(wèn)題，比如無(wú)法誘導(dǎo)足夠強(qiáng)的免疫響應(yīng)，具體作用機(jī)理尚不明確，生物相容性有待繼續(xù)考量等。近年來(lái)，隨著納米技術(shù)的興起，無(wú)機(jī)納米顆粒被開(kāi)發(fā)為對(duì)抗各種病毒的疫苗佐劑。通過(guò)材料合成與表面化學(xué)修飾，可精確調(diào)控?zé)o機(jī)納米顆粒的組成、大小、形貌、親疏水性、表面電荷、均勻性與分布等理化性質(zhì)，以有效刺激體液和細(xì)胞免疫，提高疫苗效力[5]。

本文主要綜述了近年來(lái)用于人類冠狀病毒疫苗的無(wú)機(jī)納米佐劑，以及無(wú)機(jī)納米佐劑在人類冠狀病毒疫苗免疫中的增效機(jī)制，并提出針對(duì)COVID-19疫苗的無(wú)機(jī)納米佐劑設(shè)計(jì)建議，為后續(xù)新型無(wú)機(jī)納米佐劑與疫苗開(kāi)發(fā)提供新的見(jiàn)解。

2 無(wú)機(jī)納米佐劑的設(shè)計(jì)

佐劑是疫苗中的重要成分。在抗病毒免疫應(yīng)答的過(guò)程中，無(wú)機(jī)納米佐劑可作為儲(chǔ)存抗原的臨時(shí)倉(cāng)庫(kù)，穩(wěn)定抗原構(gòu)象并延長(zhǎng)抗原暴露時(shí)間；有助于免疫細(xì)胞的招募和成熟；促進(jìn)抗原的攝取、呈遞和交叉呈遞；選擇性誘導(dǎo)不同類型的免疫反應(yīng)[6]。金屬元素在免疫應(yīng)答過(guò)程中的關(guān)鍵作用以及在癌癥免疫治療中的重要應(yīng)用越來(lái)越得到人們的關(guān)注。金屬離子在免疫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中的功能不只限于第二信使，例如，錳離子和鋅離子作為先天免疫激活劑的機(jī)制研究已被報(bào)道[6]。隨著疫苗制劑臨床研究的深入，傳統(tǒng)鋁佐劑也正在面臨著關(guān)鍵技術(shù)和產(chǎn)品性能問(wèn)題，其理化性質(zhì)不均一，免疫保護(hù)作用機(jī)制不清晰，極大地限制了疫苗制劑的穩(wěn)定性和免疫功效。隨著人們對(duì)金屬免疫的認(rèn)識(shí)增加，目前除了長(zhǎng)期應(yīng)用的鋁佐劑外，其他無(wú)機(jī)金屬元素及其納米顆粒也因其獨(dú)特的性質(zhì)發(fā)展成為具有潛力的候選佐劑。目前，研究人員開(kāi)發(fā)了不同類型的無(wú)機(jī)納米佐劑用于抗冠狀病毒疫苗，主要包括鋁鹽佐劑、錳佐劑、鈣佐劑、硅基佐劑與金佐劑等。

2.1 鋁鹽佐劑及含鋁復(fù)合佐劑

鋁鹽佐劑是美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準(zhǔn)的第一個(gè)人用疫苗佐劑，目前在預(yù)防人類冠狀病毒感染疫苗中應(yīng)用廣泛。鋁佐劑一般通過(guò)以下途徑增強(qiáng)機(jī)體的免疫反應(yīng)：作為儲(chǔ)存抗原的臨時(shí)倉(cāng)庫(kù)，緩慢而持續(xù)地釋放抗原；激活并促進(jìn)CD4+T細(xì)胞分化為T(mén)h2型細(xì)胞；促進(jìn)抗原呈遞等[7]。在SARSCoV-2亞單位疫苗的開(kāi)發(fā)過(guò)程中，需要面對(duì)兩個(gè)挑戰(zhàn)。一是制備重組蛋白亞基，主要激發(fā)中和性抗體而不是非中和性抗體，避免非中和性抗體可能導(dǎo)致的抗體依賴性增強(qiáng)效應(yīng)(ADE，Antibody Dependent Enhancement)。二是添加佐劑，克服亞單位疫苗免疫原性較差的問(wèn)題。傳統(tǒng)鋁佐劑通常誘導(dǎo)增強(qiáng)的Th2免疫響應(yīng)，但Th1免疫響應(yīng)不足。因此，需要開(kāi)發(fā)各種類型的疫苗佐劑，如含鋁復(fù)合佐劑，誘導(dǎo)更平衡的Th1/Th2免疫響應(yīng)，提高疫苗效力[8]。

Darrell J.Irvine教授等通過(guò)磷酸鹽介導(dǎo)的結(jié)合，將SARS-CoV-2受體結(jié)合域(RBD)和分子佐劑聯(lián)合錨定到明礬顆粒上，可促進(jìn)疫苗成分共同輸送到淋巴結(jié)，從而引起協(xié)同的體液免疫。在免疫原蛋白R(shí)BD上位點(diǎn)特異性地引入磷酸絲氨酸(pSer)肽標(biāo)簽，可通過(guò)配體交換反應(yīng)有效結(jié)合到氫氧化鋁表面，減緩抗原清除，刺激小鼠生發(fā)中心反應(yīng)，并導(dǎo)致中和抗體滴度顯著增加。進(jìn)一步在pSer-RBD中添加含磷酸鹽的CpG或皂苷佐劑，可與明礬協(xié)同作用，增強(qiáng)疫苗的免疫原性，協(xié)同誘導(dǎo)小鼠與恒河猴體內(nèi)對(duì)SARS-CoV-2的中和反應(yīng)與更平衡的Th1/Th2型免疫響應(yīng)[9]。

