高素素，王馨，王亞玲 ，陳春英

1國家納米科學中心，北京 100190

2廣東粵港澳大灣區(qū)國家納米科學創(chuàng)新研究院，廣州 510700

3中國科學院大學，北京 100049

1 引言

新型冠狀病毒(COVID-19)在全球范圍內(nèi)的大流行，截止2022年2月24日已有超過4.3億例確診病例，其中包括590多萬例死亡病例，共接種疫苗超過84億針次。冠狀病毒是一大類病毒家族，其中一些可導致人類的呼吸系統(tǒng)疾病，從輕微的感冒到嚴重的急性呼吸道感染及其他并發(fā)癥，如2003年首次發(fā)現(xiàn)的嚴重急性呼吸綜合征(SARS)，2012年發(fā)現(xiàn)的中東呼吸綜合征(MERS)以及2019年至今由SARS-CoV-2冠狀病毒引發(fā)的COVID-19大流行。冠狀病毒(CoV)可分為四類：α-CoV、β-CoV、γ-CoV與δ-CoV，目前已知的所有能導致人類疾病的冠狀病毒都屬于α與β-CoV，包括輕癥狀株HCoV-OC43、HCoV-HKU1、HCoV-229E、HCoV-NL63和嚴重癥狀株MERS-CoV、SARS-CoV、SARS-CoV-2，而γ與δ-CoV主要感染禽類動物[1]。冠狀病毒是一種正義RNA病毒，因其具有日冕狀外觀而得名，其基因組一般為27-32 kb，如圖1所示，主要編碼四種結(jié)構(gòu)蛋白：刺突蛋白(S，Spike Protein)、核衣殼蛋白(N，Nucleocapsid Protein)、膜蛋白(M，Membrane Protein)與包膜蛋白(E，Envelope Protein)[2]。SARSCoV和SARS-CoV-2通過將其S蛋白上的受體結(jié)合域(RBD)與宿主細胞表面受體血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2(ACE2，Angiotensin Converting Enzyme 2)結(jié)合而感染人體[3]。由于具有介導病毒與宿主細胞的吸附和融合，誘導宿主免疫反應和病毒中和抗體的作用，S蛋白是疫苗設計中的重要抗原特異性靶點，包括全長S蛋白、S1亞基、RBD和S2亞基。

圖1 冠狀病毒結(jié)構(gòu)[3]

目前，疫苗作為最強有力的技術(shù)平臺，極大地降低了人類冠狀病毒在世界范圍內(nèi)的傳播率和致死率，主要包括傳統(tǒng)的減毒活疫苗、滅活疫苗、亞單位疫苗與新型的核酸疫苗、基因工程亞單位疫苗、多糖疫苗和基因工程載體活疫苗。然而，SARS-CoV-2基因組的一些適應性突變有可能改變其致病潛能，從而增加傳播能力或疾病嚴重程度。目前，備受關注的SARS-CoV-2變異株(Variants of concern，VOC)包括Alpha、Beta、Gamma、Delta和Omicron，其流行病學特征、傳播性和免疫逃逸變化還需進一步研究[4]。伴隨著病毒不斷的突變和進化，上市疫苗在應對SARS-CoV-2變異株的過程中還需更新?lián)Q代。盡管疫苗在預防人類冠狀病毒感染方面取得了初步成功，但對于一些免疫原性較差的滅活疫苗和亞單位疫苗來說，佐劑是其中不可或缺的關鍵成分。佐劑，即免疫增強劑，能夠提升機體對于抗原免疫響應的速度、強度、廣度與持久度，從而減少抗原劑量與注射次數(shù)。然而，目前傳統(tǒng)的商業(yè)化佐劑面臨諸多問題，比如無法誘導足夠強的免疫響應，具體作用機理尚不明確，生物相容性有待繼續(xù)考量等。近年來，隨著納米技術(shù)的興起，無機納米顆粒被開發(fā)為對抗各種病毒的疫苗佐劑。通過材料合成與表面化學修飾，可精確調(diào)控無機納米顆粒的組成、大小、形貌、親疏水性、表面電荷、均勻性與分布等理化性質(zhì)，以有效刺激體液和細胞免疫，提高疫苗效力[5]。

本文主要綜述了近年來用于人類冠狀病毒疫苗的無機納米佐劑，以及無機納米佐劑在人類冠狀病毒疫苗免疫中的增效機制，并提出針對COVID-19疫苗的無機納米佐劑設計建議，為后續(xù)新型無機納米佐劑與疫苗開發(fā)提供新的見解。

