田沛知 田星哲 趙曉雅 陳佳欣 史晨迪 嚴(yán) 慧 張英杰 紀(jì)守坤 劉月琴

(河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，保定 071000)

新生羔羊與母體脫離后，在生理、營(yíng)養(yǎng)和心理上均面臨著劇烈的轉(zhuǎn)變，也會(huì)受到環(huán)境條件和微生物等多方面挑戰(zhàn)，這些因素所形成的應(yīng)激會(huì)對(duì)新生羔羊的健康和生長(zhǎng)性能產(chǎn)生多方面影響。初乳是新生幼畜獲得營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的唯一來源，也是羔羊被動(dòng)免疫建立的重要保障，未攝入初乳或初乳攝入不足導(dǎo)致的新生羔羊被動(dòng)免疫失敗是導(dǎo)致新生羔羊患病與死亡的主要因素之一[1]。初乳中免疫球蛋白G(IgG)是免疫球蛋白的主要組成部分，羔羊?qū)gG的吸收效率是新生羔羊被動(dòng)免疫建立的重要保證[2]，因此，提高IgG的吸收效率保障新生羔羊的被動(dòng)免疫是降低新生羔羊患病率和死亡率的重要措施。

新生羔羊小腸對(duì)IgG的吸收主要通過FcRn受體介導(dǎo)的胞吞途徑，新生羔羊剛出生時(shí)腸道內(nèi)無微生物與病原菌定植，在腸道偏酸性環(huán)境(pH=6.0～6.5)中，分布于腸上皮的FcRn與IgG結(jié)合形成FcRn-IgG復(fù)合體，F(xiàn)cRn-IgG復(fù)合體進(jìn)入腸上皮細(xì)胞，在細(xì)胞內(nèi)形成囊泡，進(jìn)而轉(zhuǎn)運(yùn)至腸上皮細(xì)胞基底端，在基底側(cè)的中性環(huán)境(pH=7.0～7.5)中，F(xiàn)cRn與IgG解離，IgG被釋放進(jìn)入血液循環(huán)，從而完成IgG由腸腔到血液的跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)[3-4]。腸道內(nèi)消化大分子的蛋白酶分泌量隨著產(chǎn)后時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增加，IgG被水解，從而直接影響IgG的吸收[5]。因此，在初乳中添加抗生素、甘露寡糖、甲酸、蛋白酶抑制劑或西沙必利，可能通過降低微生物或病原菌的數(shù)量、降低腸道pH、抑制蛋白酶活性與加快胃腸道蠕動(dòng)速度這4個(gè)方面來提高IgG的吸收效率。然而，初乳添加劑對(duì)新生羔羊IgG吸收效率的影響尚不明確，對(duì)新生羔羊血清指標(biāo)的影響還鮮有報(bào)道。

羔羊通常采用隨母哺乳進(jìn)行飼養(yǎng)，隨母哺乳狀態(tài)下新生羔羊IgG吸收效率的測(cè)定是難點(diǎn)。Yvon等[6]的研究表明，新生羔羊?qū)ε３跞楹脱虺跞橹械腎gG具有相同的吸收效率，表明羔羊腸道吸收牛源IgG和羊源IgG具有相同的吸收動(dòng)力學(xué)參數(shù)。在單虎等[7]的研究中，新生仔豬在飼喂牛初乳后約8 h發(fā)現(xiàn)血液中出現(xiàn)了較高水平的牛源IgG，表明新生幼畜在吸收不同物種來源的IgG后血液中仍保留其免疫原性[8-9]，目前人們基于IgG物種特異性進(jìn)行了大量乳制品和肉制品的摻假鑒定：Ruiz-Valdepeas等[10]報(bào)道了一種用于檢測(cè)牛、綿羊和山羊的混合乳中來自牛、綿羊和山羊的IgG的方法；Myers等[11]對(duì)豬肉、雞肉和牛肉中的IgG進(jìn)行特異性檢測(cè)，用于肉類的摻假鑒定。因此，可以利用牛、羊初乳中IgG吸收動(dòng)力一致性和免疫原特異性，使用牛初乳作為標(biāo)記物進(jìn)行隨母哺乳狀態(tài)下新生羔羊IgG吸收效率的測(cè)定。