一般情況下，鋁佐劑只附著于細(xì)胞膜表面，不進(jìn)入樹(shù)突細(xì)胞，造成細(xì)胞內(nèi)抗原呈遞和處理的缺失。并且，抗原在經(jīng)過(guò)溶酶體加工后通過(guò)主要組織相容性復(fù)合體II(MHC-II)呈現(xiàn)，而不在MHC-I介導(dǎo)的細(xì)胞免疫中交叉呈現(xiàn)，限制了T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。馬光輝課題組成功合成了一種明礬顆粒穩(wěn)定的Pickering乳液(PAPE)，作為基于重組蛋白(S蛋白和RBD)的COVID-19新型疫苗佐劑(圖2)。與傳統(tǒng)的鋁佐劑對(duì)照組相比，PAPE誘導(dǎo)的抗原特異性抗體滴度提高了6倍以上，分泌IFN-γ的T細(xì)胞增加了3倍，表明其同時(shí)具有有效的體液和細(xì)胞免疫激活作用。鋁佐劑具有可獲得性廣的優(yōu)勢(shì)，其微凝膠能夠在油/水中間相自發(fā)吸附得到PAPE佐劑，并能夠迅速吸附抗原，為開(kāi)發(fā)一種安全、可獲得、高效的COVID-19疫苗佐劑提供了思路[10]。

圖2 PAPE的設(shè)計(jì)策略[10]

管軼等人開(kāi)發(fā)了一種有效的、基于蛋白質(zhì)亞單位的SARS-CoV-2候選疫苗，該疫苗(StriFKFH002C)由穗狀胞外結(jié)構(gòu)域蛋白(StriFK)和新型的氮二膦酸鹽修飾的鋅鋁混合佐劑(FH002C)組成。FH002C中含有一種臨床上用于治療骨質(zhì)疏松癥的藥物活性成分——利塞膦酸鹽。研究人員在三個(gè)動(dòng)物模型中系統(tǒng)評(píng)估了StriFK-FH002C的免疫原性和保護(hù)效果。接種疫苗后，小鼠、倉(cāng)鼠和食蟹猴體內(nèi)產(chǎn)生的中和抗體滴度比從COVID-19恢復(fù)期個(gè)體分離的血漿中觀察到的抗體滴度高出30至250倍。與臨床上被許可用于戊型肝炎病毒和人乳頭瘤病毒疫苗中的傳統(tǒng)鋁佐劑(Al001)相比，該疫苗能夠同時(shí)誘導(dǎo)小鼠體內(nèi)Th1和Th2極化輔助T細(xì)胞免疫響應(yīng)。在重現(xiàn)人類COVID-19疾病的動(dòng)物模型倉(cāng)鼠中，接種StriFK-FH002C疫苗可提供保護(hù)性免疫，預(yù)防SARS-CoV-2感染、發(fā)病和傳播(圖3)[8]。

圖3 StriFK-FH002C和StriFK-Al001疫苗三次免疫可保護(hù)倉(cāng)鼠免受鼻內(nèi)SARS-CoV-2感染

除此之外，研究表明，氫氧化鋁與CpG佐劑在SARS-CoV-2 RBD疫苗中聯(lián)合使用，能夠增強(qiáng)RBD的免疫原性，在青年和老年小鼠中產(chǎn)生更高的中和抗體滴度，比單獨(dú)使用氫氧化鋁增加80倍，其誘導(dǎo)的抗野生型SARS-CoV-2和B.1.351(beta)變異株的中和抗體血清濃度與已獲批的輝瑞B(yǎng)NT162b2 mRNA疫苗誘導(dǎo)的抗體濃度相當(dāng)。并且，佐劑的聯(lián)合使用能夠協(xié)同提高小鼠體內(nèi)細(xì)胞因子和趨化因子的產(chǎn)生，增強(qiáng)樹(shù)突細(xì)胞依賴的記憶T細(xì)胞激活，且CpG吸附在氫氧化鋁表面形成更易于有效內(nèi)化的復(fù)合物，促進(jìn)TLR9的激活[11]。

鋁佐劑在歷史上的使用中顯現(xiàn)出了良好的生物安全性，相關(guān)研發(fā)技術(shù)更為成熟，但其免疫刺激能力有限，還需通過(guò)對(duì)其進(jìn)行表面修飾、性能優(yōu)化、與其他佐劑聯(lián)用等方式，發(fā)展新的設(shè)計(jì)策略，提升其免疫增強(qiáng)效力，尤其是對(duì)細(xì)胞免疫的激活。

2.2 磷酸鈣

磷酸鈣(CaP)得益于其優(yōu)異的生物降解能力、良好的生物相容性、可預(yù)測(cè)的生物代謝途徑、免疫細(xì)胞組織粘附能力，以及激活平衡的Th1/Th2型免疫響應(yīng)的能力，在新型疫苗佐劑的開(kāi)發(fā)中具有良好的發(fā)展前景[12]。目前在歐洲，已有磷酸鈣佐劑被批準(zhǔn)應(yīng)用于臨床上白喉和破傷風(fēng)疫苗的案例[13]。