2 無機納米佐劑的設計

佐劑是疫苗中的重要成分。在抗病毒免疫應答的過程中，無機納米佐劑可作為儲存抗原的臨時倉庫，穩(wěn)定抗原構(gòu)象并延長抗原暴露時間；有助于免疫細胞的招募和成熟；促進抗原的攝取、呈遞和交叉呈遞；選擇性誘導不同類型的免疫反應[6]。金屬元素在免疫應答過程中的關鍵作用以及在癌癥免疫治療中的重要應用越來越得到人們的關注。金屬離子在免疫信號轉(zhuǎn)導過程中的功能不只限于第二信使，例如，錳離子和鋅離子作為先天免疫激活劑的機制研究已被報道[6]。隨著疫苗制劑臨床研究的深入，傳統(tǒng)鋁佐劑也正在面臨著關鍵技術(shù)和產(chǎn)品性能問題，其理化性質(zhì)不均一，免疫保護作用機制不清晰，極大地限制了疫苗制劑的穩(wěn)定性和免疫功效。隨著人們對金屬免疫的認識增加，目前除了長期應用的鋁佐劑外，其他無機金屬元素及其納米顆粒也因其獨特的性質(zhì)發(fā)展成為具有潛力的候選佐劑。目前，研究人員開發(fā)了不同類型的無機納米佐劑用于抗冠狀病毒疫苗，主要包括鋁鹽佐劑、錳佐劑、鈣佐劑、硅基佐劑與金佐劑等。

2.1 鋁鹽佐劑及含鋁復合佐劑

鋁鹽佐劑是美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準的第一個人用疫苗佐劑，目前在預防人類冠狀病毒感染疫苗中應用廣泛。鋁佐劑一般通過以下途徑增強機體的免疫反應：作為儲存抗原的臨時倉庫，緩慢而持續(xù)地釋放抗原；激活并促進CD4+T細胞分化為Th2型細胞；促進抗原呈遞等[7]。在SARSCoV-2亞單位疫苗的開發(fā)過程中，需要面對兩個挑戰(zhàn)。一是制備重組蛋白亞基，主要激發(fā)中和性抗體而不是非中和性抗體，避免非中和性抗體可能導致的抗體依賴性增強效應(ADE，Antibody Dependent Enhancement)。二是添加佐劑，克服亞單位疫苗免疫原性較差的問題。傳統(tǒng)鋁佐劑通常誘導增強的Th2免疫響應，但Th1免疫響應不足。因此，需要開發(fā)各種類型的疫苗佐劑，如含鋁復合佐劑，誘導更平衡的Th1/Th2免疫響應，提高疫苗效力[8]。

Darrell J.Irvine教授等通過磷酸鹽介導的結(jié)合，將SARS-CoV-2受體結(jié)合域(RBD)和分子佐劑聯(lián)合錨定到明礬顆粒上，可促進疫苗成分共同輸送到淋巴結(jié)，從而引起協(xié)同的體液免疫。在免疫原蛋白RBD上位點特異性地引入磷酸絲氨酸(pSer)肽標簽，可通過配體交換反應有效結(jié)合到氫氧化鋁表面，減緩抗原清除，刺激小鼠生發(fā)中心反應，并導致中和抗體滴度顯著增加。進一步在pSer-RBD中添加含磷酸鹽的CpG或皂苷佐劑，可與明礬協(xié)同作用，增強疫苗的免疫原性，協(xié)同誘導小鼠與恒河猴體內(nèi)對SARS-CoV-2的中和反應與更平衡的Th1/Th2型免疫響應[9]。

一般情況下，鋁佐劑只附著于細胞膜表面，不進入樹突細胞，造成細胞內(nèi)抗原呈遞和處理的缺失。并且，抗原在經(jīng)過溶酶體加工后通過主要組織相容性復合體II(MHC-II)呈現(xiàn)，而不在MHC-I介導的細胞免疫中交叉呈現(xiàn)，限制了T細胞介導的免疫反應。馬光輝課題組成功合成了一種明礬顆粒穩(wěn)定的Pickering乳液(PAPE)，作為基于重組蛋白(S蛋白和RBD)的COVID-19新型疫苗佐劑(圖2)。與傳統(tǒng)的鋁佐劑對照組相比，PAPE誘導的抗原特異性抗體滴度提高了6倍以上，分泌IFN-γ的T細胞增加了3倍，表明其同時具有有效的體液和細胞免疫激活作用。鋁佐劑具有可獲得性廣的優(yōu)勢，其微凝膠能夠在油/水中間相自發(fā)吸附得到PAPE佐劑，并能夠迅速吸附抗原，為開發(fā)一種安全、可獲得、高效的COVID-19疫苗佐劑提供了思路[10]。

圖2 PAPE的設計策略[10]

