祝一鳴，劉艷瀟，何九卿，段靈濤，周而勛

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物病理學(xué)系，廣東省微生物信號與作物病害防控重點實驗室，廣東 廣州 510642)

炭疽菌(Colletotrichumspp.)是一類重要的植物病原真菌，該真菌在2012年被評選為世界十大植物病原真菌之一[1]。希金斯炭疽菌(C.higginsianum)是炭疽菌中一種典型的半活體營養(yǎng)型真菌，能夠侵染諸多十字花科植物，如蕓薹屬(Brassica)、蘿卜屬(Raphanus)植物以及模式植物擬南芥(Arabidopsisthaliana)等，引起十字花科炭疽病[2-3]。菜心(B.parachinensis)是華南地區(qū)特產(chǎn)蔬菜之一，該地區(qū)高溫高濕的氣候條件，非常有利于菜心炭疽病的發(fā)生，該病一旦發(fā)生，輕則影響蔬菜的外觀品質(zhì)，重則造成30%～40%的減產(chǎn)[4]。目前，十字花科炭疽病的防控手段主要以化學(xué)農(nóng)藥防治為主，選育和推廣抗病品種為輔，但總體來說仍缺乏十分有效的防治措施。由于希金斯炭疽菌易于在實驗室中培養(yǎng)，也便于進行基因操作，同時該菌的完整基因組數(shù)據(jù)及轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)也已測序完成并公布[3，5]?；谝陨线@些條件，希金斯炭疽菌-擬南芥互作體系非常適合作為植物病害系統(tǒng)模型來研究這類真菌的致病機制，因而對于探索植物炭疽病新的防控策略具有重要的意義。

病原菌在侵染植物過程中，會分泌與植物相互作用的蛋白，這類蛋白稱為效應(yīng)蛋白或效應(yīng)子(Effector)，在植物細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮著重要作用，從而影響病原菌與植物的相互作用結(jié)果[6]。植物可以利用2層免疫系統(tǒng)來保護自身以免受外界病原菌的侵染。首先，植物細(xì)胞表面的模式識別受體(Pattern recognition receptors，PRRs)檢測到保守的病原相關(guān)分子模式(Pathogen associated molecular patterns，PAMPs)，并觸發(fā)植物第1道免疫防線—病原相關(guān)分子模式觸發(fā)的免疫(PAMP triggered immunity，PTI)；其次，當(dāng)病原菌效應(yīng)子被寄主植物相應(yīng)的抗性蛋白直接或間接識別之后，寄主植物的第2道防線—效應(yīng)子觸發(fā)的免疫(Effector-triggered immunity，ETI)則被激活[7]。一般來說，PTI提供植物更基礎(chǔ)和更為廣泛的抗性，而ETI則給植物提供了更強烈和更加特異性的免疫反應(yīng)，如過敏性反應(yīng)[8]。近年來，隨著真菌和植物的基因組及轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的增多，關(guān)于植物-真菌互作方面的研究取得了重大進展。在與植物的互作過程中，真菌能夠分泌數(shù)百種被稱為效應(yīng)子的蛋白質(zhì)來操縱寄主生理過程或抑制寄主免疫，以利于病原真菌的侵染[9]。由于許多效應(yīng)子是改變寄主新陳代謝和發(fā)育方向的工具，它們的合成數(shù)量和合成時機都被病原菌嚴(yán)格控制，以達(dá)到最佳的、平衡的結(jié)果，特別是在需要保持寄主生存能力的活體營養(yǎng)階段?，F(xiàn)有的研究表明，多種病原真菌能嚴(yán)格控制效應(yīng)子合成時機及其分泌位置和方式，如稻瘟病菌、玉米黑粉菌[10-12]。與此同時，眾多轉(zhuǎn)錄組試驗也證明了效應(yīng)子在真菌侵染階段特異性表達(dá)，如專性活體營養(yǎng)病原菌青楊葉銹菌(Melampsoralarici-populina)、半活體營養(yǎng)真菌希金斯炭疽菌、專性活體營養(yǎng)真菌大麥布氏白粉菌(Blumeriagraminis)、根際共生菌印度梨形孢(Serendipitaindica)等[5，13-15]。因此，在真菌侵染階段特異性表達(dá)并誘導(dǎo)植物過敏性壞死成為篩選效應(yīng)子的有效手段之一。

本研究基于本研究室前期預(yù)測的希金斯炭疽菌候選效應(yīng)子進行篩選[16]，得到一個能穩(wěn)定引起煙草葉片死亡、且在侵染階段有特異性表達(dá)的候選效應(yīng)子ChEP085，并對該效應(yīng)子進行深入的分析，明確其功能，以期更好地了解希金斯炭疽菌的致病機理，為十字花科植物炭疽病的防控提供理論支撐。

