劉瑛穎, 張 玲, 楊喬斯

(1.中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院,北京 100029； 2.迪瑞醫(yī)療科技股份有限公司,吉林 長(zhǎng)春 130000)

1 引 言

尿沉渣(urine sediment,US)檢查是對(duì)尿液中的有形成分進(jìn)行檢查,主要包括細(xì)胞、管型、結(jié)晶、細(xì)菌、寄生蟲等各種病理成份,是輔助對(duì)泌尿系統(tǒng)疾病作出診斷的重要常規(guī)試驗(yàn)項(xiàng)目[1]。其中的白細(xì)胞(white blood cell,WBC)項(xiàng)目對(duì)泌尿系統(tǒng)的檢測(cè)具有重要意義,提示著泌尿系統(tǒng)存在著細(xì)菌感染或腎臟疾病等病理特征[2,3]。全自動(dòng)尿沉渣分析儀是采用顯微圖像自動(dòng)識(shí)別技術(shù)或流式細(xì)胞技術(shù)對(duì)尿液中的有形成份進(jìn)行自動(dòng)定位及捕捉,并且對(duì)尿液中的有形成分進(jìn)行自動(dòng)識(shí)別和分類計(jì)數(shù)的一種檢驗(yàn)設(shè)備。由于其快捷性和準(zhǔn)確性,全自動(dòng)尿沉渣分析儀已成為臨床尿液檢測(cè)分析的常規(guī)儀器。為了保證該類儀器在日常檢測(cè)工作中的性能水平和檢測(cè)結(jié)果的真實(shí)可靠,國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)督管理總局頒布了JJF 1823—2020《全自動(dòng)尿沉渣分析儀校準(zhǔn)規(guī)范》,并于2020年4月開始發(fā)布實(shí)施。該文件主要對(duì)紅細(xì)胞、白細(xì)胞兩個(gè)測(cè)量項(xiàng)目的空白值、示值誤差、重復(fù)性、攜帶污染率等計(jì)量特性進(jìn)行了規(guī)范[4]。為了保證該校準(zhǔn)規(guī)范的正常實(shí)施和良好操作,相關(guān)校準(zhǔn)項(xiàng)目配套的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是必不可少的。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是具有高度均勻性、良好穩(wěn)定性和量值準(zhǔn)確性,用來(lái)校準(zhǔn)測(cè)量?jī)x器,對(duì)測(cè)量方法進(jìn)行評(píng)價(jià)或?yàn)槲镔|(zhì)定值的物質(zhì),在分析測(cè)試各行業(yè)中得到廣泛應(yīng)用[5,6]。因此,本研究以固定后的人血液白細(xì)胞為原料完成了尿沉渣白細(xì)胞計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備,并考察了其細(xì)胞形態(tài)真實(shí)性、標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均勻性、穩(wěn)定性和臨床樣本的互通性,研制的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)可配合相關(guān)校準(zhǔn)規(guī)范用于全自動(dòng)尿沉渣分析儀中白細(xì)胞項(xiàng)目的周期校準(zhǔn)、質(zhì)量控制,以及相關(guān)檢測(cè)方法的確認(rèn)和驗(yàn)證。

2 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備

2.1 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)細(xì)胞原料

對(duì)體格檢查中滿足獻(xiàn)血者健康檢查有關(guān)要求的無(wú)償獻(xiàn)血者初篩(乙肝表抗、轉(zhuǎn)氨酶、快速HIV)合格的EDTA-K2靜脈抗凝血，取抗凝血液標(biāo)本,以2 000 r/min離心3 min,分離獲得白膜層,取白膜層加入溶血素進(jìn)行殘余紅細(xì)胞溶解；然后加入磷酸鹽緩沖溶液(0.1 mol/L,pH 7.2)稀釋,以2 000 r/min離心3 min,洗滌3次得到白細(xì)胞懸液,加入磷酸緩沖鹽(0.1 mol/L,pH 7.2)溶液和甲醛(終濃度1%,體積分?jǐn)?shù))混合,混勻器上混合30 min,置4 ℃冰箱過(guò)夜。第二天,取出后再用混勻器混合30 min,離心棄去上液得到醛化固定白細(xì)胞。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的配制和分裝