磷酸鈣首先是一種良好的免疫刺激物質(zhì)遞送載體。一項(xiàng)研究以雞卵溶菌酶(HEL)為抗原模型，發(fā)現(xiàn)相較于直接使用可溶性抗原，利用CaP遞送的蛋白抗原CaP-HEL更容易與B細(xì)胞上的受體結(jié)合，并易被HEL特異性B細(xì)胞內(nèi)化，能靶向并活化抗原特異性B細(xì)胞[14]。同時(shí)，CaP也可以用于遞送其他佐劑。如研究發(fā)現(xiàn)一種參與固有免疫激活的TLR激動(dòng)劑CpG，當(dāng)使用CaP遞送體系時(shí)，樹(shù)突細(xì)胞對(duì)CpG的內(nèi)化率明顯提高，同時(shí)DC的熟化程度和相關(guān)細(xì)胞因子水平(IL-6、TNF-α)也遠(yuǎn)高于直接遞送CpG的對(duì)照組[15]。此外，CaP也是一種適用于鼻腔給藥的疫苗遞送載體。唐?？嫡n題組開(kāi)發(fā)了一種鼻腔給藥的生物礦化膜包覆的嵌合疫苗(BioVaccine)，如圖4[16]。該設(shè)計(jì)采用登革熱病毒嵌合疫苗(ChinDENV2)為原料，通過(guò)沉積的方式，在原始疫苗表面包覆上一層CaP外殼(圖4a)。研究發(fā)現(xiàn)，相較于未經(jīng)包覆的疫苗，CaP外殼能有效地幫助該疫苗粘附在鼻內(nèi)黏膜上，使其在鼻腔內(nèi)的駐留時(shí)間由6 h延長(zhǎng)至24 h。由于CaP外殼的存在還能促進(jìn)APC對(duì)納米疫苗非受體依賴性的攝取，BioVaccine能進(jìn)一步誘導(dǎo)局部黏膜IgA抗體的大量產(chǎn)生，顯著激活鼻腔黏膜免疫。同時(shí)相較于未經(jīng)包覆的ChinDENV2，BioVaccine經(jīng)鼻腔給藥能在生物體內(nèi)同時(shí)誘導(dǎo)更強(qiáng)效的抗病毒體液免疫和細(xì)胞免疫(圖4)。

圖4 鼻腔給藥的磷酸鈣包覆的嵌合疫苗(BioVaccine)

磷酸鈣在作為遞送載體的同時(shí)也展現(xiàn)出了其本身優(yōu)異的免疫刺激效果。磷酸鈣的免疫激活機(jī)理與鋁佐劑有諸多相似之處[12]：(1)磷酸鈣也具有存儲(chǔ)庫(kù)效應(yīng)，可以遞送抗原，維持抗原穩(wěn)定性；(2)磷酸鈣可以激活NLRP3炎性小體，促進(jìn)炎性因子的釋放；(3)磷酸鈣可以促進(jìn)APC熟化，增強(qiáng)抗原呈遞。但與傳統(tǒng)鋁佐劑不同的是，磷酸鈣具有良好的黏膜粘附性，能有效調(diào)控生物體黏膜免疫，并且磷酸鈣和抗原組成核殼結(jié)構(gòu)后能有效誘導(dǎo)系統(tǒng)性細(xì)胞免疫。由此可見(jiàn)鈣鹽佐劑有可能是繼鋁鹽之后，免疫激活效果更優(yōu)，安全性更好，極具臨床轉(zhuǎn)化潛力的新一代疫苗佐劑。

2.3 錳佐劑

錳是人體必需的一種微量元素，參與人體的生長(zhǎng)發(fā)育、生殖以及神經(jīng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等諸多生理活動(dòng)[17]。同時(shí)，錳離子的存在對(duì)于維持機(jī)體良好的免疫防御功能也有重要的意義。研究發(fā)現(xiàn)，Mn2+與cGAS結(jié)合，能夠提高cGAS對(duì)雙鏈DNA識(shí)別敏感度，增強(qiáng)cGAS的酶活性，增強(qiáng)cGAMP和干擾素基因刺激因子(STING)間的結(jié)合親和力，有助于激活cGAS-STING信號(hào)通路，加強(qiáng)生物體固有免疫[18]。此外，Mn2+本身也是一種有效的先天免疫刺激因子，在無(wú)感染的情況下即可誘導(dǎo)I型干擾素(IFN)和細(xì)胞因子的產(chǎn)生[18]。錳離子上述優(yōu)異的免疫刺激能力，均顯示了其對(duì)增強(qiáng)人體抗病毒免疫的重要意義，具有作為新型疫苗佐劑的巨大潛能。

圖5 預(yù)防新型冠狀病毒的RBD-MnARK納米疫苗作用效果

納米錳佐劑具有成本低、可獲得性廣、穩(wěn)定性好與生物相容性良好的優(yōu)點(diǎn)，并且如MnJ等納米錳佐劑也被證實(shí)在生物體內(nèi)能誘導(dǎo)有效的抗病毒黏膜免疫[21]。由此見(jiàn)得，納米Mn佐劑在新冠病毒疫苗領(lǐng)域具有巨大的臨床開(kāi)發(fā)潛力。

