張彥兵，魏立翔，解藝璇，李增強(qiáng)，李珂兒，孫延鳴

(石河子大學(xué)動物科技學(xué)院，新疆 石河子 832003)

綿羊肺炎支原體(Mycoplasma ovipneumoniae，MO)感染致病的主要原因是，引發(fā)肺部強(qiáng)烈的炎性反應(yīng)導(dǎo)致肺部病理損傷[1-2]；腫瘤壞死因子α (Tumor necrosis factor α，TNF-α)等炎性細(xì)胞因子在MO感染的綿羊肺部高水平表達(dá)[3]，則促進(jìn)綿羊肺部炎癥反應(yīng)。TNF-α是一種多功能的細(xì)胞因子，參與眾多生物學(xué)過程，因其可以殺傷體內(nèi)的腫瘤細(xì)胞而被發(fā)現(xiàn)[4-5]，在病原菌以及LPS刺激時，綿羊體內(nèi)的TNF-α表達(dá)量顯著增加[6]。先前的文獻(xiàn)報道，豬TNF-α表達(dá)與其啟動子激活密切相關(guān)[7-8]。但是，綿羊TNF-α高水平產(chǎn)生的機(jī)理不明，以及綿羊TNF-α啟動子尚未克隆，需要進(jìn)一步研究。

綿羊TNF-α定位于20號染色體上，其高表達(dá)于綿羊肺泡巨噬細(xì)胞[9]。已知，人源TNF-α啟動子上含有轉(zhuǎn)錄因子：AP-1、AP-2、NF-κB和cAMP響應(yīng)元件(CRE)等，上述轉(zhuǎn)錄因子對于炎性刺激物脂多糖(LPS)也較為敏感[10-12]。另外TNF-α啟動子甲基化水平與其表達(dá)相關(guān)，如LPS刺激豬源、雞源細(xì)胞會降低TNF-α啟動子甲基化水平，易于TNF-α高水平轉(zhuǎn)錄表達(dá)[8,13]。然而，綿羊TNF-α啟動子上具有哪些轉(zhuǎn)錄因子還不清楚，有待于進(jìn)一步研究。

本文旨在克隆綿羊TNF-α啟動子，構(gòu)建啟動子熒光素酶報告載體并驗(yàn)證活性，預(yù)測綿羊TNF-α啟動子上潛在的轉(zhuǎn)錄因子；這將弄清楚綿羊TNF-α啟動子的基本特征，為后續(xù)從轉(zhuǎn)錄調(diào)控、基因啟動子甲基化等方面，解析MO感染綿羊誘導(dǎo)產(chǎn)生高水平TNF-α的機(jī)理打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑和細(xì)胞

DMEM培養(yǎng)基(HyClone)、胎牛血清(GibcoTM)、PBS(HyClone)、DMSO(二甲基亞砜，Sigma)、雙熒光素酶活性檢測試劑盒(Promega)、DNA提取試劑盒(諾唯贊生物公司)、大腸桿菌DH5α(生工生物公司)、LA taq酶和限制性內(nèi)切酶(TaKaRa中國)；pGL3-Basic質(zhì)粒(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所邱亞峰研究員饋贈)，引物由生工生物公司(鄭州)合成。

細(xì)胞系：HEK293T細(xì)胞用含有10%胎牛血清(FBS)和抗生素(100 U·mL-1青霉素和100 U·mL-1鏈霉素)的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.2 啟動子預(yù)測及其活性區(qū)域預(yù)測

利用UCSC(https://genome.ucsc.edu/)數(shù)據(jù)庫和National Center for Biotechnology Information(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)數(shù)據(jù)庫分別預(yù)測綿羊TNF-α基因啟動子，利用DNASTAR Version7.1.0(44)軟件比對預(yù)測的TNF-α啟動子序列，分析序列同源性。利用在線軟件Berkeley Drosophila Genome Project(https://www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html)預(yù)測啟動子可能的活性區(qū)域，進(jìn)一步設(shè)計(jì)引物(表1)。

