李 君，閆志浩，賈萬里，許蒙蒙，張景鋒，徐秋良，韓浩園，權(quán) 凱

(1.河南牧業(yè)經(jīng)濟學院 動物科技學院，河南 鄭州 450046；2.河南省反芻動物營養(yǎng)與飼料資源開發(fā)國際聯(lián)合實驗室，河南 鄭州 450046；3.西峽縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，河南 西峽 474550)

脂肪甘油三酯水解酶(Adipose triglyceride lipase，ATGL)是脂肪水解過程中的主要限速酶，它可以特異性地水解甘油三酯為甘油二酯和游離脂肪酸，是調(diào)控細胞中甘油三酯和脂肪酸之間平衡的關(guān)鍵因子[1]。ATGL在成熟的棕色脂肪組織中表達量最高，主要存在于細胞的胞質(zhì)內(nèi)，少量分布于脂滴中。除脂肪組織外，其在肝臟、心臟、腸胃、大腦和腎臟中也有少量表達[2]。在COS-7細胞中過表達ATGL，檢測到培養(yǎng)基中游離脂肪酸含量增加，細胞內(nèi)甘油三酯儲存減少，表明ATGL在甘油三酯水解過程中發(fā)揮重要作用[3]。在妊娠和泌乳這種特殊的生理階段，乳腺具有強大的短期合成和分解脂質(zhì)的能力，是機體最活躍的代謝器官。研究發(fā)現(xiàn)，ATGL在奶山羊的各組織中均有表達，且在脂肪組織、肺臟和乳腺組織中表達量高于其他組織；同時還發(fā)現(xiàn)，ATGL在泌乳的乳腺組織中表達量高于干奶期乳腺組織，且干擾ATGL顯著增加乳腺上皮細胞中甘油三酯含量[4]。因此推測，ATGL在奶山羊乳腺泌乳過程中發(fā)揮重要的生物學功能。

ATGL作為脂肪第一步水解過程中的主要限速酶，控制著整個水解過程的進展速率。ATGL的表達量及活性高低對甘油三酯和脂肪酸含量的影響具有關(guān)鍵作用。啟動子是控制基因轉(zhuǎn)錄活性的重要元件，研究表明，ATGL的轉(zhuǎn)錄活性受到營養(yǎng)和激素水平的調(diào)控，饑餓會激活ATGL轉(zhuǎn)錄、喂食后則降低其轉(zhuǎn)錄水平[5]。多個轉(zhuǎn)錄因子可調(diào)控ATGL轉(zhuǎn)錄，Roy等[6]研究發(fā)現(xiàn)，過氧化物酶體增殖物激活受體(Peroxisome proliferators-activated receptors，PPARG)與特異性蛋白1(Specificity protein 1，Sp1)相互作用共同調(diào)控ATGL的轉(zhuǎn)錄。Kaltenecker等[7]在小鼠脂肪細胞中研究發(fā)現(xiàn)，生長激素通過信號轉(zhuǎn)導與轉(zhuǎn)錄活化蛋白5(Signal transducers and activators of transcription 5，STAT5)促進ATGL的轉(zhuǎn)錄，從而促進脂解。P53上調(diào)ATGL轉(zhuǎn)錄活性并且在脂肪細胞中促進脂解[8]。研究還表明，ATGL基因的轉(zhuǎn)錄受到干擾素調(diào)節(jié)因子4(Interferon regulatory factor 4，IRF4)和叉頭蛋白O1(Forkhead box protein O1，F(xiàn)OXO1)轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)節(jié)，生物信息學分析發(fā)現(xiàn)，ATGL的啟動子區(qū)域含有至少2個FOXO1結(jié)合位點[9-10]。因此，加強對ATGL基因啟動子的深入研究，將有助于掌控ATGL的轉(zhuǎn)錄表達。山羊奶脂肪酸含量豐富，乳脂滴小，利于消化吸收。

為了進一步提高羊乳品質(zhì)，本研究在對奶山羊ATGL基因功能研究的基礎(chǔ)上，通過對其啟動子進行克隆與轉(zhuǎn)錄活性分析，對ATGL轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制進行分析，旨在為進一步研究該基因的表達調(diào)控機制以及改善羊乳品質(zhì)提供基礎(chǔ)資料。