2.4 硅佐劑

抗病毒疫苗通常以生物活性大分子作為抗原，如蛋白質(zhì)、DNA、RNA等，可以通過(guò)特殊的載體進(jìn)行遞送。介孔二氧化硅納米顆粒(MSNs)為抗原的遞送提供了合適的條件：高穩(wěn)定性、高比表面積、易于表面功能化修飾以及大的孔容量。MSNs由無(wú)定形二氧化硅組成，隨著時(shí)間的推移，很容易在體內(nèi)降解，因此在體內(nèi)具有較好的安全性。研究人員制備了具有大孔隙(30 nm)的單分散二氧化硅微球，可通過(guò)傳遞多種細(xì)胞因子(如IL-4)來(lái)調(diào)控免疫系統(tǒng)，比傳統(tǒng)的小孔隙(3.2 nm)二氧化硅微球具有更高的蛋白負(fù)載能力。IL-4負(fù)載的MSNs能夠在體內(nèi)觸發(fā)M2巨噬細(xì)胞極化(圖6)[23]。介孔二氧化硅棒(MSRs)能夠自發(fā)地堆疊形成微孔和三維支架結(jié)構(gòu)。研究人員開(kāi)發(fā)了一種基于MSRs的可注射疫苗，能夠提升全身性Th1和Th2血清抗體和細(xì)胞毒性T細(xì)胞水平[24]。通過(guò)釋放炎癥信號(hào)和佐劑(如單鏈DNA，CpG-ODN等)，樹(shù)突細(xì)胞被招募到三維支架之間的孔隙中。

圖6 MSNs的合成及其在體內(nèi)遞送IL-4的示意圖[23]

除此之外，介孔二氧化硅與其他抗原載體聯(lián)合使用可增強(qiáng)佐劑的免疫活性。例如，層狀雙氫氧化物(LDH)納米顆?？梢员粏魏思?xì)胞衍生樹(shù)突細(xì)胞(MDDC)吸收，并能夠促進(jìn)樹(shù)突細(xì)胞成熟。為了進(jìn)一步增強(qiáng)LDH的免疫佐劑活性，研究人員成功合成了一種具有約210 nm平均直徑的核-殼結(jié)構(gòu)SiO2@LDH納米顆粒，用于乙型肝炎病毒DNA疫苗遞送，可促進(jìn)IFN-γ、IL-6、MHC II和CD86的表達(dá)，從而增強(qiáng)小鼠體內(nèi)免疫響應(yīng)。SiO2@LDH納米顆粒還能促進(jìn)T細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)輔助T細(xì)胞向Th1型免疫應(yīng)答傾斜，并導(dǎo)致NF-kB免疫信號(hào)通路活化[25]。此外，MSNs的理化性質(zhì)易通過(guò)表面配體的偶聯(lián)作用進(jìn)行調(diào)節(jié)，構(gòu)建pH響應(yīng)型疫苗遞送系統(tǒng)[26]。

硅基佐劑，尤其是介孔二氧化硅材料，具有強(qiáng)大的負(fù)載能力和易于表面修飾的特點(diǎn)，為新型佐劑開(kāi)發(fā)和抗原、佐劑共遞送，增強(qiáng)佐劑活性提供更多思路。

2.5 金納米顆粒

金納米顆粒(AuNPs)在生物環(huán)境中的物理化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，具有低毒性、非免疫原性、多功能性的特征和良好的抗原負(fù)載能力，并且可刺激多種免疫細(xì)胞產(chǎn)生促炎因子和細(xì)胞因子(包括IL-1β、TNF-α等)，可同時(shí)作為抗原的遞送載體和疫苗佐劑，有效調(diào)控生物體免疫應(yīng)答。

研究顯示，使用SARS-CoV的刺突蛋白作為抗原模型，單獨(dú)使用AuNPs作為佐劑，雖能促進(jìn)抗原特異性IgG的產(chǎn)生，但是無(wú)法誘導(dǎo)產(chǎn)生足以對(duì)抗病毒感染的免疫屏障，并且不能緩解冠狀病毒導(dǎo)致的肺部嗜酸性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)[27]。通常，結(jié)合多種額外的免疫佐劑，能使AuNPs發(fā)揮更理想的免疫調(diào)節(jié)效果。詹林盛課題組設(shè)計(jì)了一種新型功能化納米金促進(jìn)劑(NanoAu-Cocktail)，能共同遞送OVA抗原肽和TLR9激動(dòng)劑CpG，激活生物體免疫響應(yīng)[28]。NanoAu-Cocktail可使DC總淋巴器官歸巢數(shù)量提高15倍，肝臟引流淋巴結(jié)歸巢數(shù)量提高36倍。該體系顯著增強(qiáng)了DC對(duì)抗原的攝取和交叉呈遞，促進(jìn)Th1型細(xì)胞因子的上調(diào)，為機(jī)體提供有效的抗病毒細(xì)胞免疫。針對(duì)目前的SARS-CoV-2，Kumar等人開(kāi)發(fā)了一種殼聚糖修飾的金納米星，用于遞送攜帶新冠病毒刺突蛋白編碼信息的DNA疫苗(圖7)[29]。通過(guò)鼻腔給藥的模式，該疫苗體系能顯著激活小鼠的呼吸道黏膜免疫，促進(jìn)機(jī)體高水平表達(dá)S蛋白特異性IgG和IgA，且研究中這兩種抗體對(duì)新冠亞種(Wuhan,D614G和beta突變體)的假病毒都表現(xiàn)出了極強(qiáng)的中和能力。同時(shí)，免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)也顯示了在接種該疫苗后，小鼠淋巴結(jié)和肺部的T細(xì)胞和B細(xì)胞都被激活，能有效對(duì)抗新冠病毒感染。

