王佳榮，董 瑞，張夢(mèng)宇，高 璞，張培培，李在峰，劉大群

(河北省農(nóng)作物病蟲(chóng)害生物防治工程技術(shù)研究中心，河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院，河北 保定 071001)

小麥葉銹病由葉銹菌侵染引起，該病害可通過(guò)氣流進(jìn)行遠(yuǎn)距離傳播，在我國(guó)發(fā)生范圍廣，傳播速度快，可對(duì)我國(guó)大范圍小麥產(chǎn)區(qū)進(jìn)行侵染。小麥葉銹病主要危害小麥葉片，影響葉片光合作用，通常會(huì)減產(chǎn)5%～15%，大流行年份產(chǎn)量損失可達(dá)40%[1-2]。我國(guó)是世界上小麥葉銹病的最大流行區(qū)之一，主要發(fā)生在黃河和淮海流域[3]，因此，選育和利用抗病品種至關(guān)重要。

根據(jù)小麥寄主對(duì)葉銹菌抗性不同可分為垂直抗病性和水平抗病性。垂直抗病性由主效基因控制，表現(xiàn)為質(zhì)量性狀。垂抗品種能在葉銹菌侵入葉片后產(chǎn)生過(guò)敏性壞死反應(yīng)(Hypersensitive reaction，HR)，阻止病原菌侵染并表現(xiàn)抗病性。垂直抗病性具有生理小種?；?，當(dāng)葉銹菌生理小種發(fā)生毒性變異時(shí)，品種抗病性就會(huì)喪失[4]。水平抗病性又稱為慢銹性(Slow rusting resistance)，由多個(gè)微效基因控制，為數(shù)量性狀抗性，沒(méi)有明顯的生理小種專化性。具有慢銹抗性的小麥品種與葉銹菌表現(xiàn)親和的非過(guò)敏性反應(yīng)，在田間表現(xiàn)潛伏期長(zhǎng)、病斑小、發(fā)病率低和孢子量少等特點(diǎn)[1]，抗性較持久。

目前，國(guó)內(nèi)外定位的小麥抗葉銹病基因有100多個(gè)，其中正式命名了80個(gè)[5]，這些基因大多為小種?；共』?，非小種?；穆P基因只有Lr34[6]、Lr46[7]、Lr67[8]和Lr68[9]。由于我國(guó)葉銹菌小種變異頻繁，目前僅有Lr9、Lr19、Lr24、Lr38、Lr47、Lr51和Lr53等少數(shù)主效抗葉銹病基因仍具有有效抗性[10]。

基因推導(dǎo)和分子標(biāo)記技術(shù)具有耗時(shí)短、效率高的特點(diǎn)，目前在小麥葉銹基因鑒定中應(yīng)用廣泛。王思曼等[11]在69份國(guó)外小麥材料中，推導(dǎo)出Lr1、Lr10、Lr26等6個(gè)抗葉銹病基因。趙麗娜等[12]在23份中國(guó)小麥微核心種質(zhì)中推導(dǎo)出Lr1、Lr2c、Lr16等9個(gè)抗葉銹病基因，焦悅等[13]在50份國(guó)外小麥材料中推導(dǎo)出Lr1、Lr26、Lr34等6個(gè)抗葉銹病基因。Gao等[14]、Zhang等[15]和楊文香[16]分別對(duì)不同地區(qū)的小麥品種進(jìn)行基因推導(dǎo)，推導(dǎo)出Lr1、Lr2a、Lr9和Lr24等多個(gè)抗病基因。

