李盼盼 李潤(rùn)林 吳佳慶 雷銘康 汪 晶* 朱偉云

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，南京 210095；2.國(guó)家動(dòng)物消化道營(yíng)養(yǎng)國(guó)際聯(lián)合研究中心，南京 210095)

植物提取物是利用物理或化學(xué)方法從天然植物中提取出來(lái)的，由于其綠色安全且無(wú)明顯毒副作用，并且具有一定的免疫調(diào)節(jié)作用[1]，逐漸被應(yīng)用于豬、禽、反芻動(dòng)物等的養(yǎng)殖中，發(fā)揮抑菌、抗炎、促進(jìn)腸道健康等作用[2]。由于單一植物提取物的功能及作用位點(diǎn)較為單一，而復(fù)合植物提取物中多種有效活性成分的疊加或協(xié)同作用可以在發(fā)揮單一植物提取物原有功能的基礎(chǔ)上增強(qiáng)其作用效果、增加作用靶點(diǎn)，從而更加有效地解決動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中所面臨的健康問(wèn)題。

橙皮苷(hesperidin)是一種主要存在于柑橘類植物中的黃烷酮類化合物，水溶性較差。黃酮類化合物的抗氧化活性與其化學(xué)結(jié)構(gòu)中的酚羥基有關(guān)[3]，它主要通過(guò)2種方式來(lái)減輕動(dòng)物機(jī)體的氧化反應(yīng)，一是清除過(guò)多的自由基，二是通過(guò)激活細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK)/核因子2相關(guān)因子2(Nrf2)信號(hào)通路來(lái)增強(qiáng)細(xì)胞的防御功能[4]。研究表明橙皮苷可以提高腸道緊密連接蛋白表達(dá)，降低腸道通透性，并且通過(guò)抑制核因子-κB(NF-κB)和激活蛋白-1(AP-1)的激活，降低炎癥因子水平，緩解腸道炎癥[5-6]。橙皮苷還具有較強(qiáng)的抗菌活性，可以在一定程度上抑制大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等有害菌的生長(zhǎng)，其作用機(jī)制可能是通過(guò)改變細(xì)菌細(xì)胞膜通透性來(lái)影響細(xì)菌生長(zhǎng)[7]。迷迭香酸(rosmarinic acid)是一種主要存在于唇形科、紫草科、葫蘆科等植物中的水溶性酚酸類化合物，對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑制作用較強(qiáng)，它主要通過(guò)增加細(xì)菌細(xì)胞膜通透性、影響細(xì)菌蛋白質(zhì)代謝以及DNA復(fù)制等發(fā)揮抑菌作用[8]。植物提取物中酚羥基數(shù)目越多，抗氧化能力越強(qiáng)[3]，迷迭香酸化學(xué)結(jié)構(gòu)中有4個(gè)酚羥基，橙皮苷化學(xué)結(jié)構(gòu)中有2個(gè)酚羥基，表明迷迭香酸抗氧化能力強(qiáng)于橙皮苷。迷迭香酸發(fā)揮抗氧化作用主要通過(guò)減少活性氧的產(chǎn)生，調(diào)節(jié)谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)等抗氧化酶的活性來(lái)實(shí)現(xiàn)[9]。目前，橙皮苷或迷迭香酸大多是單獨(dú)添加到大鼠結(jié)腸炎模型[6,10]、結(jié)腸癌模型[11]或炎癥細(xì)胞模型[12]中探究其藥理作用。但是橙皮苷的應(yīng)用有一定的局限性，其分子結(jié)構(gòu)以糖苷形式存在，導(dǎo)致水溶性較差，生物利用度低，不易被腸道上皮細(xì)胞吸收利用[13]，通過(guò)酸水解對(duì)橙皮苷進(jìn)行脫糖基處理，制備的橙皮素單葡萄糖苷和橙皮素的溶解度顯著增加[14]。我們推測(cè)橙皮苷和迷迭香酸配合使用時(shí)，酚酸類化合物迷迭香酸不僅能發(fā)揮抗氧化、抑菌、抗炎等功能，還可能為橙皮苷提供酸水解的條件，進(jìn)而提高橙皮苷的利用效率，從而有助于調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)，緩解腸道炎癥反應(yīng)。