表1 引物序列

1.3 綿羊TNF-α基因啟動子克隆及載體構(gòu)建

利用試劑盒提取薩?？司d羊肺組織DNA作為模板，擴(kuò)增TNF-α基因啟動子，擴(kuò)增反應(yīng)體系及程序如下：LA taq 0.3 μL，dNTPs(2.5mM)4.5 μL，10×LA buffer(Mg2+)5 μL，DNA 2 μL，上下游引物各2 μL，ddH2O 34.7 μL；反應(yīng)程序：預(yù)變性95 ℃ 3 min，進(jìn)入35個循環(huán)95 ℃ 15 s，62 ℃ 15 s，72 ℃ 1 min；最后72 ℃ 7 min。PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠分析，按照試劑盒說明回收DNA并測序，測序確認(rèn)擴(kuò)增的序列正確后，并將其連接到pGL3-Basic載體中得到報告質(zhì)粒pGL3-TNF-α。具體操作如下，首先用KpnI和XhoI線性化pGL3-Basic載體，膠回收備用；連接體系：T4 DNA連接酶 1 μL，線性化載體 2 μL，純化的片段 15 μL，10×buffer 2 μL,16 ℃水浴反應(yīng)過夜，直接轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑選陽性克隆大量培養(yǎng)提取質(zhì)粒。酶切驗(yàn)證后，在生工生物工程(上海)股份有限公司測序，以pGL3-Basic載體的通用引物RVprimer3和GLprimer2雙端測序驗(yàn)證。

1.4 綿羊TNF-α基因啟動子活性驗(yàn)證

將較高轉(zhuǎn)染效率的HEK293T細(xì)胞接種24孔板，過夜培養(yǎng)后，將300 ng pGL3-TNF-α質(zhì)粒及6ng 的pRL-TK質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，同時共轉(zhuǎn)染300ng的pGL3-Basic和6ng 的pRL-TK質(zhì)粒作為對照組，轉(zhuǎn)染24 h后利用Promega雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)檢測啟動子活性；具體檢測過程如下：用蒸餾水將5×Passive Lysis Buffer(PLB)稀釋為1×PLB備用；LAR II：根據(jù)試劑盒說明利用Luciferase Assay Buffer II將Luciferase Assay Substrate粉末溶解，充分混勻后分裝凍存在-70°C；根據(jù)所需用Stop & Glo?Buffer將50×Stop & Glo?Substrate稀釋為1×Stop & Glo?Substrate備用；用室溫PBS洗滌細(xì)胞三遍，24孔板每孔加入100 μL 1×PLB，室溫震蕩裂解30 min，將裂解液轉(zhuǎn)移至離心管，離心后取上清備用；螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶的活性檢測：1.5 mL離心管中加入50 μL LAR II，加入細(xì)胞裂解上清液10 μL混勻立即讀數(shù)，結(jié)束后迅速加入50 μL 1×Stop & Glo?Substrate混勻并讀數(shù)，記錄數(shù)值，計(jì)算螢火蟲熒光素酶與海腎熒光素酶活性的比值。

1.5 綿羊TNF-α基因啟動子轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測

分析預(yù)測綿羊TNF-α基因啟動子上潛在的轉(zhuǎn)錄結(jié)合因子，打開AliBaba2.1軟件(http://gene-regulation.com/pub/programs/alibaba2/index.html)，將分析序列粘貼至對話框，點(diǎn)擊分析按鈕，預(yù)測完畢后會顯示轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合序列的區(qū)域及其名稱等信息，選擇評分較高排名較前的轉(zhuǎn)錄因子，標(biāo)注出具體區(qū)域及轉(zhuǎn)錄因子名稱。

2 結(jié)果

2.1 綿羊TNF-α基因啟動子及其活性預(yù)測、克隆及報告載體構(gòu)建

從不同數(shù)據(jù)庫預(yù)測所得綿羊TNF-α基因啟動子同源性高達(dá)99.9%，僅存在1個堿基的差異(圖1)。

圖1 不同數(shù)據(jù)庫預(yù)測的綿羊TNF-α啟動子序列比對

通過對啟動子活性區(qū)域預(yù)測，發(fā)現(xiàn)綿羊TNF-α基因啟動子含有2個潛在的活性區(qū)域，啟動子活性區(qū)域中含有典型的TATA-box元件(圖2)。