利用已知基因進(jìn)行合理的基因布局與基因聚合可延長(zhǎng)抗病基因使用年限，對(duì)國(guó)內(nèi)外小麥品種進(jìn)行抗性鑒定可以篩選抗病品種，為我國(guó)的小麥抗葉銹病育種提供優(yōu)良抗源。本試驗(yàn)利用我國(guó)小麥葉銹菌小種接種40份CIMMYT小麥品系進(jìn)行抗葉銹基因鑒定，同時(shí)利用已知基因的分子標(biāo)記檢測(cè)供試品系和抗性鑒定結(jié)果互相驗(yàn)證，鑒定結(jié)果將為這些品系在抗性育種的利用奠定材料和理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料包括40個(gè)國(guó)際玉米小麥改良中心(Centro Internacional de Mejoramientode Maizy Trigo，CIMMYT)小麥品系(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院張學(xué)勇研究員饋贈(zèng)，系譜見(jiàn)表1)、36個(gè)含有已知抗病基因的載體品種、感病對(duì)照品種鄭州5389和成株抗性對(duì)照品種SAAR；基因推導(dǎo)所用的17個(gè)單孢純化后的小麥葉銹菌生理小種(FGJQ、FHJQ①、FHJT、FHJR、TGPS、FHJQ②、THDB、PHTS、FHJQ③、FHSQ、FHGS①、FHDS、FHGS②、FHDQ、FHJS、FGJQ、FGDQ)和成株期使用的混合高毒性生理小種(THTT、THTQ、THTS、PHPS)均由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)小麥銹病實(shí)驗(yàn)室保存，不同毒性的葉銹生理小種命名參照Long等[17]的四字母命名法。

1.2 苗期抗葉銹性鑒定

將所用36個(gè)載體品種、40個(gè)小麥供試品系和感病對(duì)照鄭州5389在溫室內(nèi)種植17套穴盤。待小麥長(zhǎng)至一心一葉時(shí)，使用掃抹法將17種不同毒力的葉銹菌生理小種分別接種到17套供試材料，將接種后的供試材料移入100% 濕度的接種桶，并覆上塑膠膜黑暗保濕16 h，后轉(zhuǎn)入適合葉銹菌擴(kuò)繁的23 ℃左右溫室內(nèi)培養(yǎng)大約14 d，待感病對(duì)照品種5389完全發(fā)病，按照Roelfs等[18]的6級(jí)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)17套供試材料進(jìn)行侵染型鑒定后，根據(jù)Dubin等[19]提出的基因推導(dǎo)原則對(duì)40份小麥供試品系進(jìn)行基因推導(dǎo)。

1.3 成株期抗葉銹性鑒定

于2018—2019年和2019—2020年，將40個(gè)CIMMYT小麥品系、感病材料5389和成株抗性對(duì)照品種SAAR分別種植于河南周口黃泛區(qū)農(nóng)場(chǎng)試驗(yàn)田與河北保定河北農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗(yàn)田。供試品系行長(zhǎng)0.8 m，行距0.25 m，每隔9行種植一行感病材料5389，每行約40粒，并在供試品系兩側(cè)垂直種植一列感病材料鄭州5389作為誘發(fā)行，在小麥試驗(yàn)田四周播種2列黑麥作為保護(hù)行，防止小麥葉銹菌孢子擴(kuò)散到其他區(qū)域。將4種高毒性生理小種(THTT、THTQ、THTS、PHPS)等量混合，制成0.05% 吐溫的孢子懸浮液，在小麥拔節(jié)期噴施誘發(fā)行后用塑料薄膜覆蓋保持密閉環(huán)境，黑暗高濕條件下過(guò)夜。當(dāng)感病材料5389病害嚴(yán)重度達(dá)到50% 時(shí)，按照Li等[10]的方法進(jìn)行病害嚴(yán)重度鑒定，之后每間隔7 d鑒定一次，直至田間小麥材料完全發(fā)病，此時(shí)嚴(yán)重度達(dá)到最高值，即為最終嚴(yán)重度(Final disease severity，F(xiàn)DS)。

1.4 抗葉銹病基因分子鑒定

本試驗(yàn)選用Sharp等[20]的CTAB法提取40份國(guó)外小麥品系及鄭州5389小麥葉片DNA，測(cè)定DNA濃度后將其稀釋到40 ng/μL。選用與已知10個(gè)抗葉銹病基因Lr1[21]、Lr9[22]、Lr10[23]、Lr19[24]、Lr20[25]、Lr21[26]、Lr26[27]、Lr34[28]、Lr37[29]、Lr46[30]緊密連鎖的分子標(biāo)記進(jìn)行檢測(cè)。PCR配置體系為10 μL：模板1 μL，高保真Mix 5 μL，ddH2O 3 μL，引物1 μL；PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)和分析。利用Lr46特異性標(biāo)記csLV46G22檢測(cè)時(shí)需將PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切，其體系為10 μL：PCR產(chǎn)物7 μL，NEBuffer 10× 1 μL，BspⅠ 0.3 μL，ddH2O 1.7 μL，酶切后用12%聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 苗期鑒定結(jié)果分析及分子鑒定結(jié)果