1 材料和方法

1.1 菌株、質(zhì)粒及植物材料

希金斯炭疽菌國際標(biāo)準(zhǔn)菌株IMI349063由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院黃俊斌教授惠贈，在PDA培養(yǎng)基、28 ℃黑暗下培養(yǎng)，備用。大腸桿菌(Eschrichiacoli)DH5α購買于擎科公司；根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)GV3101由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)卵菌與真菌分子生物學(xué)實驗室惠贈，現(xiàn)由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)實驗室留種保存；根癌農(nóng)桿菌AGL1由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)群體微生物研究中心鄧懿禎教授惠贈，現(xiàn)由本實驗室留種保存。本氏煙草(Nicotianabenthamiana)種子由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)卵菌與真菌分子生物學(xué)實驗室惠贈，現(xiàn)由本實驗室留種保存；植物培養(yǎng)室中培育，光照16 h/25 ℃、黑暗8 h/22 ℃，選取生長至35 d的煙草用于試驗。擬南芥Col-0，光照16 h/22 ℃，黑暗8 h/20 ℃培養(yǎng)28 d，用于試驗。

馬鈴薯X病毒(PotatovirusX，PVX)表達(dá)載體PVX用于煙草瞬時表達(dá)，抗生素選擇性標(biāo)記為卡那霉素(Kanamycin)，INF1(來自致病疫霉(Phytophthorainfestans)的凋亡誘導(dǎo)蛋白)已構(gòu)建在PVX表達(dá)載體上，由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)卵菌與真菌分子生物學(xué)實驗室惠贈。增強型綠色熒光表達(dá)載體pBinceGFP，抗生素選擇性標(biāo)記為卡那霉素，由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)卵菌與真菌分子生物學(xué)實驗室惠贈。敲除載體為pFGL821，載體大小8 401 bp，抗性標(biāo)記為卡那霉素和潮霉素(HygromycinB)，由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)群體微生物研究中心鄧懿禎教授惠贈?；匮a載體為pFGL822-NeoR，載體大小8 288 bp，抗性標(biāo)記為卡那霉素和新霉素(Neomycin)，由本實驗室提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 候選效應(yīng)子基因表達(dá)模式分析 收集希金斯炭疽菌野生型(Wild type，WT)的分生孢子。并用血球計數(shù)板計數(shù)，將孢子懸浮液濃度調(diào)至1.0×106個/mL，隨后均勻噴灑接種至擬南芥葉片上，置于光照培養(yǎng)箱中保濕培養(yǎng)(光照16 h/26 ℃，黑暗8 h/25 ℃)，分別于接種后的6，12，24，36，48，60 h收取擬南芥葉片樣品，每個時間段3株重復(fù)，液氮速凍后，按照TaKaRa Mini BEST plant RNA Extration Kit RNA提取試劑盒步驟進行提取，剩余樣品保存于-80 ℃冰箱備用。以提取的總RNA為模板，按照TaKaRa PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Code No.RR047A)反轉(zhuǎn)錄試劑盒步驟合成第1鏈cDNA。實時熒光定量PCR(qRT-PCR)采用擎科2×T5 Fast qPCR Mix(SYBR Green I)Lot#TSE202，按照說明使用20 μL反應(yīng)體系，在實時熒光定量 PCR 儀(Bio-Rad CFX96)運行，程序為：94 ℃ 30 s；40 個循環(huán)(95 ℃ 5 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 10 s)；95 ℃ 10 s。以希金斯炭疽菌的Actin基因作為內(nèi)參基因，相對表達(dá)量采用2-ΔΔCt法計算。試驗中的所有引物見表1。

表1 使用的PCR引物Tab.1 Primers used in this study

1.2.2 煙草瞬時表達(dá)和煙草葉片酒精脫色觀察 注射基質(zhì)的配制：10 mmol/L MgCl2，10 mmmol/L MES，150 μmol/L AS。菌液制備：挑取含有目的基因質(zhì)粒的農(nóng)桿菌GV3101單菌落至5 mL含有50 mg/L卡那霉素和100 mg/L利福平的LB液體培養(yǎng)基中，28 ℃、200 r/min搖床中培養(yǎng)48 h；室溫5 000 r/min離心3 min，棄上清；加入3 mL 10 mmol/L MgCl2重懸，室溫5 000 r/min離心3 min，棄上清；加入配好的注射基質(zhì)，使用分光光度計調(diào)OD600為0.5，28 ℃黑暗孵育2 h。

選取長勢良好的煙草植株，從頂端向下數(shù)第3～6片真葉注射農(nóng)桿菌，每個處理注射不同植株的3片葉片以上；做好標(biāo)記后于植物培養(yǎng)室中繼續(xù)培養(yǎng)。每片煙草葉片上注射4個位點，左上角注射PVX-HA空載體作為陰性對照，右上角注射PVX-INF1作為陽性對照，左下角注射PVX-ChEP085，右下角注射PVX-ChEP085-noSP，設(shè)置5個重復(fù)，6 d后觀察誘導(dǎo)壞死試驗結(jié)果。為了便于觀察煙草葉片的壞死效果和程度，可對煙草葉片進行脫色處理。剪下煙草葉片拍照后放入培養(yǎng)皿，加入無水乙醇至沒過葉片，室溫置于脫色搖床上，100 r/min脫色24～36 h，待葉綠素完全褪去后拍照觀察。

