楊冰琪，王競州，龐槐，袁成鋼，張君，王翠喆

(石河子大學醫(yī)學院/新疆地方病與民族高發(fā)病教育部重點實驗室，新疆 石河子 832000)

子宮內膜癌(Endometrial Cancer，EC)是發(fā)生于子宮內膜上皮，最常見的女性生殖道惡性腫瘤。我國癌癥中心2019年最新統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，EC在我國女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤中發(fā)病率居第二位，死亡率居第一位[1]。歐美等國最新數(shù)據(jù)亦顯示，EC在女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤中發(fā)病率居第三位[2]。因EC在早期無明顯癥狀，且檢查手段多為有創(chuàng)性，不易普及，發(fā)現(xiàn)時多為中晚期，且預后較差[3]。

EC可分為I型和II型，肥胖是 Ⅰ 型子宮內膜癌發(fā)生的高危因素。在2012年，全球有大約 31% 的子宮內膜癌病例與超重相關。一組結合了七項前瞻性研究的數(shù)據(jù)顯示：在18至25歲期間，BMI每增加5個單位，Ⅰ 型子宮內膜癌的相對危險就增加42%[4]。大量的臨床資料表明，圍絕經(jīng)期女性體重增加與EC發(fā)生的風險呈正相關，且與預后不良密切相關[5]。然而，肥胖導致EC發(fā)生發(fā)展的具體分子機制，目前尚不十分明確。因此，尋找肥胖相關I型EC發(fā)生發(fā)展的潛在分子機制，將為I型EC的早期診斷、治療及改善預后提供新的思路和理論依據(jù)。

轉錄組測序(RNA sequencing, RNA-Seq)技術可用于分析差異表達基因，因其技術成熟和成本較低，近年來在腫瘤領域廣泛應用。本研究旨在運用RNA-seq技術篩選受試個體EC癌灶及癌旁組織中的差異表達基因，并運用生物信息學技術進一步對篩選出的差異基因進行功能和通路富集分析。將為進一步探索Ⅰ 型EC發(fā)生發(fā)展的相關作用機制提供理論依據(jù)，同時為尋找EC的新型治療靶標奠定基礎。

1 資料與方法

1.1 臨床樣本來源及收納標準

4例受試個體的一般資料、生化指標、EC癌灶及癌旁組織于2019年收集自石河子市石河子大學第一附屬醫(yī)院婦科。收納標注：住院部未接收治療且經(jīng)EC根治手術的子宮內膜組織及血液樣本，新鮮組織樣本經(jīng)-80 ℃處理保存，所選樣本均有對應切緣，且所選樣本臨床資料收集整理完整并獲得患者及家屬知情同意。本研究方案通過了石河子大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院倫理委員會的審查，并批準實施(批準編號：2019-011-01)。

1.2 構建文庫與測序

基于真核生物的mRNA和部分長鏈非編碼RNA(lncRNA)的3’端具有poly A尾結構，通過poly A尾抓取RNA。使用VAHTS Universal V6 RNA-seq Library Prep Kit制備文庫。步驟如下：約1ug的起始量總RNA進行去rRNA處理，通過RNA片段化和逆轉錄反應將RNA反轉為合適大小的cDNA。經(jīng)第二條鏈合成和末端修復(包括5’末端磷酸化和3’末端加A)，兩端加測序接頭完成文庫制備。接著對total RNA文庫進行擴增及磁珠純化，使用Agilent 4200生物分析儀檢測文庫質量，并且通過Qubit 2.0熒光光度計和qPCR絕對定量反應檢測文庫濃度，然后在Illumina HiSeq XTen 平臺上進行2x150bp雙端測序。

1.3 測序數(shù)據(jù)分析

雙端測序得到原始吸測序數(shù)據(jù)(Raw Data)后，使用trimmomatic軟件對數(shù)據(jù)進行過濾，接下來進行去接頭序列以及低質量reads處理，再使用STAR、bowtie2等軟件比對序列并評估測序質量，從而獲得高質量數(shù)據(jù)(Clean Data)，并將Clean Data與參考基因組進行比對，得到BAM文件。對于檢測到的 mRNA，進一步使用htseq-count軟件剔除比對質量低于10的reads，并計算mRNA表達count矩陣。過濾掉在多數(shù)樣本中不表達的基因，并進行標準化。隨后對EC癌灶及癌旁組織進行基因表達量計算。