管軼等人開發(fā)了一種有效的、基于蛋白質(zhì)亞單位的SARS-CoV-2候選疫苗，該疫苗(StriFKFH002C)由穗狀胞外結(jié)構(gòu)域蛋白(StriFK)和新型的氮二膦酸鹽修飾的鋅鋁混合佐劑(FH002C)組成。FH002C中含有一種臨床上用于治療骨質(zhì)疏松癥的藥物活性成分——利塞膦酸鹽。研究人員在三個動物模型中系統(tǒng)評估了StriFK-FH002C的免疫原性和保護效果。接種疫苗后，小鼠、倉鼠和食蟹猴體內(nèi)產(chǎn)生的中和抗體滴度比從COVID-19恢復期個體分離的血漿中觀察到的抗體滴度高出30至250倍。與臨床上被許可用于戊型肝炎病毒和人乳頭瘤病毒疫苗中的傳統(tǒng)鋁佐劑(Al001)相比，該疫苗能夠同時誘導小鼠體內(nèi)Th1和Th2極化輔助T細胞免疫響應。在重現(xiàn)人類COVID-19疾病的動物模型倉鼠中，接種StriFK-FH002C疫苗可提供保護性免疫，預防SARS-CoV-2感染、發(fā)病和傳播(圖3)[8]。

圖3 StriFK-FH002C和StriFK-Al001疫苗三次免疫可保護倉鼠免受鼻內(nèi)SARS-CoV-2感染

除此之外，研究表明，氫氧化鋁與CpG佐劑在SARS-CoV-2 RBD疫苗中聯(lián)合使用，能夠增強RBD的免疫原性，在青年和老年小鼠中產(chǎn)生更高的中和抗體滴度，比單獨使用氫氧化鋁增加80倍，其誘導的抗野生型SARS-CoV-2和B.1.351(beta)變異株的中和抗體血清濃度與已獲批的輝瑞B(yǎng)NT162b2 mRNA疫苗誘導的抗體濃度相當。并且，佐劑的聯(lián)合使用能夠協(xié)同提高小鼠體內(nèi)細胞因子和趨化因子的產(chǎn)生，增強樹突細胞依賴的記憶T細胞激活，且CpG吸附在氫氧化鋁表面形成更易于有效內(nèi)化的復合物，促進TLR9的激活[11]。

鋁佐劑在歷史上的使用中顯現(xiàn)出了良好的生物安全性，相關研發(fā)技術(shù)更為成熟，但其免疫刺激能力有限，還需通過對其進行表面修飾、性能優(yōu)化、與其他佐劑聯(lián)用等方式，發(fā)展新的設計策略，提升其免疫增強效力，尤其是對細胞免疫的激活。

2.2 磷酸鈣

磷酸鈣(CaP)得益于其優(yōu)異的生物降解能力、良好的生物相容性、可預測的生物代謝途徑、免疫細胞組織粘附能力，以及激活平衡的Th1/Th2型免疫響應的能力，在新型疫苗佐劑的開發(fā)中具有良好的發(fā)展前景[12]。目前在歐洲，已有磷酸鈣佐劑被批準應用于臨床上白喉和破傷風疫苗的案例[13]。

磷酸鈣首先是一種良好的免疫刺激物質(zhì)遞送載體。一項研究以雞卵溶菌酶(HEL)為抗原模型，發(fā)現(xiàn)相較于直接使用可溶性抗原，利用CaP遞送的蛋白抗原CaP-HEL更容易與B細胞上的受體結(jié)合，并易被HEL特異性B細胞內(nèi)化，能靶向并活化抗原特異性B細胞[14]。同時，CaP也可以用于遞送其他佐劑。如研究發(fā)現(xiàn)一種參與固有免疫激活的TLR激動劑CpG，當使用CaP遞送體系時，樹突細胞對CpG的內(nèi)化率明顯提高，同時DC的熟化程度和相關細胞因子水平(IL-6、TNF-α)也遠高于直接遞送CpG的對照組[15]。此外，CaP也是一種適用于鼻腔給藥的疫苗遞送載體。唐睿康課題組開發(fā)了一種鼻腔給藥的生物礦化膜包覆的嵌合疫苗(BioVaccine)，如圖4[16]。該設計采用登革熱病毒嵌合疫苗(ChinDENV2)為原料，通過沉積的方式，在原始疫苗表面包覆上一層CaP外殼(圖4a)。研究發(fā)現(xiàn)，相較于未經(jīng)包覆的疫苗，CaP外殼能有效地幫助該疫苗粘附在鼻內(nèi)黏膜上，使其在鼻腔內(nèi)的駐留時間由6 h延長至24 h。由于CaP外殼的存在還能促進APC對納米疫苗非受體依賴性的攝取，BioVaccine能進一步誘導局部黏膜IgA抗體的大量產(chǎn)生，顯著激活鼻腔黏膜免疫。同時相較于未經(jīng)包覆的ChinDENV2，BioVaccine經(jīng)鼻腔給藥能在生物體內(nèi)同時誘導更強效的抗病毒體液免疫和細胞免疫(圖4)。