36個(gè)已知抗葉銹病基因的載體品種和40份供試小麥品系對(duì)17個(gè)小麥葉銹菌種的苗期侵染型、基因鑒定結(jié)果見(jiàn)表2，3。結(jié)果表明，9個(gè)抗葉銹基因Lr9、Lr19、Lr24、Lr28、Lr29、Lr42、Lr47、Lr51、Lr53對(duì)供試葉銹菌生理小種均表現(xiàn)高抗甚至免疫；10個(gè)抗葉銹基因Lr2c、Lr3、LrB、Lr16、Lr3bg、Lr13、Lr14b、Lr23、Lr33和Lr39對(duì)所有供試葉銹菌生理小種均表現(xiàn)高感，因此，這19個(gè)抗葉銹病基因無(wú)法通過(guò)基因推導(dǎo)被推出，其余17個(gè)基因Lr1、Lr2a、Lr26、Lr3ka、Lr11、Lr17、Lr30、Lr10、Lr14a、Lr18、Lr2b、Lr15、Lr20、Lr21、Lr36、Lr44和Lr45對(duì)17個(gè)葉銹菌系均表現(xiàn)出不同抗性，可以通過(guò)苗期鑒定推導(dǎo)出來(lái)。編號(hào)為13、18、19、20、21、36、38、39和40的9個(gè)小麥品系對(duì)17個(gè)生理小種均表現(xiàn)抗病，因此，無(wú)法通過(guò)基因推導(dǎo)鑒定出其含有的抗性基因。根據(jù)基因推導(dǎo)和分子標(biāo)記檢測(cè)，在40份材料共檢測(cè)到Lr1、Lr10、Lr11、Lr14a、Lr15、Lr26、Lr34、Lr37和Lr46等9個(gè)小麥抗葉銹病基因。

從表3可看出，Lr1對(duì)TGPS、THDB、PHTS表現(xiàn)感病，對(duì)其余14個(gè)小種均表現(xiàn)低毒；對(duì)Lr17、Lr44、Lr45無(wú)毒的小種對(duì)Lr1也無(wú)毒，因此，Lr17、Lr44、Lr45無(wú)法在含有Lr1的小麥材料中通過(guò)基因推導(dǎo)鑒定出來(lái)；通過(guò)基因推導(dǎo)出品系14含有Lr1，小麥品系13、18、19、20、21、22對(duì)17個(gè)葉銹生理小種均表現(xiàn)抗病，結(jié)合分子標(biāo)記檢測(cè)證實(shí)此6個(gè)品系中含有Lr1(圖1)。

M.DL2000；Z.鄭州5389；1.XYZ461；2.XYZ462；3.XYZ463；4.XYZ464；5.XYZ465；6.XYZ466；7.XYZ467；8.XYZ468；9.XYZ469；10.XYZ470；11.XYZ471。Lr19和Lr26右上角的+、-表示檢測(cè)所使用的標(biāo)記不同。M.DL2000；Z.Zhengzhou 5389；1.XYZ461；2.XYZ462；3.XYZ463；4.XYZ464；5.XYZ465；6.XYZ466；7.XYZ467；8.XYZ468；9.XYZ469；10.XYZ470；11.XYZ471.The+，-in the upper right corner of the Lr19 and Lr26 indicate that the marks used for the detection are different.