1.4 篩選差異表達基因

基于預處理的表達矩陣分析樣品間差異表達基因，通過edge R、DESeq2等軟件分析，并以P<0.05且| log2(FC)|>1作為條件篩選。

1.5 分析差異表達基因通路富集分析

通過cluster Profiler軟件對差異表達基因進行Gene Ontology(GO)功能富集分析和Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG)通路富集分析。

2 結果

2.1 受試個體一般資料及生化指標

4例受試個體一般資料及生化指標分析結果顯示：所有受試個體均為超重及肥胖個體(BMI>24)，結果見表1。

表1 受試個體一般資料及生化指標

2.2 組織樣本數(shù)據(jù)處理和質控結果

原始count數(shù)據(jù)存在不同文庫測序深度造成的差異，此外不同基因在樣本中的表達也存在異常值，為了使數(shù)據(jù)之間具有可比性，我們對數(shù)據(jù)進行標準化。對獲取的count數(shù)據(jù)以counts per million(CPM)值過濾，去除在大多數(shù)樣本中不表達的基因(CPM<1的樣本數(shù)>0.5*樣本數(shù))。采用基于負二項分布的DESeq2軟件包對過濾后的計數(shù)數(shù)據(jù)進行標準化處理，校正后各樣本基因表達值中位數(shù)基本在同一水平。本實驗共8個樣本，樣本信息如表2所示。圖1展示了樣本原始read count值和經(jīng)過標準化后read count值的箱線圖及密度圖，箱線圖中經(jīng)過濾及標準化的基因表達值中位數(shù)在同一水平，相比過濾與標準化之前有明顯的差異。密度圖展示了樣本的表達情況，圖中各樣本的表達峰值在同一水平，不同組之間具有可比性，符合后續(xù)分析條件。

表2 樣本信息

圖1 基因表達箱線密度圖

經(jīng)counts值層面的標準化，我們采用主成分分析方法評估樣本間關系。主成分分析是從一組地位相同的眾多變量抽象出互不相關的主成分，每一個主成分代表一個側面，少數(shù)幾個主成分就包含了原始變量的大部分信息。我們以主成分分析方法評估樣本間關系，以及評估原始數(shù)據(jù)的中的極端值。如圖2所示，圖中組間具有一定的差異性，組內有較好的一致性，且未見異常樣本，說明從樣本采集到獲取測序數(shù)據(jù)全流程是可靠的，可重復的，可用于后續(xù)分析。

圖2 主成分分析圖

2.3 基因表達差異分析

我們使用R軟件DESeq2包比較癌灶和癌旁組織間的基因表達水平差異。以P<0.05且|log2(FC)|>1作為條件，共篩選出2 451個差異表達基因，包含1 697個在EC癌灶組織中上調的基因和754個下調的基因(圖3)。

圖3 EC癌灶與癌旁組織RNA-seq結果分析

2.4 差異基因GO功能富集分析

通過對差異表達基因做GO功能注釋，進一步挖掘了各個基因所代表的生物學意義。此次分析中，我們將GO系統(tǒng)分為生物學過程(biological process, BP)、分子功能(molecular functions, MF)、細胞組分(cellular components, CC)。GO功能分析結果顯示，上調基因主要富集于26個條目：細胞-細胞粘附調節(jié)、有絲分裂核分裂、有絲分裂姐妹染色單體分離、白血球細胞-細胞粘附、有絲分裂中期/后期過渡細胞循環(huán)、T細胞活化的正向調節(jié)、染色體分離的調節(jié)、T細胞活化的調控、調節(jié)淋巴細胞激活、微管、內質網(wǎng)伴侶復合物、脫氧核糖核酸包裝復合體、細胞-細胞連接、核小體、細胞頂端部分、中間體、細胞皮質、細胞皮層部分、微管結合、錯誤折疊蛋白結合、蛋白質折疊中的蛋白質結合等(圖4A、B)；下調基因主要富集于29個條目：肌肉系統(tǒng)進程、細胞-底物粘附、細胞外基質組織、多細胞生物信號轉導、整合素介導的信號通路、細胞基板結、灶性粘連、肌絲、含膠原的細胞外基質、肌纖維膜、鈣通道復合體、運輸復合體、肝素結合、糖胺聚糖結合、肌動蛋白結合、鈣離子跨膜轉運蛋白活性、細胞外基質結構成分、離子通道活性等(圖4C、D)。以上結果提示：EC的發(fā)生發(fā)展與細胞間粘附調節(jié)、有絲分裂進程、錯誤蛋白折疊結合等一系列生物學進程密切相關。