本試驗(yàn)通過給自然哺乳狀態(tài)下的新生羔羊定量飼喂添加不同添加劑的牛初乳，將牛初乳作為標(biāo)記物，利用牛源和羊源IgG的抗原特異性通過單向免疫擴(kuò)散來測(cè)定新生羔羊血清中牛源IgG含量，從而準(zhǔn)確計(jì)算出IgG吸收效率，研究初乳添加劑對(duì)新生羔羊血清指標(biāo)和IgG吸收效率的影響，并通過分析血清指標(biāo)間的相關(guān)性對(duì)各影響因素的作用機(jī)理進(jìn)行初步探討，為制定合理的新生羔羊飼養(yǎng)管理措施提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)時(shí)間和地點(diǎn)

試驗(yàn)場(chǎng)地及試驗(yàn)動(dòng)物由河北省張家口市蘭海畜牧養(yǎng)殖有限公司提供，試驗(yàn)時(shí)間為2020年11—12月。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及飼養(yǎng)管理

本試驗(yàn)選取初生重[(3.52±0.31)kg]相近、母羊胎次為2～3胎且當(dāng)次產(chǎn)雙羔、健康狀況良好的新生湖羊公羔羊60只，隨機(jī)分為6組，每組10只，分別為對(duì)照組、抗生素組、甘露寡糖組、甲酸組、乙二胺四乙酸(EDTA)組和西沙必利組。羔羊出生后及時(shí)清除羔羊口腔及鼻腔內(nèi)的黏液，使其呼吸順暢，用碘伏在臍帶處消毒，使用干毛巾將羔羊身上粘液擦拭干凈后打上耳號(hào)，做好生產(chǎn)記錄(包括產(chǎn)羔時(shí)間、母羊胎次、產(chǎn)羔數(shù)、羔羊初生重等)，在產(chǎn)后1 h內(nèi)引導(dǎo)羔羊接近乳房并輔助其采食母乳，羔羊均隨母哺乳。

牛初乳粉購(gòu)自南京德居生物科技有限公司，其營(yíng)養(yǎng)成分含量見表1。牛初乳粉與溫水(40 ℃)按照1∶7的比例進(jìn)行配制，攪拌均勻至充分溶解。對(duì)照組、抗生素組、甘露寡糖組、甲酸組、EDTA組和西沙必利組分別于牛初乳溶液中添加5 mL生理鹽水、抗生素溶液[12](8 g氨芐青霉素、8 g硫酸新霉素、4 g萬古霉素和4 g甲硝唑混合后溶于1 L生理鹽水中)、甘露寡糖溶液[13](0.5 g/kg BW)、甲酸溶液[14](將85%食品級(jí)甲酸與生理鹽水按1∶9的比例混合均勻制成)、EDTA溶液[15](0.5 g/kg BW)和西沙必利溶液[16](0.5 mg/kg BW)，配制好的牛初乳溶液中IgG含量為5.13 mg/mL，于羔羊出生后1 h使用100 mL注射器通過口腔插管飼喂羔羊[17]，飼喂量為100 mL。

表1 牛初乳粉營(yíng)養(yǎng)成分含量

1.3 樣品采集

羔羊于出生后24 h時(shí)頸靜脈采血，使用5 mL促凝采血管收集血液，在室溫下靜置2 h，待血清析出后，在室溫下用離心機(jī)以3 500×g離心15 min收集血清，血清置于-20 ℃保存。

1.4 測(cè)定指標(biāo)與方法

血清中總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、球蛋白(GLB)和葡萄糖(GLU)含量采用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定；血清中超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、二胺氧化酶(DAO)活性，總抗氧化能力(T-AOC)以及丙二醛(MDA)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、γ-干擾素(IFN-γ)、內(nèi)毒素(LPS)、免疫球蛋白M(IgM)和免疫球蛋白A(IgA)含量采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法測(cè)定；血清中牛源和羊源IgG含量采用單向免疫擴(kuò)散法[18]測(cè)定。

參考McGovern等[19]的方法進(jìn)行IgG吸收效率的計(jì)算：

IgG吸收效率(%)=[血清牛源IgG含量(g/L)×

羔羊體重(kg)×7.5%]/[牛初乳IgG含量(g/L)×

牛初乳哺乳量(L)]。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

數(shù)據(jù)采用Excel 2007進(jìn)行初步整理，利用SPSS 22.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，通過Duncan氏法進(jìn)行多重比較。試驗(yàn)結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，P<0.05表示差異顯著；利用R軟件(3.6.3)的GGally程序包進(jìn)行相關(guān)性分析，P<0.05表示相關(guān)性顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同初乳添加劑對(duì)新生羔羊血清TP、ALB、GLB和GLU含量的影響