1 材料和方法

1.1 試驗材料與試劑

血液基因組DNA提取試劑盒和DNA回收試劑盒購自北京艾德萊生物科技有限公司；LATaqDNA聚合酶、克隆載體pMD19-T、限制性內(nèi)切酶BglⅡ和MluⅠ均購自TaKaRa公司；DNA Marker、感受態(tài)細胞TOP10和高純度質(zhì)粒小提中量試劑盒等購自北京天根生化科技有限公司；雙熒光素酶報告系統(tǒng)購自Promega公司；X-tremeGENE HP DNA轉(zhuǎn)染試劑購自羅氏公司；DMEM/F-12培養(yǎng)基、表皮生長因子、氫化可的松、胰島素、催乳素、胎牛血清等購自Invitrogen公司。奶山羊血液和奶山羊乳腺上皮細胞由河南牧業(yè)經(jīng)濟學院羊生物育種實驗室提供。

1.2 ATGL基因啟動子的克隆

利用血液基因組DNA提取試劑盒提取奶山羊基因組DNA。參照GenBank中牛(Bostaurus)的基因組序列，利用Primer Premier 5.0設計合成山羊(Caprahircus)ATGL基因啟動子克隆引物APF和APR，啟動子缺失片段引物APS1、APS2、APS3、APS4、APS5、APA(表1)。以奶山羊基因組DNA為模板，PCR擴增ATGL基因啟動子序列，反應體系：DNA模板(100 ng/μL)0.5 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，2×GC Buffer Ⅱ 10 μL，dNTP Mix(100 μmol/L)2 μL，LATaq酶0.2 μL，ddH2O補齊至20 μL；反應程序：95 ℃預變性4 min；95 ℃變性 30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸 2 min，33 個循環(huán)；72 ℃ 再次延伸10 min，12 ℃保存。利用1%瓊脂糖凝膠電泳對PCR產(chǎn)物進行檢測，將預期目的條帶進行凝膠回收。將回收產(chǎn)物與pMD19-T于16 ℃連接4 h，然后轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細胞TOP10，挑取單克隆菌落于LB液體培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)12～16 h，擴繁后用高純度質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，經(jīng)BglⅡ和MluⅠ雙酶切鑒定后篩選陽性克隆，送至上海生工生物工程有限公司測序。

表1 奶山羊ATGL基因啟動子克隆引物序列Tab.1 The sequences of primers used for cloning ATGL gene promoter of dairy goat

1.3 ATGL基因啟動子的生物信息學分析

應用Promoter 2.0預測ATGL基因的啟動子核心區(qū)域；ATGL基因啟動子CpG島采用CpG Islands(2004版，http：//www.ebi.ac.uk/emboss/cpgplot/)在線軟件進行分析；ATGL基因啟動子上潛在的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點應用Gene Regulation(2015版，http：//www.gene regulation.coml)和JASPAR(2020版，http://jaspar.genereg.net/)數(shù)據(jù)庫進行預測，綜合比較預測分值較高的結(jié)合位點，以確保其具有較高的特異性[11]。

1.4 ATGL啟動子報告基因載體構(gòu)建

根據(jù)設計的啟動子缺失片段引物(表1)，以含有ATGL啟動子的陽性質(zhì)粒為模板進行PCR擴增，得到一系列帶有BglⅡ和MluⅠ酶切位點的啟動子缺失片段，分別將其與pGL3-Basic載體(Promega)經(jīng)雙酶切后進行連接，最后得到含有ATGL啟動子不同缺失片段的報告基因重組質(zhì)粒，對酶切鑒定正確的質(zhì)粒進一步測序以鑒定其準確性，用于后續(xù)試驗。

1.5 細胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

奶山羊乳腺上皮細胞培養(yǎng)采用含10% FBS、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素、10 ng/mL表皮生長因子、5 μg/mL氫化可的松和5 μg/mL胰島素的DMEM/F12細胞培養(yǎng)基，于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，更換新鮮培養(yǎng)基，倒置顯微鏡下觀察細胞匯合度達90%以上時，即可進行傳代培養(yǎng)。

細胞于轉(zhuǎn)染前一天鋪48孔板，待細胞密度達到70%～80%時，參照轉(zhuǎn)染試劑操作說明進行DNA轉(zhuǎn)染。48孔板每孔轉(zhuǎn)染復合物體系為：X-tremeGENE HP 1 μL，質(zhì)粒 0.3 μg(pGL3-ATGL：pRL-TK =25∶1)，DMEM/F12補齊至30 μL。每個處理重復3次。