圖7 殼聚糖修飾的金納米星遞送DNA疫苗[29]

此外，通過(guò)在戊型肝炎疫苗(HEVA)中“原位”生長(zhǎng)金納米團(tuán)簇可獲得一種新型疫苗[30]，基于金納米團(tuán)簇的熒光特性，該體系不僅能激活生物體免疫響應(yīng)，還能通過(guò)金納米團(tuán)簇實(shí)時(shí)跟蹤疫苗的動(dòng)態(tài)行為，有助于進(jìn)一步了解疫苗誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的分子機(jī)制。

金納米顆粒能有效遞送抗原，引起生物體所需的免疫響應(yīng)。但研究顯示較高劑量(＞8 mg·kg-1)裸露的金納米顆粒會(huì)在生物體內(nèi)引起嚴(yán)重的毒性反應(yīng)，使用AuNP作為疫苗佐劑或載體的風(fēng)險(xiǎn)和長(zhǎng)期后果仍需進(jìn)一步調(diào)查[31,32]。

3 無(wú)機(jī)納米佐劑在人類冠狀病毒疫苗免疫中的增效機(jī)制

免疫系統(tǒng)在機(jī)體對(duì)抗病毒的過(guò)程中起到了重要的作用(圖8)。疫苗的出現(xiàn)為人類對(duì)抗病毒的過(guò)程提供了極大的助力。疫苗中抗原和佐劑的設(shè)計(jì)為人類對(duì)抗新冠病毒提供了雙重保險(xiǎn)。目前，佐劑在冠狀病毒疫苗中主要起到了以下作用[33]：(1)誘導(dǎo)平衡的Th1和Th2免疫反應(yīng)，阻止嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)；(2)增加中和抗體水平；(3)誘導(dǎo)抗原特異性IgG反應(yīng)；(4)誘導(dǎo)黏膜免疫；(5)提高疫苗的免疫原性，減少疫苗劑量；(6)提高機(jī)體免疫系統(tǒng)的響應(yīng)速度和免疫效果持續(xù)時(shí)間。

圖8 新冠病毒感染及生物體免疫應(yīng)答過(guò)程[34]

3.1 增強(qiáng)體液免疫

中和抗體是機(jī)體對(duì)病毒適應(yīng)性免疫系統(tǒng)中體液免疫的關(guān)鍵部分，通過(guò)與病毒表面抗原結(jié)構(gòu)特異性結(jié)合，發(fā)生中和反應(yīng)，從而阻止病毒感染宿主細(xì)胞。研究表明，許多無(wú)機(jī)納米佐劑具有增加中和抗體水平的基本作用。針對(duì)預(yù)防MERS和SARS的重組蛋白(S蛋白)亞單位疫苗中，接種含有明礬佐劑的疫苗后，小鼠體內(nèi)中和抗體的水平提升了15倍[35]。不同佐劑的聯(lián)合使用可能進(jìn)一步促進(jìn)中和抗體的產(chǎn)生，誘導(dǎo)協(xié)同的免疫保護(hù)反應(yīng)。在小鼠接種聯(lián)合使用明礬佐劑與rASP-1佐劑的RBD疫苗后，其體內(nèi)產(chǎn)生了一種能夠強(qiáng)烈抑制MERS-CoV的中和抗體，通過(guò)抑制RBD與宿主細(xì)胞受體的結(jié)合發(fā)揮作用[36]。研究人員利用含明礬和CpG佐劑的SARS-CoV-2 RBD亞單位疫苗，也可誘導(dǎo)小鼠體內(nèi)產(chǎn)生大量中和抗體。此外，不同的給藥方式影響產(chǎn)生的中和抗體水平，使用鼻內(nèi)或腹腔內(nèi)免疫途徑可能提供血清與黏膜內(nèi)理想的SARS-CoV中和抗體活性[37]。因此，在疫苗開(kāi)發(fā)中，應(yīng)充分考慮并優(yōu)化各種佐劑的組合、配比、混合順序與注射部位等因素，使疫苗激發(fā)最佳的保護(hù)性免疫應(yīng)答。