由表2可知，抗生素組和甘露寡糖組羔羊血清GLU含量均顯著高于對(duì)照組和甲酸組(P<0.05)；各組間羔羊血清TP、ALB和GLB含量差異不顯著(P>0.05)。

表2 不同初乳添加劑對(duì)新生羔羊血清TP、ALB、GLB和GLU含量的影響

2.2 不同初乳添加劑對(duì)新生羔羊血清抗氧化指標(biāo)的影響

由表3可知，抗生素組、甘露寡糖組、甲酸組、EDTA組和西沙必利組羔羊血清MDA含量均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，而SOD與GSH-Px活性、T-AOC均顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。

表3 不同初乳添加劑對(duì)新生羔羊血清抗氧化指標(biāo)的影響

2.3 不同初乳添加劑對(duì)新生羔羊血清炎癥細(xì)胞因子含量的影響

由表4可知，抗生素組、甘露寡糖組、甲酸組、EDTA組和西沙必利組羔羊血清IFN-γ、TNF-α、IL-1β、IL-6含量均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。

表4 不同初乳添加劑對(duì)新生羔羊血清炎癥細(xì)胞因子含量的影響

2.4 不同初乳添加劑對(duì)新生羔羊血清LPS含量和DAO活性的影響

由表5可知，抗生素組、甘露寡糖組、甲酸組、EDTA組和西沙必利組羔羊血清LPS含量和DAO活性均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。

表5 不同初乳添加劑對(duì)新生羔羊血清LPS含量和DAO活性的影響

2.5 不同初乳添加劑對(duì)新生羔羊血清免疫指標(biāo)和IgG吸收效率的影響

由表6可知，甲酸組、甘露寡糖組、西沙必利組羔羊血清牛源IgG含量和IgG吸收效率均顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，抗生素組、EDTA組羔羊血清牛源IgG含量和IgG吸收效率與對(duì)照組差異不顯著(P>0.05)；血清羊源IgG、IgM和IgA含量在各組間差異不顯著(P>0.05)。

表6 不同初乳添加劑對(duì)新生羔羊血清免疫指標(biāo)和IgG吸收效率的影響

2.6 羔羊血清指標(biāo)和IgG吸收效率的相關(guān)性

由圖1可知，新生羔羊的IgG吸收效率與血清SOD活性、T-AOC和IgA含量呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，而與血清MDA、IL-1β和IL-6含量呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)；腸道通透性指標(biāo)(LPS含量和DAO活性)與血清抗氧化指標(biāo)(SOD、GSH-Px活性及T-AOC)呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)，與血清MDA和炎癥因子(IL-1β、TNF-α、IFN-γ、IL-6)含量呈顯著正相關(guān)(P<0.05)；血清炎癥因子(IL-1β、TNF-α、IFN-γ、IL-6)含量與血清抗氧化指標(biāo)(SOD、GSH-Px活性及T-AOC)呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，與血清MDA含量呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)。

BW：初生重 birth weight；TP：總蛋白 total protein；ALB：白蛋白 albumin；GLB：球蛋白 globulin；GLU：葡萄糖 glucose；SOD：超氧化物歧化酶 superoxide dismutase；T-AOC：總抗氧化能力 total antioxidant capacity；MDA：丙二醛 malondialdehyde；GSH-Px：谷胱甘肽過氧化物酶 glutathione peroxidase；LPS：內(nèi)毒素 lipopolysaccharide；DAO：二胺氧化酶 diamine oxidase；IL-1β：白細(xì)胞介素-1β interleukin-1β；TNF-α：腫瘤壞死因子-α tumor necrosis factor-α；IFN-γ：γ-干擾素 interferon-γ；IL-6：白細(xì)胞介素-6 interleukin-6；IgG：免疫球蛋白G immunoglobulin G；IgM：免疫球蛋白M immunoglobulin M；IgA：免疫球蛋白A immunoglobulin A；AEA：IgG吸收效率 IgG absorption efficiency；Corr：相關(guān)系數(shù) correlation coefficient。