將羅格列酮和T0901317溶解于DMSO中，分別配制成10 mol/L的處理液。DNA轉(zhuǎn)染細胞12 h后，將配制好的羅格列酮或T0901317加入細胞中至最終的試驗濃度分別為50，1 μmol/L，同時對照組用相同濃度的DMSO進行處理。培養(yǎng)36 h后收集細胞，用于后續(xù)雙熒光素酶活性檢測。

1.6 雙熒光素酶活性檢測

乳腺上皮細胞轉(zhuǎn)染48 h后，收集細胞，按照雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒操作說明測定其活性。先棄去培養(yǎng)基，用PBS清洗細胞2次以去除殘留培養(yǎng)基，之后加入細胞裂解液于搖床上孵育30 min以充分裂解細胞，最后于多功能酶標儀上檢測螢火蟲熒光素酶活性(F值)與海腎熒光素酶活性(R值)，以螢火蟲與海腎的比值代表ATGL啟動子的相對活性。每孔進行3次測定，取平均值。

1.7 數(shù)據(jù)分析

對于啟動子活性檢測結(jié)果，利用數(shù)據(jù)分析軟件SPSS 22.0進行統(tǒng)計學分析，每個處理設置3個生物學重復，采用t檢驗和單因素方差分析進行顯著性檢驗，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 奶山羊ATGL啟動子的克隆與序列鑒定

利用引物APF和APR進行PCR擴增，成功得到約2 700 bp的ATGL基因5′側(cè)翼序列(圖1)。連接克隆載體，將鑒定為陽性的重組質(zhì)粒進行測序，結(jié)果顯示，成功克隆得到奶山羊ATGL基因5′側(cè)翼序列2 721 bp。

圖1 ATGL基因啟動子的PCR擴增產(chǎn)物Fig.1 The PCR amplification products of ATGL gene promoter

2.2 ATGL啟動子的生物信息學分析

經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)，擴增得到的ATGL基因5′側(cè)翼序列，轉(zhuǎn)錄起始位點(+1)上游2 024 bp及下游697 bp，包含外顯子1和部分內(nèi)含子1(圖2-A)。CpG島分析結(jié)果顯示，其序列中存在1個CpG島，位置為-253—+1位，且ATGL啟動子具有典型的TATA-box。經(jīng)在線軟件預測發(fā)現(xiàn)，ATGL啟動子上存在多個重要的調(diào)控元件，包括FOXO1、FOXO3、SREBF1、PPARA、PPARG、C/EBPα和E2F1等轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(圖 2-B)。

A.ATGL基因5′側(cè)翼序列圖示；B.ATGL啟動子潛在的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點分析(+1為轉(zhuǎn)錄起始位點)。A.Schematic representation of ATGL 5′flanking region；B.Analysis of the putative transcription factor binding sites of the ATGL promoter(+1 is the first base at transcription start site).

2.3 ATGL啟動子缺失片段載體構(gòu)建

以ATGL基因5′側(cè)翼序列全長為模板，利用一系列缺失引物進行PCR擴增，得到5個不同長度的啟動子截短片段(圖3-A)。通過連接pGL3-Basic報告基因載體，得到啟動子缺失片段報告基因重組質(zhì)粒，通過酶切鑒定(圖3-B)和測序，結(jié)果證實重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

A.不同缺失片段PCR擴增產(chǎn)物：1.-2 024—+216位；2.-1 399—+216位；3.-882—+216位；4.-527—+216位；5.-256—+216位；B.不同缺失片段重組質(zhì)粒酶切鑒定：1.pGL-APS1(-2 024—+216位)；2.pGL-APS2(-1 399—+216 位)；3.pGL-APS3(-882—+216位)；4.pGL-APS4(-527—+216位)；5.pGL-APS5(-256—+216位)。

2.4 ATGL基因啟動子核心區(qū)域確定

將ATGL缺失片段報告基因載體和內(nèi)參質(zhì)粒(海腎熒光素酶載體)共轉(zhuǎn)染奶山羊乳腺上皮細胞，48 h后收集細胞檢測相對熒光素酶活性。結(jié)果表明，ATGL啟動子區(qū)域由-2 024位缺失到-882位時，啟動子活性無顯著變化(P>0.05)；由-882位缺失到-527位時，其活性顯著降低(P<0.05)；由-527位缺失到-256位時，啟動子活性又顯著上升(P<0.05)(圖4)。說明啟動子區(qū)域-527—-256位可能存在抑制元件，推測轉(zhuǎn)錄起始位點上游-256 —+1位為ATGL基因啟動子轉(zhuǎn)錄核心區(qū)域。

pGL3-Basic.熒光素酶報告基因空載體；LUC.不同缺失片段的熒光素酶報告基因載體；不同字母表示差異顯著(P<0.05)。圖5—6同。pGL3-Basic.Luciferase reporter gene empty vector；LUC.Luciferase reporter gene vector with various deletion fragments；Different letters indicate significant differences(P<0.05).The same as Fig.5—6.