將醛化固定后的白細(xì)胞按一定比例加入磷酸鹽緩沖溶液(0.1 mol/L,pH 7.2)中配制成目標(biāo)濃度,充分混勻后分裝,透明玻璃圓底長(zhǎng)管中每管加入30 mL白細(xì)胞懸浮液,旋緊管蓋,放置冰箱備用。操作過(guò)程在生物安全柜中進(jìn)行,避免細(xì)菌污染。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)候選物細(xì)胞形態(tài)確認(rèn)

為了保證本標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)候選物能夠通用于所有全自動(dòng)尿沉渣分析儀的檢測(cè)校準(zhǔn),尤其是基于顯微圖像自動(dòng)識(shí)別技術(shù)的儀器,所用的醛化固定后的白細(xì)胞應(yīng)具有與新鮮細(xì)胞非常高的形態(tài)相似性。本研究將4 ℃保存了12個(gè)月的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)候選物白細(xì)胞與新鮮血液樣本中的白細(xì)胞,通過(guò)掃描電子顯微鏡拍攝,并進(jìn)行了超高分辨率顯微圖像的比較。每種樣本隨機(jī)選取了20～40個(gè)細(xì)胞進(jìn)行圖像拍攝和比較。與新鮮血液白細(xì)胞相比,長(zhǎng)期保存的醛化固定白細(xì)胞發(fā)生明顯的破裂、皺縮等形態(tài)變化。這說(shuō)明從細(xì)胞形態(tài)特征方面,本研究制備的尿沉渣白細(xì)胞計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)候選物是可以代表新鮮白細(xì)胞的。

圖1 不同樣本中白細(xì)胞的掃描電子顯微鏡圖像

3 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的定值

3.1 定值方法的選擇

本研究中采用了2種方法進(jìn)行了定值：高通量顯微成像法和流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定。顯微鏡測(cè)量方法是上世紀(jì)90年代前血細(xì)胞計(jì)數(shù)的傳統(tǒng)參考方法,也是目前美國(guó)臨床檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)和中國(guó)臨床檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)建議的尿沉渣白細(xì)胞計(jì)數(shù)的參考方法[7,8]。該方法的優(yōu)點(diǎn)是直接絕對(duì),弊端是檢測(cè)通量小導(dǎo)致測(cè)量結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)偏差大,主觀性過(guò)強(qiáng)。因此,本標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制中采用了高通量顯微成像法作為了定值方法之一。該方法通過(guò)基于時(shí)間延遲積分技術(shù)的電荷耦合器件(time delay integration charge coupled devices, TDICCD)可對(duì)鞘液流中高速流過(guò)的單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行快速顯微拍攝,包括明場(chǎng)和多個(gè)熒光通道的暗場(chǎng)圖像[9,10]。通過(guò)該技術(shù)我們得到了待定值制備物中的白細(xì)胞明場(chǎng)光學(xué)顯微圖像；同時(shí)通過(guò)核酸特異性熒光染料DRAQ5進(jìn)行白細(xì)胞細(xì)胞核染色,還可得到細(xì)胞核熒光顯微圖像(見(jiàn)圖2)。因此,該技術(shù)不僅實(shí)現(xiàn)了對(duì)研究對(duì)象的直接絕對(duì)的確認(rèn),同時(shí)可高通量(5 000 cells/s)分析測(cè)量待檢測(cè)細(xì)胞,顯著改善顯微鏡檢測(cè)量的不確定度水平。

圖2 人新鮮血液樣本白細(xì)胞的高通量顯微成像多通道圖像

本研究的另一定值方法是流式細(xì)胞術(shù)測(cè)量法。流式細(xì)胞術(shù)與人工顯微鏡測(cè)量法有著根本的不同,前者是基于細(xì)胞表面免疫標(biāo)志即從免疫學(xué)特征對(duì)白細(xì)胞進(jìn)行分類計(jì)數(shù),且可以計(jì)數(shù)大量細(xì)胞[11]。同顯微鏡法相比,流式細(xì)胞術(shù)分類計(jì)數(shù)白細(xì)胞的優(yōu)勢(shì)在于計(jì)數(shù)的細(xì)胞數(shù)量更多(>10 000個(gè)細(xì)胞),因此靈敏度、特異性更高,重復(fù)性更好。