圖4 鼻腔給藥的磷酸鈣包覆的嵌合疫苗(BioVaccine)

磷酸鈣在作為遞送載體的同時也展現(xiàn)出了其本身優(yōu)異的免疫刺激效果。磷酸鈣的免疫激活機理與鋁佐劑有諸多相似之處[12]：(1)磷酸鈣也具有存儲庫效應，可以遞送抗原，維持抗原穩(wěn)定性；(2)磷酸鈣可以激活NLRP3炎性小體，促進炎性因子的釋放；(3)磷酸鈣可以促進APC熟化，增強抗原呈遞。但與傳統(tǒng)鋁佐劑不同的是，磷酸鈣具有良好的黏膜粘附性，能有效調(diào)控生物體黏膜免疫，并且磷酸鈣和抗原組成核殼結(jié)構(gòu)后能有效誘導系統(tǒng)性細胞免疫。由此可見鈣鹽佐劑有可能是繼鋁鹽之后，免疫激活效果更優(yōu)，安全性更好，極具臨床轉(zhuǎn)化潛力的新一代疫苗佐劑。

2.3 錳佐劑

錳是人體必需的一種微量元素，參與人體的生長發(fā)育、生殖以及神經(jīng)信號轉(zhuǎn)導等諸多生理活動[17]。同時，錳離子的存在對于維持機體良好的免疫防御功能也有重要的意義。研究發(fā)現(xiàn)，Mn2+與cGAS結(jié)合，能夠提高cGAS對雙鏈DNA識別敏感度，增強cGAS的酶活性，增強cGAMP和干擾素基因刺激因子(STING)間的結(jié)合親和力，有助于激活cGAS-STING信號通路，加強生物體固有免疫[18]。此外，Mn2+本身也是一種有效的先天免疫刺激因子，在無感染的情況下即可誘導I型干擾素(IFN)和細胞因子的產(chǎn)生[18]。錳離子上述優(yōu)異的免疫刺激能力，均顯示了其對增強人體抗病毒免疫的重要意義，具有作為新型疫苗佐劑的巨大潛能。

圖5 預防新型冠狀病毒的RBD-MnARK納米疫苗作用效果

納米錳佐劑具有成本低、可獲得性廣、穩(wěn)定性好與生物相容性良好的優(yōu)點，并且如MnJ等納米錳佐劑也被證實在生物體內(nèi)能誘導有效的抗病毒黏膜免疫[21]。由此見得，納米Mn佐劑在新冠病毒疫苗領域具有巨大的臨床開發(fā)潛力。

2.4 硅佐劑

抗病毒疫苗通常以生物活性大分子作為抗原，如蛋白質(zhì)、DNA、RNA等，可以通過特殊的載體進行遞送。介孔二氧化硅納米顆粒(MSNs)為抗原的遞送提供了合適的條件：高穩(wěn)定性、高比表面積、易于表面功能化修飾以及大的孔容量。MSNs由無定形二氧化硅組成，隨著時間的推移，很容易在體內(nèi)降解，因此在體內(nèi)具有較好的安全性。研究人員制備了具有大孔隙(30 nm)的單分散二氧化硅微球，可通過傳遞多種細胞因子(如IL-4)來調(diào)控免疫系統(tǒng)，比傳統(tǒng)的小孔隙(3.2 nm)二氧化硅微球具有更高的蛋白負載能力。IL-4負載的MSNs能夠在體內(nèi)觸發(fā)M2巨噬細胞極化(圖6)[23]。介孔二氧化硅棒(MSRs)能夠自發(fā)地堆疊形成微孔和三維支架結(jié)構(gòu)。研究人員開發(fā)了一種基于MSRs的可注射疫苗，能夠提升全身性Th1和Th2血清抗體和細胞毒性T細胞水平[24]。通過釋放炎癥信號和佐劑(如單鏈DNA，CpG-ODN等)，樹突細胞被招募到三維支架之間的孔隙中。

圖6 MSNs的合成及其在體內(nèi)遞送IL-4的示意圖[23]

除此之外，介孔二氧化硅與其他抗原載體聯(lián)合使用可增強佐劑的免疫活性。例如，層狀雙氫氧化物(LDH)納米顆?？梢员粏魏思毎苌鷺渫患毎?MDDC)吸收，并能夠促進樹突細胞成熟。為了進一步增強LDH的免疫佐劑活性，研究人員成功合成了一種具有約210 nm平均直徑的核-殼結(jié)構(gòu)SiO2@LDH納米顆粒，用于乙型肝炎病毒DNA疫苗遞送，可促進IFN-γ、IL-6、MHC II和CD86的表達，從而增強小鼠體內(nèi)免疫響應。SiO2@LDH納米顆粒還能促進T細胞增殖，誘導輔助T細胞向Th1型免疫應答傾斜，并導致NF-kB免疫信號通路活化[25]。此外，MSNs的理化性質(zhì)易通過表面配體的偶聯(lián)作用進行調(diào)節(jié)，構(gòu)建pH響應型疫苗遞送系統(tǒng)[26]。