3 討 論

3.1 初乳中添加抗生素對(duì)新生羔羊血清指標(biāo)和IgG吸收效率的影響

羔羊出生前腸道內(nèi)無微生物，羔羊在出生后有大量微生物在腸道黏膜表面迅速定植，而初乳中的微生物是腸道微生物的主要來源[20]。Gelsinger等[20]通過對(duì)犢牛進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，初乳中微生物的含量可顯著影響IgG吸收效率，飼喂低微生物含量初乳的犢牛IgG吸收效率顯著高于飼喂高微生物含量初乳的犢牛。這說明可以通過在初乳中添加抗生素來減少微生物含量，從而提高IgG吸收效率。在本研究中，抗生素組新生羔羊的IgG吸收效率雖然高于對(duì)照組，但是差異不顯著，并且血清中DAO活性以及LPS、IFN-γ、TNF-α、IL-1β和IL-6含量均顯著高于對(duì)照組。血清LPS含量和DAO活性可以反映新生羔羊的腸道通透性和腸道黏膜屏障的損傷程度，而血清IFN-γ、TNF-α、IL-1β和IL-6含量則可反映新生羔羊的炎癥反應(yīng)程度[21]，由此推測(cè)可能是由于抗生素在殺滅致病菌的同時(shí)導(dǎo)致革蘭氏陰性菌裂解死亡釋放出LPS，LPS的大量產(chǎn)生使腸道屏障受損并進(jìn)入血液，引起炎癥反應(yīng)[21]，提示通過在初乳中添加抗生素來提高IgG吸收效率的作用效果有限。

3.2 初乳中添加甘露寡糖對(duì)新生羔羊血清指標(biāo)和IgG吸收效率的影響

甘露寡糖是一種腸道活性低聚糖，已被證實(shí)能夠在吸附病原體的同時(shí)通過競(jìng)爭(zhēng)受體位點(diǎn)來阻止病原體的附著，從而降低其在腸道的定植能力[22]。在單胃動(dòng)物的研究中，平偉強(qiáng)等[23]和武威等[24]的研究均表明在飼糧中添加甘露寡糖可顯著提高機(jī)體免疫力和抗氧化能力，改善腸道健康；金亞東等[25]在對(duì)成年反芻動(dòng)物的研究中得到了相同的結(jié)論。但前人對(duì)于新生反芻動(dòng)物的研究結(jié)果具有較大差異：Lazarevic等[26]研究表明，在牛初乳中添加甘露寡糖可以提高犢牛對(duì)初乳中免疫球蛋白的吸收，提高犢牛血清中IgG含量，而Villettaz等[27]和Brady等[28]的研究則均表明在代乳品中添加甘露寡糖不能提高IgG的吸收效率。本研究結(jié)果顯示甘露寡糖組新生羔羊IgG吸收效率顯著低于對(duì)照組，同時(shí)血清中LPS、MDA和炎癥細(xì)胞因子含量均顯著提高，而血清中SOD、GSH-Px活性及T-AOC顯著降低。血清MDA含量可反映由氧自由基引起的機(jī)體氧化損傷程度，而SOD、GSH-Px等抗氧化酶能夠清除機(jī)體產(chǎn)生的活性氧自由基，是衡量新生羔羊抗氧化能力的重要指標(biāo)[21]。上述結(jié)果說明在初乳中添加甘露寡糖對(duì)新生羔羊的免疫力和抗氧化能力均產(chǎn)生了不利的影響，其機(jī)制尚不明確。

3.3 初乳中添加甲酸對(duì)新生羔羊血清指標(biāo)和IgG吸收效率的影響

甲酸作為一種酸化劑被廣泛的應(yīng)用于仔豬與犢牛的飼養(yǎng)中，在調(diào)節(jié)乳pH的同時(shí)還能夠有效殺滅部分病原菌[29-30]。殷術(shù)鑫等[30]研究中以甲酸作為酸化劑制備的酸化乳并飼喂?fàn)倥?，發(fā)現(xiàn)飼喂酸化乳犢牛在第60天時(shí)血清中IgG和IgM含量均顯著提高，而血清中TNF-α、IL-1β和IL-6含量均顯著降低，說明初乳中添加甲酸能夠提高犢牛的免疫力，降低炎癥反應(yīng)。本試驗(yàn)中甲酸組羔羊血清中SOD、GSH-Px活性及T-AOC顯著低于對(duì)照組，血清炎癥細(xì)胞因子含量和腸道通透性顯著高于對(duì)照組，血清免疫指標(biāo)與對(duì)照組無顯著差異，而血清中牛源IgG含量為0 mg/mL，表明在牛初乳中添加甲酸后新生羔羊?qū)o法吸收初乳中的牛源IgG，原因可能是本研究中的酸化乳pH過低，引起IgG分子空間構(gòu)象發(fā)生改變，造成IgG變性失活[31]，從而導(dǎo)致新生羔羊無法吸收酸化乳中的IgG。