3.2 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值數(shù)據(jù)與處理

本研究共制備了300瓶標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)候選物,依據(jù)JJF 1006—1994《一級(jí)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)技術(shù)規(guī)范》隨機(jī)抽取了15瓶進(jìn)行了定值[12]。從每瓶中隨機(jī)分別抽取3個(gè)樣本進(jìn)行測(cè)定,共45個(gè)樣本數(shù)據(jù),定值數(shù)據(jù)及統(tǒng)計(jì)處理見(jiàn)表1。

表1 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的定值測(cè)量數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

用夏皮羅-威爾克(Shapiro-Wilk)法對(duì)兩組測(cè)量數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)分布檢驗(yàn),用格拉布斯(Grubbs)法檢驗(yàn)有無(wú)異常值,結(jié)果表明測(cè)量數(shù)據(jù)為正態(tài)分布、無(wú)異常值[13]。用F-檢驗(yàn)檢查確認(rèn)高通量顯微成像法與流式細(xì)胞術(shù)的測(cè)量精度是一致的。通過(guò)計(jì)算得到本標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值的算術(shù)平均值為516.0 cells/μL。

3.3 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的均勻性檢驗(yàn)

為了保證檢驗(yàn)結(jié)果能夠充分代表整體特征,本研究按照J(rèn)JF 1006—1994《一級(jí)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)技術(shù)規(guī)范》隨機(jī)選取15瓶[12],每瓶通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行白細(xì)胞濃度測(cè)定3次,利用方差分析法對(duì)瓶?jī)?nèi)和瓶間的均勻性進(jìn)行分析,表2列出了均勻性檢驗(yàn)結(jié)果。

3.4 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的穩(wěn)定性檢驗(yàn)

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的穩(wěn)定性是衡量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的另外一個(gè)重要參數(shù)。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的長(zhǎng)期穩(wěn)定性與儲(chǔ)存條件相關(guān),短期穩(wěn)定性與運(yùn)輸條件相關(guān)。依據(jù)JJG 1343—2012《標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值的通用原則及統(tǒng)計(jì)學(xué)原理》對(duì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)候選物進(jìn)行長(zhǎng)期和短期穩(wěn)定性考察[13]。長(zhǎng)期穩(wěn)定性考察方式為在12個(gè)月內(nèi)周期性每次隨機(jī)抽取3支樣品,采用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)試白細(xì)胞濃度3次。描繪出特性量值Y與時(shí)間X的關(guān)系,擬合成一條直線,計(jì)算直線斜率b1,并評(píng)定穩(wěn)定性引入的不確定度s(b1)。t0.95，n-2為自由度是n-2和p=0.95(95%置信水平)時(shí)的t因子，如果|b1|

表3 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的長(zhǎng)期穩(wěn)定性檢驗(yàn)

短期穩(wěn)定性測(cè)試選取了4個(gè)溫度點(diǎn)4、25、37和60 ℃,不同的時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行測(cè)試(3、7、11、14、21、31天),每次隨機(jī)抽取3支樣品,每只樣品測(cè)試3次,采用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)試白細(xì)胞濃度3次。尿沉渣白細(xì)胞計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)短期穩(wěn)定性考察結(jié)果見(jiàn)表4。分析短期穩(wěn)定性考察數(shù)據(jù)可知,本研究制備的尿沉渣白細(xì)胞計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)樣本的短期穩(wěn)定溫度比較寬泛(4～37 ℃),對(duì)運(yùn)輸溫度條件要求不是非常嚴(yán)格。

表4 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的短期穩(wěn)定性檢驗(yàn)