圖2 綿羊TNF-α基因啟動子及其活性區(qū)域預(yù)測

基于對綿羊TNF-α啟動子預(yù)測和活性區(qū)域分析，確定擴(kuò)增在翻譯起始位點(diǎn)上游-659到-172的區(qū)域。以綿羊肺組織DNA為模板成功擴(kuò)增到目的片段(488 bp)(圖3A)；將擴(kuò)增的DNA片段和pGL3-Basic質(zhì)粒雙酶切、連接，構(gòu)建pGL3-TNF-α熒光素酶報告質(zhì)粒；KpnI和XhoI雙酶切質(zhì)粒后，出現(xiàn)線性化的pGL3-Basic載體條帶和綿羊TNF-α啟動子條帶(圖3B)，雙酶切驗(yàn)證后將質(zhì)粒送生物公司測序，測序獲得序列與預(yù)測的一致。成功克隆了綿羊TNF-α基因啟動子，并構(gòu)建了pGL3-TNF-α熒光素酶報告質(zhì)粒。

圖3 綿羊TNF-α啟動子擴(kuò)增(A)，熒光素酶報告載體雙酶切驗(yàn)證(B)

2.2 綿羊TNF-α啟動子活性驗(yàn)證

將熒光素酶報告質(zhì)粒pGL3-TNF-α轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染24 h后，按照Promage公司雙熒光素酶檢測說明分析TNF-α啟動子活性，結(jié)果顯示，克隆的綿羊TNF-α啟動子活性是basic活性的16倍左右(圖4)，說明克隆的綿羊TNF-α啟動子具有較強(qiáng)的活性。

**代表p<0.01，差異顯著圖4 綿羊TNF-α啟動子活性測定

2.3 預(yù)測綿羊TNF-α啟動子上潛在的轉(zhuǎn)錄因子

綿羊TNF-α啟動子的激活需要轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，因此，進(jìn)一步利用轉(zhuǎn)錄因子軟件分析可能的結(jié)合靶點(diǎn)。本文只選擇了評分較高、排名靠前的轉(zhuǎn)錄因子，Sp1(Specificity protein 1，Sp1)、C/EBPalp、c-Jun等；Sp1有6個結(jié)合區(qū)域，C/EBPalp有2個結(jié)合區(qū)域，c-Jun有1個結(jié)合區(qū)域；轉(zhuǎn)錄因子及其結(jié)合序列用不同的顏色進(jìn)行了標(biāo)注，如圖5所示。

圖5 綿羊TNF-α基因啟動子轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測結(jié)果

3 討論

綿羊肺炎支原體感染往往會誘導(dǎo)產(chǎn)生高水平的炎性因子TNF-α等，高水平分泌的炎性因子則促進(jìn)炎性反應(yīng)。強(qiáng)烈的炎性反應(yīng)是導(dǎo)致綿羊肺部損傷的重要原因之一，然而激活綿羊TNF-α高水平產(chǎn)生的機(jī)制不清楚。已有的文獻(xiàn)報道，人和豬的TNF-α高水平產(chǎn)生與其啟動子激活密切相關(guān)[8]。因此，本文開展綿羊TNF-α啟動子的研究，我們成功克隆了綿羊TNF-α啟動子，驗(yàn)證了啟動子活性，初步分析預(yù)測了啟動子上潛在的轉(zhuǎn)錄因子。