3.4 初乳中添加EDTA對(duì)新生羔羊血清指標(biāo)和IgG吸收效率的影響

隨著新生羔羊胃腸道的發(fā)育，胃腸道內(nèi)的蛋白酶開始大量分泌，導(dǎo)致IgG被水解，IgG的吸收效率降低[32]。Koleckar等[15]研究表明，EDTA在蛋白酶水解肌紅蛋白的過程中表現(xiàn)出明顯的抑制效果，但目前還沒有將EDTA作為蛋白酶抑制劑來提高IgG吸收效率的報(bào)道。本研究結(jié)果顯示，EDTA組羔羊血清中SOD、GSH-Px活性及T-AOC顯著低于對(duì)照組，血清炎癥細(xì)胞因子含量與腸道通透性均顯著高于對(duì)照組，血清免疫指標(biāo)與對(duì)照組無顯著差異，這可能是由于EDTA具有金屬螯合作用，主要抑制金屬蛋白水解酶，對(duì)胰蛋白酶和糜蛋白酶的抑制能力較弱[15]，并且EDTA具有較強(qiáng)的穩(wěn)定性，在體內(nèi)難以被降解，游離態(tài)的EDTA及其金屬螯合物能夠破壞革蘭氏陰性菌的外膜釋放出LPS，導(dǎo)致腸道屏障受損，引發(fā)炎癥反應(yīng)[33]。

3.5 初乳中添加西沙必利對(duì)新生羔羊血清指標(biāo)和IgG吸收效率的影響

Mokhber-Dezfooli等[34]在皺胃排空速率對(duì)犢牛初乳IgG吸收效率的研究中發(fā)現(xiàn)，皺胃的排空速率可以影響初乳中IgG運(yùn)送到小腸吸收部位的速度。由于皺胃排空速率的增加，使初乳IgG到達(dá)小腸吸收部位的時(shí)間縮短，從而使腸腔內(nèi)IgG含量升高，最終提高IgG的吸收效率。Dowling[16]報(bào)道了西沙必利能增加貓、犬和馬的胃腸道運(yùn)動(dòng)速率，加快腸胃蠕動(dòng)，但目前還沒有關(guān)于通過促進(jìn)新生羔羊腸胃蠕動(dòng)來提升IgG吸收效率的報(bào)道。本研究結(jié)果顯示，西沙必利組羔羊血清中炎癥細(xì)胞因子含量和腸道通透性均顯著高于對(duì)照組，抗氧化能力和牛源IgG含量均顯著低于對(duì)照組，原因可能是西沙必利的藥理作用時(shí)間開始于服用后30 min[16]，而本試驗(yàn)中將西沙必利與初乳混合均勻后進(jìn)行飼喂，導(dǎo)致新生羔羊進(jìn)食初乳時(shí)藥物還未發(fā)揮作用，并且西沙必利可以導(dǎo)致一定程度肝損傷[35]，引起炎癥反應(yīng)。

3.6 羔羊血清指標(biāo)和IgG吸收效率的相關(guān)性

前人研究表明，血清抗氧化能力與炎癥細(xì)胞因子含量呈顯著負(fù)相關(guān)[36]；炎癥細(xì)胞因子含量與腸道通透性呈顯著正相關(guān)[20]；血清免疫指標(biāo)與抗氧化能力呈顯著正相關(guān)[36]，與本研究結(jié)果一致，本研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)新生羔羊IgG吸收效率與血清SOD活性、T-AOC和IgA含量呈顯著正相關(guān)，與血清MDA、IL-1β和IL-6含量呈顯著負(fù)相關(guān)，說明提高新生羔羊血清抗氧化能力、降低細(xì)胞炎癥因子含量可能有利于提高IgG吸收效率。

4 結(jié) 論

初乳中添加抗生素、甘露寡糖、甲酸、EDTA和西沙必利均無法提高新生羔羊的IgG吸收效率。新生羔羊IgG吸收效率與血清抗氧化能力呈顯著正相關(guān)，與血清炎癥細(xì)胞因子含量呈顯著負(fù)相關(guān)，提示提高新生羔羊血清抗氧化能力、降低炎癥細(xì)胞因子含量可能是提高其IgG吸收效率的有效措施。