脂多糖(LPS)是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁的組成成分，在細(xì)菌死亡或細(xì)胞壁破裂時(shí)釋放量增加。LPS通過(guò)激活Toll樣受體4(TLR4)/髓樣分化因子88(MyD88)/NF-κB信號(hào)通路刺激腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-1(IL-1)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)等促炎因子的產(chǎn)生，加劇炎癥反應(yīng)[15]，常被用于構(gòu)建腸道炎癥模型。因此，本試驗(yàn)以SD大鼠作為研究對(duì)象，通過(guò)腹腔注射劑量為500 μg/kg BW的LPS構(gòu)建急性腸道損傷模型，探究橙皮苷和迷迭香酸組合對(duì)LPS攻毒大鼠回腸形態(tài)、菌群結(jié)構(gòu)以及炎癥反應(yīng)的影響，旨在為橙皮苷和迷迭香酸組合應(yīng)用于畜禽養(yǎng)殖中提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

無(wú)特定病原體(SPF)級(jí)SD斷奶大鼠購(gòu)自南京市江寧區(qū)青龍山動(dòng)物繁育場(chǎng)；橙皮苷和迷迭香酸均購(gòu)自某科技有限公司，純度≥98%；LPS購(gòu)自索萊寶生物科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)選取體重為(54.65±1.18)g、健康狀況良好的SPF級(jí)斷奶SD大鼠共32只，適應(yīng)7 d后，將大鼠隨機(jī)分成4組：LPS組(每日灌胃2 mL無(wú)菌生理鹽水)、Hes組(每日灌胃300 mg/kg BW橙皮苷)、RA組(每日灌胃20 mg/kg BW迷迭香酸)、Hes×RA組(每日灌胃150 mg/kg BW橙皮苷+10 mg/kg BW迷迭香酸)。每組4個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)2只大鼠(公母各占1/2)。試驗(yàn)期間各組大鼠均飼喂標(biāo)準(zhǔn)基礎(chǔ)飼糧，自由采食和飲水。動(dòng)物房溫度在25 ℃左右，相對(duì)濕度在60%左右，每天光照和黑暗均為12 h。試驗(yàn)正試期為14 d，在第13天，所有大鼠腹腔注射劑量為500 μg/kg BW的LPS溶液，12 h后，用乙醚將大鼠麻醉并解剖，采集大鼠回腸食糜和黏膜于液氮中保存，用于后續(xù)分析。動(dòng)物試驗(yàn)依照南京農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心管理制度執(zhí)行，試驗(yàn)方案經(jīng)該機(jī)構(gòu)動(dòng)物福利與倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.3 測(cè)定指標(biāo)和方法

1.3.1 回腸形態(tài)觀察

剪取1 cm左右回腸組織于4%多聚甲醛中固定24 h，經(jīng)乙醇梯度脫水、石蠟包埋、切片、脫蠟，最后再進(jìn)行蘇木精-伊紅(HE)染色后封片。切片置于虛擬顯微鏡上進(jìn)行拍照，使用Image-Pro Plus軟件測(cè)量絨毛高度以及隱窩深度，并計(jì)算絨隱比(絨毛高度/隱窩深度)。

1.3.2 回腸黏膜中髓過(guò)氧化物酶(MPO)活性和細(xì)胞因子含量檢測(cè)

稱取0.1 g回腸黏膜樣品制備成10%的勻漿液，使用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)試劑盒測(cè)定髓過(guò)氧化物酶(MPO)活性和細(xì)胞因子(IL-6、TNF-α、IL-10)含量。試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所，試驗(yàn)操作按照說(shuō)明書(shū)要求進(jìn)行。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))

1.3.3 回腸食糜微生物16S rRNA測(cè)序

按照Z(yǔ)oetendal等[17]的方法進(jìn)行回腸食糜微生物DNA提取，并利用微量分光光度計(jì)(Thermo ND-1000，美國(guó))檢測(cè)到的260和280 nm處DNA的比值評(píng)價(jià)DNA質(zhì)量。根據(jù)16S rRNA的保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物，上游引物319F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和下游引物806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)用于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增16S rRNA基因的V3～V4區(qū)[18]。PCR產(chǎn)物基于Illumina-MiSeq PE300平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序分析。