3.5 互通性驗(yàn)證

根據(jù)WS-T356—2011《基質(zhì)效應(yīng)與互通性評(píng)估指南》要求評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)候選物的互通性[14]。用2種測(cè)定方法,一種為顯微鏡檢的參考方法,另一種為臨床常規(guī)全自動(dòng)尿沉渣檢測(cè)儀評(píng)估方法。其中第二種方法選取了兩種原理的代表機(jī)型,一種為為顯微圖像識(shí)別原理的迪瑞FUS-2000(評(píng)估方法1),另一種流式細(xì)胞原理的希森美康UF-5000(評(píng)估方法2)。同時(shí)對(duì)選定的20份新鮮臨床尿液樣本(各濃度分布均勻)和標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行分析,利用2種方法測(cè)定臨床尿液樣本的結(jié)果建立數(shù)學(xué)關(guān)系(線性回歸),以參考方法測(cè)定值為X,以評(píng)估方法測(cè)定值為Y,采用excel軟件進(jìn)行線性擬合,并采用線性回歸模型進(jìn)行分析。結(jié)果表明,尿沉渣白細(xì)胞計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)侯選物的細(xì)胞濃度值均在95%可信區(qū)間內(nèi)(見(jiàn)圖3),說(shuō)明標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)候選物中的白細(xì)胞與臨床樣本中的白細(xì)胞具有良好的互通性。

圖3 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的互通性分析驗(yàn)證

4 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)量值的不確定度評(píng)定

研制的尿沉渣白細(xì)胞計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)候選物特性量值的不確定度主要來(lái)源于3個(gè)方面：定值方法、均勻性和穩(wěn)定性。后兩者引入的不確定度可參考JJF 1342—2012《標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值的通用原則及統(tǒng)計(jì)學(xué)原理》和相關(guān)研究資料[15～20]進(jìn)行計(jì)算。本標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)候選物采用了兩種方法進(jìn)行定值,因此分別對(duì)這2種測(cè)量方法的不確定度進(jìn)行了分析。

4.1 高通量顯微成像測(cè)量方法的不確定度評(píng)定

該方法可對(duì)鞘液流中高速流過(guò)的單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行快速顯微拍攝,實(shí)現(xiàn)了對(duì)研究對(duì)象的直接絕對(duì)的確認(rèn),同時(shí)高通量分析測(cè)量得到待檢測(cè)細(xì)胞的絕對(duì)數(shù)量或濃度。通過(guò)分析發(fā)現(xiàn),該方法的測(cè)量不確定度來(lái)源主要包括以下2個(gè)方面:

(1)測(cè)量重復(fù)性引入的不確定u1

由表1可知，u1=2.3%。

(2)目標(biāo)細(xì)胞圈門策略引入的不確定度u2

高通量顯微成像測(cè)量方法利用了流式細(xì)胞術(shù)的樣本采集原理實(shí)現(xiàn)高通量測(cè)量,因此目標(biāo)細(xì)胞的識(shí)別也需要通過(guò)相應(yīng)的光學(xué)信號(hào)圖像進(jìn)行圈門,圈門初步?jīng)Q定了細(xì)胞計(jì)數(shù)的個(gè)數(shù)。而常規(guī)流式方法中圈門大小主要取決于實(shí)驗(yàn)操作者的判斷。高通量顯微成像測(cè)量方法可通過(guò)多通道顯微圖像的輔助顯著降低判斷的盲目性和主觀性。3個(gè)操作者分別進(jìn)行圈門計(jì)數(shù),采用獨(dú)立判斷的形式,輔助以顯微鏡拍照肉眼逐一判斷,計(jì)算圈門可能引入的不確定度。經(jīng)統(tǒng)計(jì),u2≈0.8%。

綜上,高通量顯微成像技術(shù)測(cè)量方法的合成相對(duì)不確定度為：

4.2 流式細(xì)胞術(shù)測(cè)量方法的不確定度評(píng)定

本研究的另一定值方法是通過(guò)有標(biāo)稱數(shù)量的標(biāo)準(zhǔn)計(jì)數(shù)微球作為量值參考,采用流式細(xì)胞術(shù)同時(shí)分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)候選物和標(biāo)準(zhǔn)計(jì)數(shù)微球,通過(guò)計(jì)算得到標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)候選物中白細(xì)胞的濃度。其濃度計(jì)算公式為：