2.5 羅格列酮對ATGL啟動子活性的影響

對乳腺上皮細胞轉(zhuǎn)染pGL-APS1重組質(zhì)粒，用PPARG特異性激動劑羅格列酮(ROSI)處理細胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，羅格列酮顯著上調(diào)ATGL啟動子活性(P<0.05)(圖5-A)。接著將活性變化較為顯著的pGL-APS3、pGL-APS4和pGL-APS5重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染奶山羊乳腺上皮細胞，并用羅格列酮處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，APS3和APS4均能響應羅格列酮信號(圖5-B)，表明PPARG調(diào)控奶山羊ATGL啟動子活性，且作用區(qū)域位于-527—-256位。

A.羅格列酮對ATGL啟動子全長活性的影響；B.羅格列酮對ATGL啟動子不同片段的影響。A.Effect of ROSI on the activity of ATGL promoter in full length；B.Effect of ROSI on the activity of various deletion fragments of ATGL promoter.

2.6 T0901317對ATGL啟動子活性的影響

以同樣的方法在乳腺上皮細胞中轉(zhuǎn)染pGL-APS1重組質(zhì)粒，用SREBP1激動劑T0901317處理細胞發(fā)現(xiàn)，T0901317顯著上調(diào)ATGL啟動子活性(P<0.05)(圖6-A)；而在不同缺失片段中，T0901317僅對APS3有顯著上調(diào)作用(P<0.05)，對APS4和APS5沒有顯著影響(P>0.05)(圖6-B)，表明SREBP1參與調(diào)控奶山羊ATGL基因轉(zhuǎn)錄，且其作用區(qū)域位于-882—-527位。生物信息學分析發(fā)現(xiàn)，該片段中-710—-703位和-600—-592位存在預測的SREBP1結(jié)合位點，T0901317可能通過這2個位點發(fā)揮調(diào)控作用。

A.T0901317對ATGL啟動子全長活性的影響；B.T0901317對ATGL啟動子不同片段的影響。A.Effect of T0901317 on the activity of ATGL promoter in full length；B.Effect of T0901317 on the activity of various deletion fragments of ATGL promoter.

3 結(jié)論與討論

ATGL作為甘油三酯水解的限速酶，可以催化動物脂肪組織和非脂肪組織的甘油三酯水解[12]，前期的研究發(fā)現(xiàn)，ATGL在奶山羊乳腺組織中高表達，且在乳腺上皮細胞中發(fā)揮重要作用，ATGL影響細胞中甘油三酯含量和游離脂肪酸含量，同時影響脂肪酸代謝相關(guān)基因表達水平[4]?；谇捌诘倪@些研究成果，對奶山羊ATGL基因啟動子的結(jié)構(gòu)與轉(zhuǎn)錄活性進行分析，有助于闡明ATGL基因在乳腺細胞中的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制，對于研究羊奶中乳脂和乳脂肪酸的調(diào)控作用具有重要意義。