硅基佐劑，尤其是介孔二氧化硅材料，具有強大的負載能力和易于表面修飾的特點，為新型佐劑開發(fā)和抗原、佐劑共遞送，增強佐劑活性提供更多思路。

2.5 金納米顆粒

金納米顆粒(AuNPs)在生物環(huán)境中的物理化學性質(zhì)穩(wěn)定，具有低毒性、非免疫原性、多功能性的特征和良好的抗原負載能力，并且可刺激多種免疫細胞產(chǎn)生促炎因子和細胞因子(包括IL-1β、TNF-α等)，可同時作為抗原的遞送載體和疫苗佐劑，有效調(diào)控生物體免疫應答。

研究顯示，使用SARS-CoV的刺突蛋白作為抗原模型，單獨使用AuNPs作為佐劑，雖能促進抗原特異性IgG的產(chǎn)生，但是無法誘導產(chǎn)生足以對抗病毒感染的免疫屏障，并且不能緩解冠狀病毒導致的肺部嗜酸性粒細胞的浸潤[27]。通常，結(jié)合多種額外的免疫佐劑，能使AuNPs發(fā)揮更理想的免疫調(diào)節(jié)效果。詹林盛課題組設計了一種新型功能化納米金促進劑(NanoAu-Cocktail)，能共同遞送OVA抗原肽和TLR9激動劑CpG，激活生物體免疫響應[28]。NanoAu-Cocktail可使DC總淋巴器官歸巢數(shù)量提高15倍，肝臟引流淋巴結(jié)歸巢數(shù)量提高36倍。該體系顯著增強了DC對抗原的攝取和交叉呈遞，促進Th1型細胞因子的上調(diào)，為機體提供有效的抗病毒細胞免疫。針對目前的SARS-CoV-2，Kumar等人開發(fā)了一種殼聚糖修飾的金納米星，用于遞送攜帶新冠病毒刺突蛋白編碼信息的DNA疫苗(圖7)[29]。通過鼻腔給藥的模式，該疫苗體系能顯著激活小鼠的呼吸道黏膜免疫，促進機體高水平表達S蛋白特異性IgG和IgA，且研究中這兩種抗體對新冠亞種(Wuhan,D614G和beta突變體)的假病毒都表現(xiàn)出了極強的中和能力。同時，免疫熒光染色實驗也顯示了在接種該疫苗后，小鼠淋巴結(jié)和肺部的T細胞和B細胞都被激活，能有效對抗新冠病毒感染。

圖7 殼聚糖修飾的金納米星遞送DNA疫苗[29]

此外，通過在戊型肝炎疫苗(HEVA)中“原位”生長金納米團簇可獲得一種新型疫苗[30]，基于金納米團簇的熒光特性，該體系不僅能激活生物體免疫響應，還能通過金納米團簇實時跟蹤疫苗的動態(tài)行為，有助于進一步了解疫苗誘導免疫應答的分子機制。

金納米顆粒能有效遞送抗原，引起生物體所需的免疫響應。但研究顯示較高劑量(＞8 mg·kg-1)裸露的金納米顆粒會在生物體內(nèi)引起嚴重的毒性反應，使用AuNP作為疫苗佐劑或載體的風險和長期后果仍需進一步調(diào)查[31,32]。

3 無機納米佐劑在人類冠狀病毒疫苗免疫中的增效機制

免疫系統(tǒng)在機體對抗病毒的過程中起到了重要的作用(圖8)。疫苗的出現(xiàn)為人類對抗病毒的過程提供了極大的助力。疫苗中抗原和佐劑的設計為人類對抗新冠病毒提供了雙重保險。目前，佐劑在冠狀病毒疫苗中主要起到了以下作用[33]：(1)誘導平衡的Th1和Th2免疫反應，阻止嗜酸性粒細胞浸潤；(2)增加中和抗體水平；(3)誘導抗原特異性IgG反應；(4)誘導黏膜免疫；(5)提高疫苗的免疫原性，減少疫苗劑量；(6)提高機體免疫系統(tǒng)的響應速度和免疫效果持續(xù)時間。

圖8 新冠病毒感染及生物體免疫應答過程[34]