Lr11對(duì)TGPS、THDB、FHDS、FHDQ、FGDQ表現(xiàn)抗病，對(duì)其余12個(gè)小種表現(xiàn)感病，其中對(duì)Lr10低毒的小種THDB對(duì)Lr11也表現(xiàn)低侵染型，因此Lr10無(wú)法在含有Lr11的小麥品系中鑒定出來(lái)，推導(dǎo)結(jié)果顯示，品系1、2、9、14、15、22、23、24、33和35等10份材料可能含有Lr11。利用Lr10特異性標(biāo)記對(duì)供試材料進(jìn)行檢測(cè)，在對(duì)照材料TcLr10和9個(gè)品系(4、7、11、12、13、14、17、18和40)中檢測(cè)到了Lr10的特異性條帶(282 bp)，9個(gè)品系對(duì)Lr10低毒小種THDB均表現(xiàn)抗病。

Lr15對(duì)FHJR、TGPS、FHJQ②、THDB和PHTS表現(xiàn)感病，對(duì)其余12個(gè)小種均表現(xiàn)抗病，因此品系28、29、30、37可能攜帶Lr15；Lr26對(duì)FGJQ、TGPS、FGJQ、FGDQ表現(xiàn)抗病，對(duì)其余13個(gè)小種表現(xiàn)感病，推測(cè)品系1、5、35可能含有Lr26，進(jìn)一步利用Lr26正負(fù)相關(guān)STS引物ω-secalin和Glu-B3檢測(cè)，結(jié)果與基因推導(dǎo)結(jié)果一致。

Lr14a對(duì)FHJT、TGPS、PHTS、FHGS①、FHDS、FHGS②、FHJS表現(xiàn)感病，對(duì)其他10個(gè)小種表現(xiàn)抗病，其中對(duì)Lr10無(wú)毒的小種對(duì)Lr14a也無(wú)毒，因此Lr10無(wú)法在含有Lr14a的小麥品系中通過(guò)基因推導(dǎo)鑒定出來(lái)，經(jīng)檢測(cè)品系4、35可能含有Lr14a，同時(shí)品系4經(jīng)標(biāo)記檢測(cè)還攜帶Lr10。

Lr34、Lr37、Lr46為成株抗病基因，苗期表現(xiàn)感病，無(wú)法通過(guò)苗期基因推導(dǎo)，其分子標(biāo)記檢測(cè)結(jié)果表明，品系4、7、13、15、16、18、19、20、21、37共10個(gè)材料含有Lr34，品系2、3、4、5、6等22個(gè)供試小麥材料中檢測(cè)到Lr37，攜帶Lr46的有39個(gè)供試品系(圖2)。另外，在40份國(guó)外小麥材料中均未檢測(cè)到已知抗葉銹病基因Lr9、Lr19、Lr20、Lr24。

M.DNA Marker；1.TcLr46；2.鄭州5389；3.XYZ461；4.XYZ462；5.XYZ463；6.XYZ464；7.XYZ465；8.XYZ466；9.XYZ467；10.XYZ468；11.XYZ469；12.XYZ470；13.XYZ471；14.XYZ472；15.XYZ473；16.XYZ474；17.XYZ475；18.XYZ476；19.XYZ477；20.XYZ478；21.XYZ479；22.XYZ480；23.XYZ481；24.XYZ482。M.DNA Marker；1.TcLr46；2.Zhengzhou 5389；3.XYZ461；4.XYZ462；5.XYZ463；6.XYZ464；7.XYZ465；8.XYZ466；9.XYZ467；10.XYZ468；11.XYZ469；12.XYZ470；13.XYZ471；14.XYZ472；15.XYZ473；16.XYZ474；17.XYZ475；18.XYZ476；19.XYZ477；20.XYZ478；21.XYZ479；22. XYZ480；23.XYZ481；24.XYZ482.

2.2 成株期抗病性鑒定結(jié)果

對(duì)2018—2019年種植于河南周口和2019—2020年種植于河北保定的試驗(yàn)材料進(jìn)行田間抗性鑒定，根據(jù)鑒定數(shù)據(jù)進(jìn)行成株抗葉銹分析，鄭州5389作為感病對(duì)照品種，在兩點(diǎn)的最終嚴(yán)重度分別為80%和90%，SAAR作為成株抗性對(duì)照品種，在兩點(diǎn)的最終嚴(yán)重度分別為1%和5%(表4)，在田間表現(xiàn)明顯的成株抗性。利用SAS進(jìn)行顯著差異性分析(表5)，表明在不同環(huán)境之間、不同品系之間、品系與環(huán)境之間均表現(xiàn)出顯著的差異性(P<0.05)，小麥品系在田間抗病性受到環(huán)境與基因共同作用。分析田間成株期最終嚴(yán)重度，結(jié)果表明，22個(gè)小麥品系具有成株抗性，部分成株抗性品系經(jīng)分子標(biāo)記檢測(cè)含有成株抗性基因Lr34、Lr37、Lr46，另有些材料可能還含有其他成株抗性基因。