式中：CRS為待測(cè)目標(biāo)細(xì)胞濃度,單位為個(gè)每微升(cells/μL)；Ncell為獲取目標(biāo)細(xì)胞群數(shù)量,單位為個(gè)(cells)；Nball為獲取計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)微球群數(shù)量,單位為個(gè)；Qball為樣本中添加的計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)微球數(shù)量,單位為個(gè)；V為待測(cè)樣本加樣體積(不含熒光染料或特異性的熒光染料標(biāo)記單克隆抗體體積,計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)微球懸浮液體積等添加物體積),單位為μL；D為樣本稀釋倍數(shù)。

該方法的測(cè)量不確定度來(lái)源主要包括以下3個(gè)方面：

(1)測(cè)量重復(fù)性引入的不確定u1

由表1可知，u1=1.6%。

(2)計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)微球引入的不確定度u2

通過(guò)本研究采用的計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)微球(BD TrucountTMAbsolute Counting Tubes)使用說(shuō)明書可得到該批次的量值不確定度u2=2.5%。

(3)目標(biāo)細(xì)胞圈門策略引入的不確定度u3

常規(guī)流式方法中圈門大小主要取決于實(shí)驗(yàn)操作者的判斷,判斷的盲目性和主觀性會(huì)引入測(cè)量的不確定度。采用3個(gè)操作者分別進(jìn)行圈門計(jì)數(shù),獨(dú)立判斷的形式,計(jì)算圈門可能引入的不確定度。經(jīng)統(tǒng)計(jì),u3≈2.0%。

綜上,流式細(xì)胞術(shù)測(cè)量方法的合成相對(duì)不確定度為：

=0.036

4.3 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)候選物的不確定度評(píng)定

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的不確定度主要來(lái)自定值的不確定度uchar,瓶間均勻性u(píng)bb,長(zhǎng)期穩(wěn)定性u(píng)s。定值結(jié)果與不確定度來(lái)源見(jiàn)表5,表5中高通量法是高通量顯微成像法的簡(jiǎn)稱，流式法是流式細(xì)胞術(shù)測(cè)量法的簡(jiǎn)稱。

表5 尿沉渣白細(xì)胞計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的不確定度評(píng)定

5 結(jié) 論

尿沉渣有形成分的自動(dòng)化分析是臨床檢驗(yàn)中常規(guī)開展的項(xiàng)目,其測(cè)量的準(zhǔn)確性和可比性對(duì)于提高臨床診療水平和保證大眾健康具有重要的意義。本研究制備的尿沉渣白細(xì)胞計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì),原料來(lái)源于人血液白細(xì)胞,非模擬顆粒。通過(guò)超高分辨顯微技術(shù)與臨床樣本互通性驗(yàn)證充分證明了其與真實(shí)樣本中白細(xì)胞的形態(tài)與生理特性的一致。本研究采用了高通量顯微成像法和流式細(xì)胞術(shù)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)候選物聯(lián)合定值,既保證了該標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的量值可溯源至顯微鏡檢方法,同時(shí)又改善了測(cè)量的不確定度水平。

本標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)經(jīng)驗(yàn)證均勻性和穩(wěn)定性良好,4 ℃避光可保存12個(gè)月,與臨床樣本具有良好的互通性。通過(guò)尿沉渣白細(xì)胞計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制,可為我國(guó)臨床在用的全自動(dòng)尿沉渣分析儀白細(xì)胞測(cè)量項(xiàng)目的測(cè)量準(zhǔn)確性和儀器性能測(cè)試提供技術(shù)、信息和標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)服務(wù),這對(duì)于我國(guó)臨床尿沉渣細(xì)胞有形成分的分析測(cè)量的準(zhǔn)確性、可比性和溯源性,提高臨床檢測(cè)分析的質(zhì)量水平和標(biāo)準(zhǔn)化具有重要意義。