1.3.4 回腸食糜中微生物代謝產(chǎn)物短鏈脂肪酸(SCFAs)含量測(cè)定

使用GC-2014A型氣相色譜儀(氫火焰離子化檢測(cè)器，島津，日本)測(cè)定回腸食糜中SCFAs的含量。根據(jù)Wang等[19]的方法，使用柱長(zhǎng)30 m，膜厚0.25 μm，內(nèi)徑寬0.32 mm的毛細(xì)管柱，柱溫設(shè)置為140 ℃，進(jìn)樣口溫度為180 ℃，檢測(cè)器溫度為180 ℃，進(jìn)樣量為0.3 μL。

1.3.5 回腸黏膜中緊密連接蛋白基因和TLR4/MyD88信號(hào)通路相關(guān)基因mRNA相對(duì)表達(dá)量測(cè)定

回腸黏膜總RNA使用Trizol試劑(南京諾唯贊生物科技股份有限公司)進(jìn)行提取，并使用微量分光光度計(jì)(Thermo ND-2000，美國(guó))進(jìn)行RNA質(zhì)量以及濃度的檢測(cè)。參照說(shuō)明書(shū)將1 μg的總RNA加入到HiScript?Ⅲ All-in-one RT SuperMix Perfect for qPCR試劑盒(Vazyme，南京)的反應(yīng)體系中，在DNA擴(kuò)增儀(Long Gene?)上設(shè)置反應(yīng)程序?yàn)?0 ℃持續(xù)15 min，85 ℃持續(xù)5 s，將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，反轉(zhuǎn)錄后的cDNA置于-80 ℃保存。將cDNA加入到ChamQ SYBR qPCR試劑盒(Vazyme，南京)的反應(yīng)體系中，利用熒光定量PCR儀進(jìn)行熒光定量。選擇β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)作為內(nèi)參基因，使用2-ΔΔCt法計(jì)算ZO-1、Claudin-1、Occludin、TLR4、MyD88、IRAK1和TRAF6的mRNA相對(duì)表達(dá)量。引物由上海生工生物工程股份有限公司合成，引物序列如表2所示。

表2 緊密連接蛋白基因和TLR4/MyD88信號(hào)通路相關(guān)基因的引物序列

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)首先使用Excel 2019進(jìn)行整理，整理后的數(shù)據(jù)利用SPSS 26.0分析軟件進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)，若差異顯著則使用Duncan氏法進(jìn)行多重比較分析，之后用GraphPadPrism 8、Origin 2021和Excel 2019分別制作成圖表。結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。P<0.05表示顯著差異，0.05≤P<0.10表示差異有顯著的趨勢(shì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 LPS攻毒大鼠回腸形態(tài)的變化

由圖1可以看出，LPS組出現(xiàn)腸絨毛斷裂，腸道上皮受損，Hes×RA組腸絨毛排列整齊，形態(tài)完好。由表3可知，與LPS組相比，Hes組、RA組以及Hes×RA組大鼠回腸的絨毛高度以及絨隱比顯著提高(P<0.05)，回腸隱窩深度沒(méi)有顯著變化(P>0.05)。

圖1 各組大鼠回腸組織切片

表3 橙皮苷、迷迭香酸及其組合對(duì)LPS攻毒大鼠回腸形態(tài)的影響

2.2 LPS攻毒大鼠回腸食糜微生物及其代謝產(chǎn)物的變化

2.2.1 LPS攻毒大鼠回腸食糜微生物多樣性的變化

使用ACE指數(shù)、Chao1指數(shù)、Shannon指數(shù)以及Simpson指數(shù)分析LPS攻毒大鼠食糜微生物的alpha多樣性。其中，ACE指數(shù)和Chao1指數(shù)代表微生物豐富度，Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)代表微生物多樣性。從表4可以看出，與LPS組相比，Hes組、RA組、Hes×RA組大鼠回腸食糜微生物的ACE指數(shù)、Chao1指數(shù)、Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)均沒(méi)有顯著變化(P>0.05)。大鼠回腸食糜微生物的beta多樣性分析基于操作分類單元(OTU)水平采用Bray-Curtis的距離算法進(jìn)行主坐標(biāo)分析(PCoA)。如圖2所示，LPS組、Hes組、RA組和Hes×RA組的微生物聚類分開(kāi)，4組間呈現(xiàn)出顯著差異(R=0.661 3，P=0.001 0)。