表4 22個(gè)成株抗性品系與小麥葉銹菌混合生理小種的苗期互作侵染型及成株期田間最終嚴(yán)重度(FDS)Tab.4 Seedling infection types and final disease severity(FDS)in field with mixed Puccinia triticina(Pt)races of 22 wheat lines with slow-rusting resistance

3 結(jié)論與討論

Lr1定位在5DL染色體上，目前Lr1對(duì)我國(guó)多數(shù)流行小種已喪失抗性[31]，不過(guò)該基因可以用于基因聚合或基因布局防止小麥葉銹病。小麥品系20含有Lr1，其親本組合為：PBW343*2/KUKUNA//PBW343*2/KUKUNA*2/6/WBLL1*2/4/SNI/TRAP#1/3/KAUZ*2/TRAP//KAUZ/5/KACHU，其中TRAP[32]含有Lr1，因此品系20中的Lr1可能來(lái)自TRAP。

本試驗(yàn)中40個(gè)小麥品系共有9個(gè)品系可能攜帶Lr10，其中品系18系譜為WHEAR/KUKUNA/3/C80.1/3*ATAVIA//2*WBLL1*2/6/WBLL1*2/4/YACO/PBW65/3/KAUZ*2/TRAP//KAUZ/5/KACHU #1，TRAP[32]含有Lr10，因此品系18中Lr10可能來(lái)自TRAP。

Lr26來(lái)源于小麥與黑麥遠(yuǎn)緣雜交得到的1BL/1RS易位系，該染色體臂含有多種抗病基因如Sr31、Yr9和Pm8。目前Lr26在我國(guó)小麥育種中應(yīng)用廣泛，但已喪失抗性[28]，可將Lr26與其他抗病基因聚合提高抗病性[33]。本研究中3個(gè)供試小麥材料檢測(cè)到含有Lr26，基因推導(dǎo)與分子標(biāo)記結(jié)果一致。小麥品系5由SAUAL/3/KAUZ/PASTOR//PBW343/4/TRCH/SRTU//KACHU組合選育而成，其中PBW343[34]含有Lr26，因此該品系的Lr26可能來(lái)自PBW343。

表5 2018—2019年，2019—2020年40個(gè)小麥品系以及慢銹對(duì)照SAAR和感病對(duì)照鄭州5389的最終嚴(yán)重度數(shù)據(jù)方差分析Tab.5 Analysis of variance for the final disease severity of the 40 wheat lines，slow rusting check SAAR and susceptible check Zhengzhou 5389 in 2018—2019 and 2019—2020

Lr34與Lr46均為慢銹抗病基因，目前2個(gè)基因在田間仍具有良好抗性。分子標(biāo)記檢測(cè)結(jié)果顯示，10個(gè)供試小麥材料含有Lr34，39個(gè)供試小麥材料含有Lr46，僅小麥材料16未檢測(cè)出含有Lr46。韓燁等[34]研究結(jié)果表明，多數(shù)CIMMYT材料表現(xiàn)慢銹性，本研究結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了Lr34與Lr46廣泛存在于CIMMYT小麥品系中，這些品系可以作為抗源用于我國(guó)的小麥抗病育種。由于葉銹菌不斷變異，導(dǎo)致部分抗葉銹病基因喪失抗性，因此，獲得抗性持久的小麥品系是小麥抗性育種的重要目標(biāo)。了解國(guó)外小麥品系中豐富的抗葉銹病基因，并將其利用到我國(guó)持久抗病育種中，將豐富我國(guó)小麥品種抗病基因，有效控制小麥葉銹病，提高糧食產(chǎn)量進(jìn)而保障我國(guó)糧食安全。