3.1 增強體液免疫

中和抗體是機體對病毒適應性免疫系統(tǒng)中體液免疫的關鍵部分，通過與病毒表面抗原結(jié)構(gòu)特異性結(jié)合，發(fā)生中和反應，從而阻止病毒感染宿主細胞。研究表明，許多無機納米佐劑具有增加中和抗體水平的基本作用。針對預防MERS和SARS的重組蛋白(S蛋白)亞單位疫苗中，接種含有明礬佐劑的疫苗后，小鼠體內(nèi)中和抗體的水平提升了15倍[35]。不同佐劑的聯(lián)合使用可能進一步促進中和抗體的產(chǎn)生，誘導協(xié)同的免疫保護反應。在小鼠接種聯(lián)合使用明礬佐劑與rASP-1佐劑的RBD疫苗后，其體內(nèi)產(chǎn)生了一種能夠強烈抑制MERS-CoV的中和抗體，通過抑制RBD與宿主細胞受體的結(jié)合發(fā)揮作用[36]。研究人員利用含明礬和CpG佐劑的SARS-CoV-2 RBD亞單位疫苗，也可誘導小鼠體內(nèi)產(chǎn)生大量中和抗體。此外，不同的給藥方式影響產(chǎn)生的中和抗體水平，使用鼻內(nèi)或腹腔內(nèi)免疫途徑可能提供血清與黏膜內(nèi)理想的SARS-CoV中和抗體活性[37]。因此，在疫苗開發(fā)中，應充分考慮并優(yōu)化各種佐劑的組合、配比、混合順序與注射部位等因素，使疫苗激發(fā)最佳的保護性免疫應答。

免疫球蛋白(Immunoglobulins，Ig)是免疫活性分子中的一類，根據(jù)其化學結(jié)構(gòu)不同，可分為五類，即免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白M(IgM)、免疫球蛋白D(IgD)和免疫球蛋白E(IgE)。其中，IgG約占血清總Ig的75%-80%，是機體抗感染的“主力軍”，親和力高，能夠促進單核巨噬細胞的吞噬作用，中和病毒。IgA有血清型和分泌型兩種。分泌型IgA是黏膜局部免疫的主要成分，能夠阻止病毒黏附于細胞表面并中和毒素[38]。研究表明，SARS-CoV滅活疫苗中添加明礬佐劑，能夠提升血清中特異性IgG抗體水平，但不足以刺激IgA抗體水平提升[39]。研究人員比較了含有不同市售明礬佐劑、弗氏佐劑、單磷酰脂質(zhì)A(Monophosphoryl lipid A，MPLA)、Montanide ISA51以及MF59的MERS-CoV RBD亞單位疫苗在體內(nèi)產(chǎn)生的不同免疫反應。其中，MF59表現(xiàn)出誘導IgG，IgG1和IgG2a亞型中和抗體的最佳效果[40]。此外，含有CpG-ODN佐劑的SARS-CoV滅活疫苗，能夠促進小鼠血清中特異性IgG與IgA抗體的產(chǎn)生，并在黏膜分泌物中檢測到大量的IgA抗體[37]。研究人員開發(fā)了一種通過鼻腔給藥的殼聚糖修飾的金納米星SARS-CoV-2 DNA疫苗，能夠誘導S蛋白特異性IgG和IgA的高表達。因此，發(fā)展鋁鹽佐劑之外的無機納米佐劑，尤其是黏膜免疫佐劑，誘導血清和黏膜分泌物中抗原特異性IgG和IgA的產(chǎn)生，進一步提高免疫應答，還需更多探索。

3.2 誘導T細胞活化，平衡Th1/Th2免疫響應

SARS-CoV-2能夠在不暴露于細胞外環(huán)境的情況下從一個細胞傳播到另一個細胞，因而單純依賴B細胞介導體液免疫產(chǎn)生抗體在對抗新冠感染的過程中產(chǎn)生的作用始終是有限的。在對抗病毒感染的過程中，T細胞始終扮演著重要的角色。T細胞在胸腺內(nèi)經(jīng)MHC限制性選擇發(fā)育為CD8+T細胞和CD4+T細胞。在接受抗原刺激后，活化的CD8+T細胞主要形成細胞毒性T細胞(CTL)，通過細胞毒作用對宿主細胞進行直接殺傷，且CD8+T細胞更容易分化形成記憶T細胞；而CD4+T細胞主要分化為Th1、Th2、Th17等T效應細胞亞群，Th1細胞主要通過產(chǎn)生的細胞因子介導細胞免疫，Th2細胞則主要通過分泌Th2型細胞因子，支持B細胞發(fā)揮功能，介導體液免疫應答[41,42]。例如，以淋巴液的分子伴侶蛋白(白蛋白)為模板的錳納米佐劑，通過對淋巴結(jié)的自靶向?qū)崿F(xiàn)了新冠RBD抗原和佐劑的共遞送，激活抗病毒的天然免疫通路(STING)，不僅產(chǎn)生了強的中和抗體水平，也激活了強而廣泛的T細胞免疫(圖9)[22]。

圖9 抗新型冠狀病毒的RBD抗原/錳納米佐劑共遞送疫苗設計及免疫增效機制示意圖[22]