克隆的綿羊TNF-α啟動子位于翻譯起始位點(diǎn)上游-659至-172的區(qū)域，啟動子含有兩個典型的TATA-box；TATA結(jié)合蛋白(TATA-binding protein，TBP)識別啟動子區(qū)域TATA-box并結(jié)合RNA聚合酶II開始轉(zhuǎn)錄。此外，預(yù)測的綿羊TNF-α啟動子活性區(qū)域正好包含TATA-box。通過構(gòu)建綿羊TNF-α啟動子報告質(zhì)粒，以及質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞檢測雙熒光素酶活性，證明綿羊TNF-α啟動子具有很高的活性，證明綿羊TNF-α啟動子被成功鑒定，綿羊TNF-α啟動子的成功克隆為深入研究啟動子激活調(diào)控其表達(dá)的機(jī)制打下初步基礎(chǔ)。

基因啟動子區(qū)域DNA甲基化水平升高會抑制基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)，反之則利于基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)[15-16]。據(jù)報道，人、豬等物種TNF-α啟動子甲基化參與調(diào)控其表達(dá)[17-19]，如LPS刺激豬肺泡巨噬細(xì)胞可誘導(dǎo)TNF-α啟動子區(qū)域去甲基化[8]，有利于TNF-α轉(zhuǎn)錄表達(dá)；那么，在MO感染中，綿羊TNF-α啟動子區(qū)域甲基化水平是否會發(fā)生變化，以及綿羊TNF-α啟動子區(qū)域甲基化是否與其表達(dá)相關(guān)，均不清楚。目前，已成功克隆和鑒定綿羊TNF-α啟動子，為進(jìn)一步探索綿羊TNF-α啟動子區(qū)域甲基化調(diào)控其轉(zhuǎn)錄表達(dá)奠定基礎(chǔ)。

新近的研究表明豬源TNF-α轉(zhuǎn)錄激活與其啟動子上的轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)相關(guān)，例如，IRF1通過結(jié)合豬源TNF-α啟動子反應(yīng)元件促進(jìn)啟動子活性[7]。然而，激活綿羊TNF-α啟動子的轉(zhuǎn)錄因子還不清楚，通過對克隆的綿羊TNF-α啟動子序列預(yù)測分析，預(yù)測獲得了9個轉(zhuǎn)錄因子，分為Sp1、C/EBPalp和c-Jun三種。先前的研究證實(shí)，人源Sp1可以結(jié)合Fbxl2 基因啟動子激活其高水平表達(dá)[20]，Sp1還參與激活HIV-1 LTR(long terminal repeat，LTR)的轉(zhuǎn)錄表達(dá)[21]。因此，轉(zhuǎn)錄因子Sp1在結(jié)合促進(jìn)啟動子激活方面發(fā)揮重要作用。另外，鱸魚TRAIL(Tumor necrosis factor related apoptosis-inducing ligand，TRAIL)啟動子區(qū)域上也含有Sp1、C/EBPalp和NF-kappaB等轉(zhuǎn)錄因子[22]。與之類似的是，綿羊TNF-α啟動子上也預(yù)測到了Sp1和C/EBPalp等轉(zhuǎn)錄因子。然而，綿羊TNF-α啟動子上潛在的上述3種轉(zhuǎn)錄因子，是否可以激活TNF-α的表達(dá)還需要進(jìn)一步研究。我們會在將來克隆Sp1、C/EBPalp、c-Jun等基因并構(gòu)建真核表達(dá)載體，利用轉(zhuǎn)錄因子與啟動子共轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄因子的作用。

總之，本文成功克隆了綿羊TNF-α啟動子，利用報告基因系統(tǒng)驗(yàn)證綿羊TNF-α啟動子具有很高的活性，初步鑒定了綿羊TNF-α啟動子；進(jìn)一步，預(yù)測了綿羊TNF-α啟動子上潛在的轉(zhuǎn)錄因子。本文為將來探討轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控綿羊TNF-α基因啟動子的激活，以及研究DNA甲基化調(diào)節(jié)綿羊TNF-α啟動子激活等研究打下基礎(chǔ)；最終可為將來解析MO等病原微生物感染導(dǎo)致綿羊TNF-α上調(diào)表達(dá)的機(jī)制奠定基礎(chǔ)，也為綿羊TNF-α啟動子其他相關(guān)研究提供數(shù)據(jù)參考。