表4 橙皮苷、迷迭香酸及其組合對(duì)LPS攻毒大鼠回腸食糜微生物α多樣性的影響

圖2 橙皮苷、迷迭香酸及其組合對(duì)LPS攻毒大鼠回腸食糜微生物beta多樣性的影響

2.2.2 LPS攻毒大鼠回腸食糜微生物組成的變化

如圖3-A所示，在門(mén)水平，大鼠回腸食糜微生物中優(yōu)勢(shì)菌門(mén)主要是厚壁菌門(mén)(Firmicutes)、放線菌門(mén)(Actinobacteria)和擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)。對(duì)門(mén)水平上相對(duì)豐度較高的3個(gè)菌門(mén)進(jìn)行顯著性分析，結(jié)果顯示，與LPS組相比，Hes組和Hes×RA組Actinobacteria的相對(duì)豐度顯著降低(P<0.05，圖3-C)，Hes組、RA組和Hes×RA組變形菌門(mén)(Proteobacteria)的相對(duì)豐度顯著降低(P<0.05，圖3-D)，Hes組、RA組和Hes×RA組Firmicutes的相對(duì)豐度有所提高但差異不顯著(P>0.05，圖3-E)。在屬水平，大鼠回腸食糜微生物中相對(duì)豐度前30的菌屬如圖3-B所示，LPS組的優(yōu)勢(shì)菌屬主要是乳桿菌屬(Lactobacillus)和棒狀桿菌屬(Corynebacterium)，其他3組的優(yōu)勢(shì)菌屬均為L(zhǎng)actobacillus。對(duì)屬水平上的相對(duì)豐度較高的3個(gè)菌屬進(jìn)行顯著性分析，結(jié)果顯示，與LPS組相比，Hes組、RA組和Hes×RA組Lactobacillus的相對(duì)豐度顯著升高(P<0.05，圖3-F)，Corynebacterium的相對(duì)豐度顯著降低(P<0.05，圖3-G)；此外，Hes組和Hes×RA組鏈球菌屬(Streptococcus)的相對(duì)豐度顯著降低(P<0.05，圖3-H)。

Firmicutes:厚壁菌門(mén)；Actinobacteria：放線菌門(mén)；Bacteroidetes：擬桿菌門(mén)；Cyanobacteria：藍(lán)藻門(mén)；Desulfobacterota：脫硫桿菌門(mén)；Proteobacteria：變形菌門(mén)；Verrucomicrobiota：疣微菌門(mén)；Others：其他；Lactobacillus：乳桿菌屬；Corynebacterium：棒狀桿菌屬;Streptococcus：鏈球菌屬；Romboutsia：羅姆布茨菌屬；Akkermansia：阿克曼氏菌屬；Turicibacter：蘇黎世桿菌屬；Bifidobacterium：雙歧桿菌屬；Aerococcus：氣球菌屬；Jeotgalicoccus：熱球菌屬；Rothia：羅氏菌屬；Enterorhabdus：腸桿菌屬；Facklamia：費(fèi)克藍(lán)姆菌屬；unclassified_c_Bacilli：未分類的桿菌綱；unclassified_p_Firmicutes：未分類的厚壁菌門(mén)；unclassified_o_Lactobacillales：未分類的乳酸桿菌目；Leucobacter：亮桿菌屬；Staphylococcus：葡萄球菌屬；norank_f_Lachnospiraceae：未命名的毛螺菌科；Clostridium_sensu_stricto_1：致狹窄梭狀芽孢桿菌1；Glutamicibacter：谷氨酸桿菌屬；Eubacterium_brachy_group：短真桿菌屬；Oligella：寡源桿菌屬；Lactococcus：乳球菌屬；Dubosiella：杜氏乳桿菌屬；Lachnospiraceae_NK4A136_group：毛螺菌科NK4A136群；Ruminococcus：瘤胃球菌屬；unclassified_k_norank_d_Bacteria：未分類未命名的細(xì)菌；Psychrobacter：嗜冷桿菌屬；unclassified_f_Lachnospiraceae：未分類的毛螺菌科；Brachybacterium：短桿菌屬。

