張春敏 黨潤(rùn) 楊文敏 陳卓瑤 戎霞 馮立強(qiáng) 劉文寬 楊鎰?dòng)?陳飛燕*

兒童重癥腺病毒肺炎是兒童重癥監(jiān)護(hù)室常見(jiàn)的疾病，部分患兒進(jìn)展加重可導(dǎo)致急性呼吸窘迫綜合征（ARDS），甚至死亡，這一類疾病可嚴(yán)重威脅兒童生命及健康［1］。然而，目前針對(duì)重癥腺病毒肺炎尚無(wú)有效特異性治療措施，僅對(duì)癥支持治療為主。特異性高效價(jià)腺病毒中和抗體血漿（Specific High level Adenovirus Neutralizing Antibodies Plasma，SHL-ANAP）是指從健康獻(xiàn)血志愿者的血漿中篩查出腺病毒中和抗體滴度大于1∶1 000 的特異性血漿［2，3］。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，早期應(yīng)用篩選出來(lái)的高效價(jià)腺病毒中和抗體血漿治療兒童重癥腺病毒肺炎取得良好的效果，可減少發(fā)熱時(shí)間及降低死亡率［4］。然而，腺病毒中和抗體相關(guān)生物制劑目前尚處在研發(fā)階段，因此，建立特異性高效價(jià)腺病毒中和抗體血漿庫(kù)，將其儲(chǔ)備用于治療重癥腺病毒感染具有重大的臨床意義。

經(jīng)過(guò)篩查的SHL-ANAP，需要按照現(xiàn)行的血液制品保存方式進(jìn)行保存儲(chǔ)備備用，經(jīng)過(guò)-20℃保存后，其抗體滴度是否發(fā)生變化尚不明確。因此，我們檢測(cè)了篩查出的SHL-ANAP 保存1 年前后的抗體滴度，以明確經(jīng)篩選出的SHL-ANAP 保存效果，了解其抗體滴度變化，進(jìn)一步指導(dǎo)優(yōu)化SHL-ANAP的臨床使用。

1 臨床材料

1.1 一般資料由廣州血液中心輸血研究所從健康獻(xiàn)血志愿者的血漿中篩查出的SHL-ANAP（3型或7 型，中和抗體滴度＞1∶1 000），以及它們?cè)诔Ｒ?guī)-20℃冷庫(kù)保存1 年后的樣本。該研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（穗婦兒 科倫 通字（2020）第56100號(hào)），患者均簽署知情同意書。

1.2 研究方法由廣州血液中心留存健康獻(xiàn)血志愿者的血樣運(yùn)用分泌型堿性磷酸酶（SEAP）報(bào)告腺病毒微量中和檢測(cè)法檢測(cè)其樣本抗體滴度。鎖定SHL-ANAP 后發(fā)放至廣州市婦女兒童醫(yī)療中心輸血科保存和臨床應(yīng)用。1 年后，將剩余12 份樣本再次應(yīng)用該方法進(jìn)行抗體滴度檢測(cè)。

1.3 SHL-ANAP 檢測(cè)方法SEAP 報(bào)告腺病毒微量中和檢測(cè)法［3］是用無(wú)酚紅的DMEN 培養(yǎng)基對(duì)12份血漿進(jìn)行梯度稀釋，共設(shè)置了5 個(gè)稀釋梯度，分別為1∶18，1∶72，1∶288，1∶1152 和1∶4608，加入等體積的SEAP 報(bào)告病毒（4.0×107vp/ml），用SEAP 試劑盒（Phospha-Light System，AB，T1016）進(jìn)行檢測(cè)，使用熒光照度計(jì)，檢測(cè)吸光值，根據(jù)吸光值變化計(jì)算待測(cè)血漿的滴度，以抑制了50%的吸光值的血清稀釋度作為待測(cè)血漿的滴度，并以血清的滴度≥1∶72 視為陽(yáng)性血清，＜1∶72 視為陰性血清。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法使用SPSS 25.0 軟件分別對(duì)ADV3型、ADV7 型冰凍保存前后的血漿腺病毒中和抗體滴度進(jìn)行配對(duì)Wilcoxon 秩和檢驗(yàn)，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

共留存12 份特異性高效價(jià)腺病毒中和抗體血漿進(jìn)行抗體滴度檢測(cè)，其中8 份ADV3 型高效價(jià)腺病毒中和抗體血漿，4 份ADV7 型高效價(jià)腺病毒中和抗體血漿。結(jié)果顯示，凍存前后12 份腺病毒中和抗體血漿抗體滴度具有不同程度地下降，但均大于1∶1000（見(jiàn)表1）。Wilcoxon 配對(duì)秩和檢驗(yàn)結(jié)果顯示，ADV3 型、ADV7 型高效價(jià)血漿冰凍保存前后血漿抗體滴度均無(wú)顯著差異（P＞0.05，見(jiàn)表2）。