免疫球蛋白(Immunoglobulins，Ig)是免疫活性分子中的一類，根據(jù)其化學(xué)結(jié)構(gòu)不同，可分為五類，即免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白M(IgM)、免疫球蛋白D(IgD)和免疫球蛋白E(IgE)。其中，IgG約占血清總Ig的75%-80%，是機(jī)體抗感染的“主力軍”，親和力高，能夠促進(jìn)單核巨噬細(xì)胞的吞噬作用，中和病毒。IgA有血清型和分泌型兩種。分泌型IgA是黏膜局部免疫的主要成分，能夠阻止病毒黏附于細(xì)胞表面并中和毒素[38]。研究表明，SARS-CoV滅活疫苗中添加明礬佐劑，能夠提升血清中特異性IgG抗體水平，但不足以刺激IgA抗體水平提升[39]。研究人員比較了含有不同市售明礬佐劑、弗氏佐劑、單磷酰脂質(zhì)A(Monophosphoryl lipid A，MPLA)、Montanide ISA51以及MF59的MERS-CoV RBD亞單位疫苗在體內(nèi)產(chǎn)生的不同免疫反應(yīng)。其中，MF59表現(xiàn)出誘導(dǎo)IgG，IgG1和IgG2a亞型中和抗體的最佳效果[40]。此外，含有CpG-ODN佐劑的SARS-CoV滅活疫苗，能夠促進(jìn)小鼠血清中特異性IgG與IgA抗體的產(chǎn)生，并在黏膜分泌物中檢測(cè)到大量的IgA抗體[37]。研究人員開(kāi)發(fā)了一種通過(guò)鼻腔給藥的殼聚糖修飾的金納米星SARS-CoV-2 DNA疫苗，能夠誘導(dǎo)S蛋白特異性IgG和IgA的高表達(dá)。因此，發(fā)展鋁鹽佐劑之外的無(wú)機(jī)納米佐劑，尤其是黏膜免疫佐劑，誘導(dǎo)血清和黏膜分泌物中抗原特異性IgG和IgA的產(chǎn)生，進(jìn)一步提高免疫應(yīng)答，還需更多探索。

3.2 誘導(dǎo)T細(xì)胞活化，平衡Th1/Th2免疫響應(yīng)

SARS-CoV-2能夠在不暴露于細(xì)胞外環(huán)境的情況下從一個(gè)細(xì)胞傳播到另一個(gè)細(xì)胞，因而單純依賴B細(xì)胞介導(dǎo)體液免疫產(chǎn)生抗體在對(duì)抗新冠感染的過(guò)程中產(chǎn)生的作用始終是有限的。在對(duì)抗病毒感染的過(guò)程中，T細(xì)胞始終扮演著重要的角色。T細(xì)胞在胸腺內(nèi)經(jīng)MHC限制性選擇發(fā)育為CD8+T細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞。在接受抗原刺激后，活化的CD8+T細(xì)胞主要形成細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)，通過(guò)細(xì)胞毒作用對(duì)宿主細(xì)胞進(jìn)行直接殺傷，且CD8+T細(xì)胞更容易分化形成記憶T細(xì)胞；而CD4+T細(xì)胞主要分化為T(mén)h1、Th2、Th17等T效應(yīng)細(xì)胞亞群，Th1細(xì)胞主要通過(guò)產(chǎn)生的細(xì)胞因子介導(dǎo)細(xì)胞免疫，Th2細(xì)胞則主要通過(guò)分泌Th2型細(xì)胞因子，支持B細(xì)胞發(fā)揮功能，介導(dǎo)體液免疫應(yīng)答[41,42]。例如，以淋巴液的分子伴侶蛋白(白蛋白)為模板的錳納米佐劑，通過(guò)對(duì)淋巴結(jié)的自靶向?qū)崿F(xiàn)了新冠RBD抗原和佐劑的共遞送，激活抗病毒的天然免疫通路(STING)，不僅產(chǎn)生了強(qiáng)的中和抗體水平，也激活了強(qiáng)而廣泛的T細(xì)胞免疫(圖9)[22]。

圖9 抗新型冠狀病毒的RBD抗原/錳納米佐劑共遞送疫苗設(shè)計(jì)及免疫增效機(jī)制示意圖[22]

一項(xiàng)研究設(shè)計(jì)了一種氧化石墨烯納米片佐劑(L-GO)[43]，該佐劑能通過(guò)整合素ICAM-1膜定位促進(jìn)DC-T細(xì)胞突觸的形成，作為一種“納米拉鏈”，促進(jìn)DC-T細(xì)胞簇的聚集，為T(mén)細(xì)胞的激活創(chuàng)造一個(gè)穩(wěn)定的微環(huán)境。此外，L-GO能顯著激活小鼠體內(nèi)的SARS-CoV-2刺突蛋白特異性CD8+T細(xì)胞，介導(dǎo)強(qiáng)大的細(xì)胞免疫，為開(kāi)發(fā)有效的COVID-19疫苗提供了一種新的方案。對(duì)于只能激活Th2型免疫響應(yīng)的傳統(tǒng)鋁佐劑，它們一般無(wú)法誘導(dǎo)有效的細(xì)胞免疫，通常可以通過(guò)設(shè)計(jì)復(fù)合佐劑誘導(dǎo)更為平衡的Th1/Th2型免疫響應(yīng)以彌補(bǔ)這一缺陷。北卡羅來(lái)納大學(xué)Rama Rao Amara團(tuán)隊(duì)針對(duì)SARS-CoV-2開(kāi)發(fā)了一種RBD的三聚體，用TLR7/8激動(dòng)劑結(jié)合傳統(tǒng)明礬佐劑組成的Alum-3M-052不僅誘導(dǎo)了比Alum高100倍的中和抗體效價(jià)，而且還顯著誘導(dǎo)CD4+T細(xì)胞Th1型分化，具有更好的抗新冠病毒感染保護(hù)作用[44]。Maria Pino等人同樣采用Alum-3M-052佐劑，發(fā)現(xiàn)其不僅檢測(cè)到Th1細(xì)胞的上調(diào)，還發(fā)現(xiàn)了針對(duì)SARSCoV-2 RBD的CD8+T細(xì)胞的顯著激活[45]。此外，冠狀病毒感染會(huì)誘發(fā)肺部嗜酸性病變，而誘導(dǎo)平衡的Th1/Th2型免疫響應(yīng)，能避免肺部嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，有助于提高疫苗的有效性和安全性[33]。