2.2.3 LPS攻毒大鼠回腸食糜微生物代謝產(chǎn)物SCFAs含量的變化

對(duì)LPS攻毒大鼠回腸食糜微生物代謝產(chǎn)物SCFAs含量進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如表5所示。與LPS組相比，Hes×RA組大鼠回腸食糜中乙酸、丙酸以及總短鏈脂肪酸的含量顯著提高(P<0.05)，RA組丙酸的含量顯著提高(P<0.05)；此外，Hes×RA組丁酸的含量有增加的趨勢(shì)(P=0.081)。

表5 橙皮苷、迷迭香酸及其組合對(duì)LPS攻毒大鼠回腸食糜代謝產(chǎn)物的影響

2.2.4 LPS攻毒大鼠回腸食糜微生物及其代謝產(chǎn)物的相關(guān)性分析

對(duì)LPS攻毒大鼠回腸食糜微生物與其代謝產(chǎn)物SCFAs進(jìn)行了皮爾森相關(guān)性分析(Pearson’s correlation analysis)，如圖4所示。相關(guān)性分析顯示，乙酸含量與Proteobacteria、Streptococcus相對(duì)豐度呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)；丙酸含量與Firmicute、Lactobacillus相對(duì)豐度呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，與Actionbacteria、Proteobacteria、Corynebacterium相對(duì)豐度呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)；丁酸含量與Lactobacillus相對(duì)豐度呈顯著正相關(guān)(P<0.05)。

紅色表示正相關(guān)，藍(lán)色表示負(fù)相關(guān)，*表示顯著相關(guān)。

2.3 LPS攻毒大鼠回腸炎癥反應(yīng)以及緊密連接蛋白的變化

2.3.1 LPS攻毒大鼠回腸黏膜中MPO活性以及細(xì)胞因子含量的變化

如表6所示，與LPS組相比，Hes×RA組大鼠回腸黏膜中MPO活性顯著降低(P<0.05)，而Hes組、RA組則沒(méi)有顯著變化(P>0.05)。在細(xì)胞因子方面，與LPS組相比，Hes×RA組回腸黏膜中IL-6含量顯著降低(P<0.05)，IL-10含量顯著升高(P<0.05)；Hes組回腸黏膜中IL-6含量顯著降低(P<0.05)；Hes組、RA組和Hes×RA組回腸黏膜中TNF-α含量無(wú)顯著變化(P>0.05)。

表6 橙皮苷、迷迭香酸及其組合對(duì)LPS攻毒大鼠回腸黏膜中MPO活性以及細(xì)胞因子含量的影響

2.3.2 LPS攻毒大鼠回腸黏膜中緊密連接蛋白相關(guān)基因mRNA相對(duì)表達(dá)量的變化

表7顯示的是LPS攻毒大鼠回腸黏膜中3種緊密連接蛋白基因mRNA相對(duì)表達(dá)量的變化。與LPS組相比，Hes×RA組回腸黏膜中Claudin-1和Occludin的mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著提高(P<0.05)，ZO-1的mRNA相對(duì)表達(dá)量有增加的趨勢(shì)(P=0.064)。Hes組和RA組回腸黏膜中ZO-1、Claudin-1和Occludin的mRNA相對(duì)表達(dá)量與LPS組相比沒(méi)有顯著變化(P>0.05)。

表7 橙皮苷、迷迭香酸及其組合對(duì)LPS攻毒大鼠回腸黏膜中緊密連接蛋白相關(guān)基因mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響

2.4 LPS攻毒大鼠回腸黏膜中TLR4/MyD88信號(hào)通路相關(guān)基因mRNA相對(duì)表達(dá)量的變化

如表8所示，與LPS組相比，Hes×RA組回腸黏膜中IRAK1和TRAF6的mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著降低(P<0.05)；Hes組和RA組回腸黏膜中IRAK1的mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著降低(P<0.05)。Hes組、RA組和Hes×RA組回腸黏膜中TLR4和MyD88的mRNA相對(duì)表達(dá)量與LPS組相比沒(méi)有顯著變化(P>0.05)。

表8 橙皮苷、迷迭香酸及其組合對(duì)LPS攻毒大鼠回腸黏膜中TLR4/MyD88信號(hào)通路中相關(guān)基因mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響

3 討 論

3.1 橙皮苷和迷迭香酸組合改善LPS攻毒大鼠回腸形態(tài)