不同的組織和細胞含有相同的DNA序列，而組織和細胞功能的多樣性則是由基因的差異表達實現(xiàn)的，因此，研究基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控對理解生命活動具有重要意義。轉(zhuǎn)錄調(diào)控主要是通過轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合靶基因啟動子上特定DNA序列來實現(xiàn)，啟動子上存在多種調(diào)控元件，這些元件的數(shù)量、種類以及它們之間的距離與順序都有可能影響基因的轉(zhuǎn)錄，它們通過激活或抑制基因轉(zhuǎn)錄，對基因的表達差異發(fā)揮作用[13]。ATGL基因在脂肪細胞中受到多種轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控，其5′調(diào)控區(qū)含有E-box、TATA box、CAAT box等結(jié)合位點[14]，多種轉(zhuǎn)錄因子可以識別基因5′調(diào)控區(qū)的特異位點并與之作用調(diào)控ATGL基因的表達[15]。本研究以河南奶山羊基因組DNA為模板，擴增出ATGL基因5′側(cè)翼序列2 721 bp，參考其他物種的ATGL啟動子序列和生物信息學分析發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄起始位點上游序列包含典型的啟動子元件(TATA-box)，這些結(jié)果與在豬上的研究結(jié)果一致[16]。在線軟件預測發(fā)現(xiàn)，奶山羊ATGL啟動子中還含有FOXO1、FOXO3、SREBF1、PPAR和CEBPα等轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點，這些結(jié)合位點和豬上ATGL啟動子預測結(jié)果相一致[17]。通過缺失分析發(fā)現(xiàn)，從-882位缺失到-527位時啟動子活性顯著下降，表明此區(qū)域含有正調(diào)控元件，而從-527位缺失到-256位時，啟動子活性反而上調(diào)，表明此區(qū)域含有抑制其活性的元件。經(jīng)過分析確定其核心區(qū)域在-256—+1位，這與孫健[16]在草魚上和王小宇[17]在豬上的研究報道結(jié)果基本一致，但是二者報道的ATGL啟動子活性區(qū)域更小。

PPARG已被證實在奶牛和奶山羊的乳腺脂肪酸調(diào)控網(wǎng)絡中發(fā)揮重要作用，其影響脂肪酸的從頭合成、甘油三酯的合成和分泌相關(guān)基因的表達[18-20]，PPARG通過結(jié)合在PPAR 反應元件上對下游基因表達進行調(diào)控[21]。Shi等[22]研究發(fā)現(xiàn)，在奶山羊乳腺上皮細胞中，羅格列酮和PPARG過表達影響奶山羊ATGL基因mRNA水平，在多個物種的ATGL啟動子上均存在PPARγ結(jié)合位點[23]。有研究發(fā)現(xiàn)，在脂肪細胞中PPARG抑制ATGL基因的轉(zhuǎn)錄，但是在脂肪細胞分化后期，PPARG促進ATGL基因的轉(zhuǎn)錄，這種促進作用是通過與轉(zhuǎn)錄因子Sp1 的共同作用完成，說明PPARG對ATGL的調(diào)控具有時空特異性[6]。本試驗中，通過在線軟件預測到在ATGL啟動子的-282—-267位存在潛在的PPARG結(jié)合位點，通過PPARG特異性激動劑處理細胞發(fā)現(xiàn)，羅格列酮在截短片段的-527—-256位發(fā)揮作用，表明PPARG調(diào)控ATGL基因轉(zhuǎn)錄，這與前人的研究結(jié)果一致。

SREBP1是調(diào)控脂肪合成的主要轉(zhuǎn)錄因子，SREBP1核蛋白在運輸進入細胞核后與靶基因啟動子上的位點結(jié)合從而激活靶基因的轉(zhuǎn)錄[24-25]。研究證實，LXRα可直接結(jié)合在SREBP1的啟動子元件上，對其進行轉(zhuǎn)錄調(diào)控[26]。而LXRα的人工合成激動劑T0901317又被廣泛地作為SREBP1的激動劑應用于SREBP1的功能研究中[27]。Xu等[28]研究發(fā)現(xiàn)，過表達SREBP1影響ATGL基因mRNA表達。本研究通過T0901317處理細胞，發(fā)現(xiàn)其顯著上調(diào)ATGL啟動子活性，且作用區(qū)域位于-882—-527位；生物信息學分析發(fā)現(xiàn)，奶山羊ATGL啟動子-710—-703位和-600—-592位存在預測的SREBP1結(jié)合位點。表明SREBP1可能是ATGL基因的轉(zhuǎn)錄因子，促進ATGL基因轉(zhuǎn)錄，但是關(guān)于SREBP1對ATGL啟動子的調(diào)控作用及其作用位點目前還未見報道，在奶山羊上還需進一步的試驗驗證。

本研究成功克隆奶山羊ATGL啟動子序列，利用生物信息學分析了ATGL啟動子序列中的調(diào)控元件結(jié)合位點，構(gòu)建了不同片段長度的ATGL啟動子報告基因載體，啟動子活性分析表明其核心區(qū)域位于-256—+1位，且PPARG和SREBP1能夠促進ATGL基因的啟動子活性，且作用區(qū)域分別位于-527—-256位和-882—-527位。