3.3 誘導(dǎo)抗病毒長(zhǎng)效免疫

一款成功的疫苗，需要能誘導(dǎo)長(zhǎng)期有效的抗病毒免疫反應(yīng)，這可以通過(guò)誘導(dǎo)產(chǎn)生長(zhǎng)效中和抗體和記憶細(xì)胞的產(chǎn)生來(lái)實(shí)現(xiàn)[46]。目前全球已有多款新冠病毒疫苗投入到臨床應(yīng)用中，但人們至今未明確這些疫苗接種后在人體內(nèi)誘發(fā)的抗體持久性和免疫記憶程度。研究認(rèn)為，引流淋巴結(jié)(dLNs)的生發(fā)中心(GC)反應(yīng)是誘導(dǎo)高質(zhì)量持久B細(xì)胞反應(yīng)的基礎(chǔ)，濾泡輔助性T細(xì)胞(TFH)又是生發(fā)中心反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)細(xì)胞。Etsuro Nanishi采用氫氧化鋁佐劑(AH)和CpG混合佐劑配合新冠病毒RBD抗原，發(fā)現(xiàn)該佐劑能顯著促進(jìn)生發(fā)中心的形成，抗原體異性類別轉(zhuǎn)換IgG1陽(yáng)性GC B細(xì)胞、TFH細(xì)胞的生成，并能有效促進(jìn)單核細(xì)胞來(lái)源樹(shù)突細(xì)胞依賴的記憶T細(xì)胞的產(chǎn)生。朱明昭課題組對(duì)小鼠接種了一種基于鐵蛋白納米顆粒和新冠病毒RBD的新型疫苗后，成功誘導(dǎo)了長(zhǎng)達(dá)7個(gè)月的有效抗體應(yīng)答，接種后210天進(jìn)行抗原再刺激時(shí)能檢測(cè)到大量記憶B細(xì)胞和高于對(duì)照組2000倍的特異性抗體產(chǎn)生[47]。

4 無(wú)機(jī)納米佐劑在疫苗遞送與抗原展示中的應(yīng)用

無(wú)機(jī)納米材料，除了具有佐劑效應(yīng)外，本身也是一種特性優(yōu)良的疫苗遞送載體。無(wú)機(jī)納米材料首先能作為一個(gè)臨時(shí)抗原儲(chǔ)存點(diǎn)，吸附抗原并維持抗原在生物環(huán)境中的穩(wěn)定性，延長(zhǎng)抗原在生物體內(nèi)的循環(huán)時(shí)間。如應(yīng)用鋁佐劑和重組蛋白抗原時(shí)，即使在加熱加速降解的條件下，蛋白抗原由于吸附在鋁佐劑表面從而一定程度上維持了結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性[48]。同時(shí)，無(wú)機(jī)納米佐劑能通過(guò)存儲(chǔ)庫(kù)效應(yīng)，吸附抗原，提高抗原在注射位點(diǎn)的駐留，從而發(fā)揮免疫增強(qiáng)作用。一項(xiàng)研究通過(guò)與Alum、QuilA兩種FDA批準(zhǔn)的疫苗佐劑進(jìn)行比較，研究了存儲(chǔ)庫(kù)效應(yīng)在雙層氫氧化物(LDH)和水輝石(HEC)黏土類納米材料發(fā)揮免疫刺激功能時(shí)的作用[49]。研究發(fā)現(xiàn)，LDH和HEC能在生物環(huán)境中形成具有疏松結(jié)構(gòu)的聚集物，經(jīng)皮下注射能檢測(cè)到有作為抗原存儲(chǔ)庫(kù)的結(jié)塊生成。注射LDH和HEC35天后仍能檢測(cè)到明顯的抗原釋放，而使用Alum的實(shí)驗(yàn)組35天后僅檢測(cè)到微量的抗原釋放；并且相較于Alum和QuilA，LDH和HEC能誘導(dǎo)更高水平的T細(xì)胞增殖，促進(jìn)長(zhǎng)效免疫響應(yīng)。

一些無(wú)機(jī)納米材料經(jīng)有效調(diào)控可獲得靶向特定免疫器、組織、細(xì)胞的功能，可以極大地提高疫苗的遞送效率和作用效果。如金納米顆粒表面修飾樹(shù)突狀細(xì)胞特異性細(xì)胞內(nèi)粘附分子抓取非整合素(DC-SIGN)，能有效吸附抗原，并在3D肺細(xì)胞模型中有效靶向和激活單核細(xì)胞來(lái)源樹(shù)突細(xì)胞，促進(jìn)DC攝取抗原，介導(dǎo)下游T細(xì)胞響應(yīng)[50]。此外，嚴(yán)格調(diào)控納米材料的粒徑、形貌、表面電性、親疏水性能有效調(diào)控納米顆粒的淋巴結(jié)靶向功能[51]。如研究發(fā)現(xiàn)吸附OVA抗原的金納米顆粒(GNP-OVA)，當(dāng)其粒徑達(dá)到30 nm時(shí)，相較于粒徑為10 nm的GNP-OVA，靶向淋巴結(jié)的效率更高[52]。同時(shí)通過(guò)使無(wú)機(jī)納米材料結(jié)合具有特定靶向功能的結(jié)構(gòu)也可以賦予該體系免疫器官靶向能力。如陳春英課題組使用白蛋白結(jié)合MnOx，利用白蛋白的淋巴結(jié)靶向能力，同時(shí)向淋巴結(jié)遞送新冠RBD抗原和錳佐劑[22]。