腸道形態(tài)通常被用作評(píng)價(jià)腸道上皮完整性，主要通過(guò)絨毛高度、隱窩深度以及絨隱比的變化來(lái)直觀地反映試驗(yàn)處理對(duì)動(dòng)物健康的影響。絨毛高度增加表明腸道與營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)接觸面積擴(kuò)大，有助于提高大鼠的消化吸收效率[20]。腸道絨毛來(lái)源于隱窩，隱窩深度的降低說(shuō)明細(xì)胞更新減少，細(xì)胞增殖率降低，用于細(xì)胞增殖、更新所需要的能量減少，有利于動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育[21-22]。有研究表明，給小鼠口服橙皮苷可以顯著改善葡聚糖硫酸鈉鹽(DSS)誘導(dǎo)的結(jié)腸組織損傷，減輕炎性細(xì)胞浸潤(rùn)以及充血等現(xiàn)象[6]，而200 mg/kg的迷迭香酸顯著緩解了由三硝基苯磺酸(TNBS)誘導(dǎo)的大鼠結(jié)腸炎癥狀，并縮小了結(jié)腸組織潰瘍面積[10]。此外，Kamboh等[23]研究指出，LPS攻毒導(dǎo)致肉雞小腸絨毛高度降低，隱窩深度增加，而染料木黃酮和橙皮苷以劑量依賴的方式顯著提高了21日齡肉雞十二指腸和回腸絨毛高度和絨隱比，并改善了免疫功能。在本研究中，LPS攻毒導(dǎo)致大鼠回腸組織損傷，腸絨毛出現(xiàn)明顯斷裂，腸道上皮被破壞。無(wú)論是橙皮苷、迷迭香酸還是其組合，均顯著增加了LPS攻毒大鼠回腸的絨毛高度和絨隱比，并使隱窩深度有所降低。這表明橙皮苷、迷迭香酸及其組合可以改善LPS攻毒導(dǎo)致的大鼠腸道形態(tài)損傷，并通過(guò)提高絨毛高度、降低隱窩深度，來(lái)促進(jìn)大鼠的消化吸收和生長(zhǎng)發(fā)育。

3.2 橙皮苷和迷迭香酸組合調(diào)節(jié)LPS攻毒大鼠回腸食糜菌群結(jié)構(gòu)以及微生物代謝產(chǎn)物

腸道微生物和腸道上皮相互作用，共同維持腸道屏障的完整性[24]。腸道上皮受損可能會(huì)導(dǎo)致病原微生物侵襲，打破腸道微生態(tài)的動(dòng)態(tài)平衡。為進(jìn)一步探究橙皮苷和迷迭香酸組合對(duì)LPS攻毒大鼠腸道微生物的影響，我們對(duì)LPS攻毒大鼠回腸食糜微生物進(jìn)行了16S rRNA高通量測(cè)序分析。本研究中，與LPS組相比，Lactobacillus的相對(duì)豐度在Hes組、RA組以及Hes×RA組均顯著升高。有研究表明，含有迷迭香酸的油菜花粉提取物可以通過(guò)提高Lactobacillus等有益菌的相對(duì)豐度，降低擬桿菌屬(Bacteroides)等潛在致病菌的相對(duì)豐度來(lái)調(diào)整腸道菌群結(jié)構(gòu)，改善DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎[25]。相關(guān)細(xì)胞試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)蘋(píng)果提取物中的酚類物質(zhì)可以增加加氏乳桿菌R(LactobacillusgasseriR)和干酪乳桿菌FMP(LactobacilluscaseiFMP)在Caco-2和HT29-MTX腸上皮細(xì)胞的黏附[26]。這些研究結(jié)果與本文結(jié)果一致。在本研究中，橙皮苷和迷迭香酸組合可能通過(guò)增加Lactobacillus的黏附，進(jìn)而影響腸道中條件致病菌以及其他菌屬的生長(zhǎng)，促進(jìn)Lactobacillus的增殖。此外，與LPS組相比，回腸食糜微生物中Corynebacterium的相對(duì)豐度在Hes組、RA組以及Hes×RA組顯著降低，Streptococcus的相對(duì)豐度在Hes組和Hes×RA組顯著降低。研究發(fā)現(xiàn)，Streptococcus通過(guò)激活炎癥小體來(lái)刺激白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)的產(chǎn)生，導(dǎo)致化膿性炎癥[27]；Corynebacterium是革蘭氏陽(yáng)性菌，感染后會(huì)導(dǎo)致免疫力下降，部分Corynebacterium細(xì)菌還可能誘發(fā)人畜共患病[28]。因?yàn)槌绕ぼ?黃烷酮類物質(zhì))和迷迭香酸(酚酸類物質(zhì))均屬于多酚類物質(zhì)[29]，多酚類物質(zhì)中的羥苯基結(jié)構(gòu)使得其具有一定的抑菌作用[30]，所以回腸食糜微生物中潛在致病菌相對(duì)豐度降低可能與橙皮苷和迷迭香酸的抑菌作用有關(guān)[8,31]。綜上所述，橙皮苷和迷迭香酸組合可以通過(guò)促進(jìn)有益菌定植，減少潛在致病菌的定植來(lái)調(diào)控腸道微生物區(qū)系，有助于保持腸道的微生態(tài)平衡。