一項研究設計了一種氧化石墨烯納米片佐劑(L-GO)[43]，該佐劑能通過整合素ICAM-1膜定位促進DC-T細胞突觸的形成，作為一種“納米拉鏈”，促進DC-T細胞簇的聚集，為T細胞的激活創(chuàng)造一個穩(wěn)定的微環(huán)境。此外，L-GO能顯著激活小鼠體內(nèi)的SARS-CoV-2刺突蛋白特異性CD8+T細胞，介導強大的細胞免疫，為開發(fā)有效的COVID-19疫苗提供了一種新的方案。對于只能激活Th2型免疫響應的傳統(tǒng)鋁佐劑，它們一般無法誘導有效的細胞免疫，通?？梢酝ㄟ^設計復合佐劑誘導更為平衡的Th1/Th2型免疫響應以彌補這一缺陷。北卡羅來納大學Rama Rao Amara團隊針對SARS-CoV-2開發(fā)了一種RBD的三聚體，用TLR7/8激動劑結(jié)合傳統(tǒng)明礬佐劑組成的Alum-3M-052不僅誘導了比Alum高100倍的中和抗體效價，而且還顯著誘導CD4+T細胞Th1型分化，具有更好的抗新冠病毒感染保護作用[44]。Maria Pino等人同樣采用Alum-3M-052佐劑，發(fā)現(xiàn)其不僅檢測到Th1細胞的上調(diào)，還發(fā)現(xiàn)了針對SARSCoV-2 RBD的CD8+T細胞的顯著激活[45]。此外，冠狀病毒感染會誘發(fā)肺部嗜酸性病變，而誘導平衡的Th1/Th2型免疫響應，能避免肺部嗜酸性粒細胞浸潤，有助于提高疫苗的有效性和安全性[33]。

3.3 誘導抗病毒長效免疫

一款成功的疫苗，需要能誘導長期有效的抗病毒免疫反應，這可以通過誘導產(chǎn)生長效中和抗體和記憶細胞的產(chǎn)生來實現(xiàn)[46]。目前全球已有多款新冠病毒疫苗投入到臨床應用中，但人們至今未明確這些疫苗接種后在人體內(nèi)誘發(fā)的抗體持久性和免疫記憶程度。研究認為，引流淋巴結(jié)(dLNs)的生發(fā)中心(GC)反應是誘導高質(zhì)量持久B細胞反應的基礎，濾泡輔助性T細胞(TFH)又是生發(fā)中心反應的關鍵調(diào)節(jié)細胞。Etsuro Nanishi采用氫氧化鋁佐劑(AH)和CpG混合佐劑配合新冠病毒RBD抗原，發(fā)現(xiàn)該佐劑能顯著促進生發(fā)中心的形成，抗原體異性類別轉(zhuǎn)換IgG1陽性GC B細胞、TFH細胞的生成，并能有效促進單核細胞來源樹突細胞依賴的記憶T細胞的產(chǎn)生。朱明昭課題組對小鼠接種了一種基于鐵蛋白納米顆粒和新冠病毒RBD的新型疫苗后，成功誘導了長達7個月的有效抗體應答，接種后210天進行抗原再刺激時能檢測到大量記憶B細胞和高于對照組2000倍的特異性抗體產(chǎn)生[47]。

4 無機納米佐劑在疫苗遞送與抗原展示中的應用

無機納米材料，除了具有佐劑效應外，本身也是一種特性優(yōu)良的疫苗遞送載體。無機納米材料首先能作為一個臨時抗原儲存點，吸附抗原并維持抗原在生物環(huán)境中的穩(wěn)定性，延長抗原在生物體內(nèi)的循環(huán)時間。如應用鋁佐劑和重組蛋白抗原時，即使在加熱加速降解的條件下，蛋白抗原由于吸附在鋁佐劑表面從而一定程度上維持了結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性[48]。同時，無機納米佐劑能通過存儲庫效應，吸附抗原，提高抗原在注射位點的駐留，從而發(fā)揮免疫增強作用。一項研究通過與Alum、QuilA兩種FDA批準的疫苗佐劑進行比較，研究了存儲庫效應在雙層氫氧化物(LDH)和水輝石(HEC)黏土類納米材料發(fā)揮免疫刺激功能時的作用[49]。研究發(fā)現(xiàn)，LDH和HEC能在生物環(huán)境中形成具有疏松結(jié)構(gòu)的聚集物，經(jīng)皮下注射能檢測到有作為抗原存儲庫的結(jié)塊生成。注射LDH和HEC35天后仍能檢測到明顯的抗原釋放，而使用Alum的實驗組35天后僅檢測到微量的抗原釋放；并且相較于Alum和QuilA，LDH和HEC能誘導更高水平的T細胞增殖，促進長效免疫響應。