表1 SHL-ANAP 凍存前后抗體滴度的變化

表2 ADV3、ADV7 凍存前后抗體滴度變化比較（配對(duì)Wilcoxon 秩和檢驗(yàn)）

3 討 論

近年來(lái)許多研究顯示，早期應(yīng)用康復(fù)者血漿治療重癥病毒感染患者取得良好的療效，例如埃博拉病毒、流感病毒、SARS 冠狀病毒等感染者，早期通過(guò)輸注相應(yīng)康復(fù)者血漿后病情明顯好轉(zhuǎn)、病毒載量顯著降低［5，6］。然而也有一部分研究表明重癥病毒感染者使用相應(yīng)康復(fù)者血漿無(wú)法顯著降低病死率［7］，這可能與相應(yīng)康復(fù)者血漿中不含有中和抗體或者中和抗體滴度較低有關(guān)。我們前期研究采用經(jīng)篩選的SHL-ANAP 治療重癥腺病毒肺炎患兒亦取得良好的療效［4］，因我們所應(yīng)用的SHLANAP 篩查出的抗體滴度均大于1∶1000，且可選擇性的輸入與患兒腺病毒分型相同的高效價(jià)血漿，從而取得較好的治療效果。此外，我們應(yīng)用的高效價(jià)血漿是由廣州血液中心從普通血漿篩選而來(lái)，來(lái)源可靠且價(jià)格便宜，不會(huì)增加患兒家庭經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。因而，高效篩查SHL-ANAP 并可妥當(dāng)保存其抗體滴度，對(duì)于應(yīng)用于救治重癥腺病毒感染病人有重要意義，并為后續(xù)SHL-ANAP 血漿庫(kù)的建立提供一定的依據(jù)。

目前用于檢測(cè)血清中腺病毒中和抗體的主要方法分為兩類：一種采用細(xì)胞病變法，孵育腺病毒與抗體后，檢測(cè)細(xì)胞的活性或者觀察感染細(xì)胞的病變效應(yīng)；另一種則采用報(bào)告基因法，血清中的中和抗體可以有效地抑制病毒感染從而減少報(bào)告基因的數(shù)量及表達(dá)程度，而后可通過(guò)檢測(cè)被抑制程度來(lái)確定中和抗體水平，本研究所使用的SEAP 報(bào)告腺病毒微量中和檢測(cè)法屬報(bào)告基因法。傳統(tǒng)的細(xì)胞病變法由于檢測(cè)周期較長(zhǎng)（4-8 d），觀察相對(duì)主觀，且靈敏度較低，對(duì)于快速準(zhǔn)確檢測(cè)并不適用［8］；而SEAP 報(bào)告腺病毒微量中和檢測(cè)法除了可大大減少檢測(cè)時(shí)間（30 h）外，還具備更為簡(jiǎn)便快捷的操作方法，并且重復(fù)性好。 SEAP 報(bào)告腺病毒微量中和檢測(cè)法可實(shí)現(xiàn)快速和大樣本的檢測(cè)，非常適合用于SHL-ANAP 的篩查。

常規(guī)操作中，新鮮冰凍血漿可置于溫度≤-18℃冷庫(kù)冰凍保存1 年，而普通血漿則可保存4 年［9］。目前有研究顯示，新型冠狀病毒感染患者恢復(fù)期特異性血漿的抗體滴度在冰凍狀態(tài)下至少可以維持4 個(gè)月不衰減［10］。然而，目前并沒(méi)有相關(guān)研究顯示SHL-ANAP 冰凍保存后抗體滴度的變化情況。本研究經(jīng)篩查后的SHL-ANAP 立即置于-20℃冷庫(kù)冰凍保存，1 年后ADV3 型、ADV7 型抗體滴度雖然有下降趨勢(shì)，但與凍存1 年前相比，差異并無(wú)顯著性意義。而且，凍存1 年后的SHL-ANAP 抗體滴度仍均＞1∶1000，說(shuō)明目前SHL-ANAP 保存方法能達(dá)到保存效果，一年的-20℃冰凍存儲(chǔ)不會(huì)影響高效價(jià)血漿的效價(jià)滴度，意味著大批量篩查出高效價(jià)血漿后可以-20℃冰凍保存，為腺病毒流行到來(lái)時(shí)做好戰(zhàn)略儲(chǔ)備。另外，這一結(jié)果也為高效價(jià)血漿保存期的界定提供一定的數(shù)據(jù)支持。

本研究觀察發(fā)現(xiàn)SHL-ANAP 在-20℃冰凍儲(chǔ)存1 年后仍有較高的抗體滴度，可以繼續(xù)用于重癥腺病毒患兒的救治中。另外，SEAP 報(bào)告腺病毒微量中和檢測(cè)法能夠用于大規(guī)模篩查和評(píng)估高效價(jià)血漿的中和抗體滴度。但是由于本研究樣本量較小且檢測(cè)方法稀釋梯度不足導(dǎo)致部分?jǐn)?shù)據(jù)未得到最高值，后期尚需擴(kuò)大樣本量及增加稀釋梯度進(jìn)一步研究。