SCFAs是由腸道微生物分解代謝復(fù)雜碳水化合物所產(chǎn)生的，一方面可以為腸道上皮細(xì)胞提供能量來(lái)源，另一方面可以通過(guò)降低部分細(xì)胞因子含量，抑制巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的增殖，來(lái)減輕機(jī)體炎癥反應(yīng)[32]。在本研究中，與LPS組相比，橙皮苷和迷迭香酸組合顯著提高了回腸食糜中微生物代謝產(chǎn)物乙酸、丙酸以及總短鏈脂肪酸的含量，RA組丙酸含量顯著提高，Hes組SCFAs含量沒(méi)有顯著變化。前人研究表明，橙皮苷可以調(diào)節(jié)糖尿病模型小鼠腸道微生物群的結(jié)構(gòu)，增加糞便中SCFAs的含量，特別是顯著增加丁酸的含量[33]。這與本研究結(jié)果相似，本試驗(yàn)中Hes×RA組丁酸含量有增加的趨勢(shì)，但差異不顯著。乳酸菌可以促進(jìn)腸上皮細(xì)胞吸收SCFAs[34]，皮爾森相關(guān)性分析也發(fā)現(xiàn)丙酸、丁酸含量與Lactobacillus相對(duì)豐度呈顯著正相關(guān)，乙酸含量與Proteobacteria、Streptococcus相對(duì)豐度呈顯著負(fù)相關(guān)，丙酸含量與Actionbacteria、Proteobacteria、Corynebacterium相對(duì)豐度呈顯著負(fù)相關(guān)，表明SCFAs含量增加可能與回腸食糜微生物中Lactobacillus等有益菌的相對(duì)豐度增加和Proteobacteria、Actionbacteria、Streptococcus、Corynebacterium相對(duì)豐度降低有關(guān)。有研究表明乙酸和丙酸可以通過(guò)抑制結(jié)腸癌細(xì)胞系中TNF-α介導(dǎo)的NF-κB信號(hào)通路的激活來(lái)減輕炎癥反應(yīng)[35]。我們推測(cè)橙皮苷和迷迭香酸組合促進(jìn)微生物代謝產(chǎn)物SCFAs生成，可能有助于緩解LPS攻毒所誘導(dǎo)的腸道炎癥。

3.3 橙皮苷和迷迭香酸組合減輕LPS攻毒大鼠回腸炎癥反應(yīng)