A, B:上調的差異基因；C, D:下調的差異基因。圖4 GO功能富集分析

2.5 差異基因KEGG功能富集分析

為進一步明確上述差異表達基因所存在的關鍵信號通路，我們對差異表達基因集進行KEGG數(shù)據(jù)庫的生物通路富集分析，結果顯示，上調基因KEGG功能富集主要在以下15條通路：系統(tǒng)性紅斑狼瘡、中性粒細胞細胞外陷阱形成、病毒致癌作用、細胞周期、Hippo信號通路、B細胞受體信號通路、細胞凋亡、軸突導向、p53信號通路、細胞粘附分子等(圖5A、B)；下調基因KEGG功能富集主要在以下15條通路：致心律失常性右心室心肌病、肥厚型心肌病、擴張型心肌病、細胞外基質受體相互作用、灶性粘連、促性腺激素釋放激素分泌、鈣信號通路、晝夜夾帶、心肌收縮、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路、蛋白質消化和吸收等(圖5C、D)。以上結果提示：EC的發(fā)生發(fā)展與病毒致癌、細胞周期、Hippo信號通路、細胞凋亡、p53信號通路等密切相關。

A-B：上調的差異基因；C-D：下調的差異基因。圖5 KEGG功能富集分析

3 討論

EC作為女性三大惡性腫瘤之一，常見于圍絕經(jīng)期婦女，常伴有肥胖、糖尿病及高血壓等代謝性病癥[6]。與多數(shù)腫瘤相同，EC的治療手段以手術治療為主，以激素治療與放化療等治療手段為輔，但效果欠佳[7]。近年來，隨著新型靶向藥物的出現(xiàn)，精準治療與個體化治療方案已成為治療EC的新方向。已有研究表明，多種因素共同作用可導致EC的多階段致病過程，其中可能與多種基因的異常表達密切相關[8]。

本研究通過使用RNA-Seq技術篩選EC癌灶與癌旁組織中的差異表達基因后發(fā)現(xiàn)，EC癌灶與癌旁組織之間存在2 451個差異表達基因，包含1 697個上調基因和754個下調基因(P<0.05且|log2(FC)|>1)。隨后對以上基因進行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，結果提示：差異基因主要與細胞間粘附調節(jié)、有絲分裂進程、錯誤蛋白折疊結合等一系列生物學進程密切相關，并富集在病毒致癌、細胞周期、Hippo信號通路、細胞凋亡、p53等信號通路。

已有研究指出，Hippo信號通路可影響多種癌癥的發(fā)展進程，Hippo通路下游的核心因子，在雌激素相關的EC中高表達，其核內表達水平與腫瘤浸潤、分期分型、復發(fā)轉移密切相關[9-10]。p53作為一種常見的抑癌基因，可修復細胞內DNA損傷，調節(jié)細胞周期，調控轉錄基因，導致細胞凋亡或衰老，從而抑制多種細胞癌變[11]。已有研究報道，p53突變后，CN-H型EC模型更易復發(fā)和遠處轉移[12-13]。本研究進一步證實：Hippo信號通路、p53信號通路在EC中的關鍵性，提示上述信號通路可能是EC預防與治療的重要靶標之一。

本研究亦發(fā)現(xiàn)，中性粒細胞胞外誘捕網(wǎng)(Neutrophil extracellular traps, NETs)和病毒致癌相關通路高富集于EC癌灶組織中，且這兩條通路富集到的差異表達基因多為組蛋白簇。已有研究表明：多種腫瘤的病理切片中均有大量NETs，而腫瘤相關中性粒細胞和細胞外染色質積累可形成NETs，以促進癌癥發(fā)生[14-15]。此外，HMGB1和組蛋白通過 TLR4/9信號通路促進 NETs 生成[16-18]，發(fā)揮促進腫瘤生長并誘導結腸癌轉移病灶形成[19]，但目前尚未有文獻提出NETs信號通路在EC發(fā)生發(fā)展中的具體作用。因此，NETs信號通路有望成為預防與治療EC的新靶點。

綜上，本研究基于RNA-seq技術分析比較了EC癌灶及癌旁組織中的差異表達基因，發(fā)現(xiàn)EC的發(fā)生發(fā)展與多條通路密切相關，其中Hippo信號通路、p53信號通路和NETs信號通路可能在Ⅰ 型EC發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。本研究將為進一步探索EC發(fā)生發(fā)展的提供理論依據(jù)，同時為尋找治療 Ⅰ 型EC的新型藥物作用靶點提供新的思路和方向。