此外，利用無(wú)機(jī)納米顆粒可以有效設(shè)計(jì)抗原在生物體內(nèi)的展示方式。如可以將無(wú)法誘導(dǎo)抗病毒中和抗體的抗原表位掩蔽起來(lái)，從而提高疫苗對(duì)生物體免疫系統(tǒng)的刺激效率。Darrel課題組使用一種HIV三聚體抗原，通過(guò)在該抗原基底上修飾磷酸絲氨酸，使得基底處免疫刺激無(wú)效位點(diǎn)吸附在氫氧化鋁佐劑上，從而降低該表位的可識(shí)別性[53]。針對(duì)新冠病毒RBD抗原，該課題組同樣修飾上磷酸絲氨酸基團(tuán)，調(diào)控抗原和氫氧化鋁佐劑之間的相互作用，并有效暴露出免疫刺激關(guān)鍵表位，從而誘導(dǎo)更高水平的新冠病毒特異性體液免疫[9]。

由此可見(jiàn)，疫苗設(shè)計(jì)中，應(yīng)用無(wú)機(jī)納米顆粒，并根據(jù)需求精準(zhǔn)調(diào)控?zé)o機(jī)納米顆粒物化特性，能有效提高疫苗遞送效率和作用效果。下一步，應(yīng)進(jìn)一步明確無(wú)機(jī)納米材料生物學(xué)效應(yīng)和其物化特性的構(gòu)效關(guān)系，從而進(jìn)一步推進(jìn)無(wú)機(jī)納米顆粒在疫苗遞送中的應(yīng)用。

5 總結(jié)與展望

無(wú)機(jī)佐劑主要具有以下特點(diǎn)及優(yōu)勢(shì)[6]：儲(chǔ)存并參與遞送疫苗成分，提高抗原穩(wěn)定性；減少免疫所需抗原用量；增強(qiáng)免疫響應(yīng)覆蓋面；促進(jìn)樹(shù)突細(xì)胞活化及對(duì)抗原的呈遞；在生物體內(nèi)根據(jù)需求誘發(fā)所需類型的免疫反應(yīng)；促進(jìn)抗原交叉呈遞，增強(qiáng)T細(xì)胞響應(yīng)；擴(kuò)大疫苗提供免疫的覆蓋范圍，延長(zhǎng)疫苗成分作用有效時(shí)間等。

面對(duì)新冠病毒全球大流行，對(duì)目前已有的新冠疫苗進(jìn)行進(jìn)一步完善，以及積極開(kāi)發(fā)更多能提供強(qiáng)力抗病毒免疫效果的新型疫苗是必要的?；谝延械难芯靠梢园l(fā)現(xiàn)，相較于傳統(tǒng)鋁佐劑，新型無(wú)機(jī)納米佐劑能夠幫助疫苗在生物體內(nèi)同時(shí)激活體液免疫和細(xì)胞免疫，誘導(dǎo)更為平衡的Th1/Th2型免疫應(yīng)答，提高疫苗的安全性和有效性，同時(shí)也幫助延長(zhǎng)了疫苗的有效時(shí)間，為新冠疫苗的開(kāi)發(fā)提供更多思路和可能。此外，SARS-CoV-2是一種呼吸道病毒，生物體針對(duì)SARS-CoV-2的首次免疫響應(yīng)主要在呼吸道黏膜表面發(fā)生，如何誘發(fā)有效的黏膜免疫也是新冠疫苗設(shè)計(jì)的一大要點(diǎn)[54]。新型無(wú)機(jī)疫苗佐劑中，包括Mn佐劑和經(jīng)有效表面修飾的磷酸鈣、金佐劑等都可以增強(qiáng)疫苗對(duì)黏膜的粘附作用，增強(qiáng)生物體黏膜免疫，對(duì)當(dāng)下新冠疫苗的研發(fā)具有重要的參考意義。

未來(lái)，相關(guān)研究領(lǐng)域應(yīng)深入探究無(wú)機(jī)佐劑的作用機(jī)理，建立明確的佐劑和免疫學(xué)特性之間的構(gòu)效關(guān)系，積極開(kāi)發(fā)相關(guān)原位表征技術(shù)，推廣系統(tǒng)免疫學(xué)概念，全面分析無(wú)機(jī)納米材料在生物體內(nèi)誘發(fā)的免疫響應(yīng)，系統(tǒng)性解釋已有納米免疫材料作用機(jī)制，并為新納米免疫材料的發(fā)現(xiàn)及設(shè)計(jì)提供可靠的理論依據(jù)。納米技術(shù)為佐劑領(lǐng)域注入了新鮮血液，幫助開(kāi)發(fā)了具有精準(zhǔn)、安全、高效等特征的新一代疫苗佐劑，確保了相關(guān)領(lǐng)域研究的持續(xù)推進(jìn)。