MPO是中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)的標(biāo)志[12]。在本研究中，Hes×RA組大鼠回腸黏膜中MPO活性顯著降低，而單一植物提取物的Hes組和RA組沒(méi)有顯著變化，說(shuō)明橙皮苷和迷迭香酸組合能顯著減輕回腸組織炎性細(xì)胞浸潤(rùn)程度。與LPS組相比，Hes×RA組大鼠回腸黏膜中促炎因子IL-6的含量顯著降低，抑炎因子IL-10的含量顯著提高，Hes組IL-6的含量顯著降低，RA組TNF-α、IL-10、IL-6的含量無(wú)顯著變化，說(shuō)明橙皮苷和迷迭香酸組合可以通過(guò)降低促炎因子含量，提高抑炎因子含量來(lái)減輕LPS攻毒大鼠的腸道炎癥反應(yīng)，并且效果優(yōu)于單一植物提取物，這可能是因?yàn)槌绕ぼ盏纳锢枚容^低，迷迭香酸與其配合為橙皮苷脫糖基提供了酸水解的條件，提高了橙皮苷的利用效率。有研究表明，在LPS誘導(dǎo)炎癥的HepG2細(xì)胞中，橙皮苷以劑量依賴的方式降低IL-6的基因表達(dá)[36]，此結(jié)果在DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠中也得到證實(shí)，研究發(fā)現(xiàn)結(jié)腸炎小鼠每天灌胃40 mg/kg橙皮苷(純度>98%)可以顯著降低結(jié)腸中MPO的活性及TNF-α、IL-6的含量，顯著升高IL-10的含量[6]。此外，迷迭香酸可以顯著降低1,2-二甲基肼(DMH)誘導(dǎo)的結(jié)腸癌大鼠結(jié)腸黏膜中促炎因子TNF-α和IL-6的產(chǎn)生，具有一定的抗炎活性[11]，這與本研究結(jié)果一致。LPS作用于細(xì)胞表面受體，激活多種細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路，如TLR4/MyD88信號(hào)通路、NF-κB抑制物激酶(IKK)/NF-κB信號(hào)通路、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號(hào)通路等，促使炎癥因子表達(dá)，引發(fā)炎癥反應(yīng)[37]。在本研究中，與LPS組相比，橙皮苷、迷迭香酸及其組合顯著降低了LPS攻毒大鼠回腸黏膜中IRAK1的mRNA相對(duì)表達(dá)量，TLR4和MyD88的mRNA相對(duì)表達(dá)量也有所降低，并且Hes×RA組TRAF6的mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著降低。炎癥因子的減少與TLR4/MyD88信號(hào)通路被抑制有關(guān)[38-39]，這說(shuō)明橙皮苷和迷迭香酸組合可能是通過(guò)抑制TLR4/MyD88信號(hào)通路的激活來(lái)減少炎癥因子的產(chǎn)生，從而減輕LPS攻毒大鼠回腸炎癥反應(yīng)。

3.4 橙皮苷和迷迭香酸組合改善LPS攻毒大鼠回腸腸道屏障功能

LPS是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁的重要組成成分，能夠造成腸道屏障受損，破壞腸道緊密連接，導(dǎo)致腸道通透性增加，從而加重腸道炎癥[40]。ZO-1、Claudin-1和Occludin等緊密連接蛋白在腸道上皮緊密連接中發(fā)揮重要作用，有助于維持緊密連接結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定，調(diào)節(jié)腸道通透性，并且研究證實(shí)它們?cè)谘装Y性腸病中的表達(dá)量會(huì)顯著降低[41-42]。已有研究表明，橙皮苷可以提高Caco-2細(xì)胞中緊密連接蛋白ZO-1的mRNA相對(duì)表達(dá)量，降低腸道通透性[6]；迷迭香酸可以通過(guò)提高IPEC-J2細(xì)胞的物理屏障蛋白Claudin-1和Occludin的表達(dá)、降低炎癥因子IL-6和IL-8的表達(dá)來(lái)減輕霉菌毒素所誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激[43]，也可以通過(guò)提高黏蛋白2(Muc2)以及ZO-1的表達(dá)來(lái)改善結(jié)腸炎小鼠的機(jī)械屏障[10]。在本研究中，與LPS組相比，Hes×RA組LPS攻毒大鼠回腸黏膜中緊密連接蛋白Claudin-1和Occludin的mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著提高，且ZO-1的mRNA相對(duì)表達(dá)量也有增加的趨勢(shì)，單獨(dú)添加橙皮苷或迷迭香酸對(duì)ZO-1、Claudin-1和Occludin的mRNA相對(duì)表達(dá)量無(wú)顯著影響。這說(shuō)明給LPS攻毒大鼠灌胃橙皮苷和迷迭香酸組合可以提高回腸黏膜中緊密連接蛋白的mRNA相對(duì)表達(dá)量，有助于改善腸道屏障功能，從而緩解腸道炎癥。

4 結(jié) 論

橙皮苷和迷迭香酸組合有助于改善LPS攻毒引起的大鼠回腸形態(tài)損傷，調(diào)節(jié)菌群結(jié)構(gòu)，減輕炎癥反應(yīng)，改善腸道屏障功能，從而提高大鼠腸道健康狀況。