一些無機納米材料經(jīng)有效調(diào)控可獲得靶向特定免疫器、組織、細胞的功能，可以極大地提高疫苗的遞送效率和作用效果。如金納米顆粒表面修飾樹突狀細胞特異性細胞內(nèi)粘附分子抓取非整合素(DC-SIGN)，能有效吸附抗原，并在3D肺細胞模型中有效靶向和激活單核細胞來源樹突細胞，促進DC攝取抗原，介導下游T細胞響應[50]。此外，嚴格調(diào)控納米材料的粒徑、形貌、表面電性、親疏水性能有效調(diào)控納米顆粒的淋巴結(jié)靶向功能[51]。如研究發(fā)現(xiàn)吸附OVA抗原的金納米顆粒(GNP-OVA)，當其粒徑達到30 nm時，相較于粒徑為10 nm的GNP-OVA，靶向淋巴結(jié)的效率更高[52]。同時通過使無機納米材料結(jié)合具有特定靶向功能的結(jié)構(gòu)也可以賦予該體系免疫器官靶向能力。如陳春英課題組使用白蛋白結(jié)合MnOx，利用白蛋白的淋巴結(jié)靶向能力，同時向淋巴結(jié)遞送新冠RBD抗原和錳佐劑[22]。

此外，利用無機納米顆粒可以有效設計抗原在生物體內(nèi)的展示方式。如可以將無法誘導抗病毒中和抗體的抗原表位掩蔽起來，從而提高疫苗對生物體免疫系統(tǒng)的刺激效率。Darrel課題組使用一種HIV三聚體抗原，通過在該抗原基底上修飾磷酸絲氨酸，使得基底處免疫刺激無效位點吸附在氫氧化鋁佐劑上，從而降低該表位的可識別性[53]。針對新冠病毒RBD抗原，該課題組同樣修飾上磷酸絲氨酸基團，調(diào)控抗原和氫氧化鋁佐劑之間的相互作用，并有效暴露出免疫刺激關鍵表位，從而誘導更高水平的新冠病毒特異性體液免疫[9]。

由此可見，疫苗設計中，應用無機納米顆粒，并根據(jù)需求精準調(diào)控無機納米顆粒物化特性，能有效提高疫苗遞送效率和作用效果。下一步，應進一步明確無機納米材料生物學效應和其物化特性的構(gòu)效關系，從而進一步推進無機納米顆粒在疫苗遞送中的應用。

5 總結(jié)與展望

無機佐劑主要具有以下特點及優(yōu)勢[6]：儲存并參與遞送疫苗成分，提高抗原穩(wěn)定性；減少免疫所需抗原用量；增強免疫響應覆蓋面；促進樹突細胞活化及對抗原的呈遞；在生物體內(nèi)根據(jù)需求誘發(fā)所需類型的免疫反應；促進抗原交叉呈遞，增強T細胞響應；擴大疫苗提供免疫的覆蓋范圍，延長疫苗成分作用有效時間等。

面對新冠病毒全球大流行，對目前已有的新冠疫苗進行進一步完善，以及積極開發(fā)更多能提供強力抗病毒免疫效果的新型疫苗是必要的?；谝延械难芯靠梢园l(fā)現(xiàn)，相較于傳統(tǒng)鋁佐劑，新型無機納米佐劑能夠幫助疫苗在生物體內(nèi)同時激活體液免疫和細胞免疫，誘導更為平衡的Th1/Th2型免疫應答，提高疫苗的安全性和有效性，同時也幫助延長了疫苗的有效時間，為新冠疫苗的開發(fā)提供更多思路和可能。此外，SARS-CoV-2是一種呼吸道病毒，生物體針對SARS-CoV-2的首次免疫響應主要在呼吸道黏膜表面發(fā)生，如何誘發(fā)有效的黏膜免疫也是新冠疫苗設計的一大要點[54]。新型無機疫苗佐劑中，包括Mn佐劑和經(jīng)有效表面修飾的磷酸鈣、金佐劑等都可以增強疫苗對黏膜的粘附作用，增強生物體黏膜免疫，對當下新冠疫苗的研發(fā)具有重要的參考意義。

未來，相關研究領域應深入探究無機佐劑的作用機理，建立明確的佐劑和免疫學特性之間的構(gòu)效關系，積極開發(fā)相關原位表征技術(shù)，推廣系統(tǒng)免疫學概念，全面分析無機納米材料在生物體內(nèi)誘發(fā)的免疫響應，系統(tǒng)性解釋已有納米免疫材料作用機制，并為新納米免疫材料的發(fā)現(xiàn)及設計提供可靠的理論依據(jù)。納米技術(shù)為佐劑領域注入了新鮮血液，幫助開發(fā)了具有精準、安全、高效等特征的新一代疫苗佐劑，確保了相關領域研究的持續(xù)推進。