1.2.3 ChEP085信號肽功能研究 ChEP085生物信息學(xué)分析，即從NCBI網(wǎng)站搜索ChEP085(locus_tag="CH063_11815，product="hypothetical protein"，protein_id="CCF41571.1)，確定基因大小及mRNA序列，使用SignalP 4.1(http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)，Conserved Domain Datebase預(yù)測有無已知功能的結(jié)構(gòu)域。

ChEP085信號肽誘導(dǎo)或抑制煙草葉片壞死研究。為明確信號肽對誘導(dǎo)煙草葉片壞死或?qū)NF1誘導(dǎo)的壞死的影響，分別將效應(yīng)子全長及缺失信號肽序列單獨注射煙草、與INF1共注射煙草觀察試驗結(jié)果。根據(jù)信號肽預(yù)測結(jié)果，設(shè)計缺失信號肽序列引物。以PVX-ChEP085質(zhì)粒為模板，將缺失信號肽序列構(gòu)建至PVX表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101后先單獨注射煙草，驗證ChEP085缺失信號肽后是否影響誘導(dǎo)煙草葉片壞死的功能。注射方法參照1.2.2。

ChEP085信號肽對亞細(xì)胞定位的影響：為明確希金斯炭疽菌效應(yīng)子ChEP085的亞細(xì)胞定位及信號肽對亞細(xì)胞定位的影響，將效應(yīng)子ChEP085全長序列與缺失信號肽序列構(gòu)建到含有增強型綠色熒光蛋白的綠色熒光表達(dá)載體pBinceGFP上。轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌進行煙草注射，方法參照1.2.2。亞細(xì)胞定位實驗進行全葉片注射，注射后48 h切下煙草葉片，制作水玻片，利用熒光顯微鏡在波長480 nm下觀察葉片下表皮細(xì)胞中綠色熒光分布情況并進行拍照。

1.2.4 效應(yīng)子基因ChEP085敲除菌株的獲取與驗證 以希金斯炭疽菌基因組DNA為模板進行所需基因片段克隆，將質(zhì)粒pFGL821進行雙酶切，選用Hind Ⅲ和SalⅠ酶切位點，作為上游片段重組位點進行重組連接，測序驗證連接正確后，將其命名為p821-85us。繼續(xù)對質(zhì)粒p821-85us進行雙酶切，選用BamH Ⅰ和XbaⅠ酶切位點，作為下游片段重組位點進行重組連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α并進行菌落驗證，菌落驗證正確后送公司測序，測序驗證連接正確后提取質(zhì)粒，將其命名為敲除質(zhì)粒p821-85ko。利用T-DNA介導(dǎo)的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法獲得敲除轉(zhuǎn)化子經(jīng)過抗性篩選、PCR驗證，獲得候選敲除轉(zhuǎn)化子[17]。利用Southern Blot技術(shù)對候選轉(zhuǎn)化子進行拷貝數(shù)驗證，具體參照Gu等[18]關(guān)于敲除突變體的獲取與驗證的方法進行。

1.2.5 效應(yīng)子基因ΔChEP085互補菌株的獲取與驗證 將質(zhì)粒pFGL822-NeoR進行單酶切，選用EcoR Ⅰ酶切位點，使用試劑盒VazymeCloneExpress Ⅱ One Step Cloning Kit重組連接，具體操作參照1.2.4，轉(zhuǎn)化大腸桿菌后進行PCR驗證，驗證引物使用HBAtg8-F/R，測序驗證正確后，將其命名為p822-85hb?；パa菌株的獲取與驗證方法同1.2.4。

1.2.6 野生型菌株、ΔChEP085突變菌株及CΔChEP085互補菌株基本生長情況的測定 用打孔器分別在野生型菌株、ΔChEP085突變菌株和CΔChEP085互補菌株上打取直徑為6 mm 的新鮮菌餅，接種于 PDA 培養(yǎng)基中心位置，每個菌株設(shè)置3個重復(fù)。在 28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d 后用十字交叉法測量菌落直徑，并記錄菌落的生長形態(tài)。

1.2.7 野生型菌株、ΔChEP085突變菌株及CΔChEP085互補菌株產(chǎn)孢量測定 用打孔器取6 mm的野生型菌株、ΔChEP085突變菌株及CΔChEP085互補菌株的新鮮菌餅若干，分別接種到含 150 mL PDB 培養(yǎng)基的錐形瓶中，28 ℃搖床振蕩培養(yǎng) 5 d，過濾，5 000 r/min離心 10 min，過濾收集分生孢子，使用血球計數(shù)板對每個菌株產(chǎn)生分生孢子的數(shù)量進行計數(shù)。

1.2.8 野生型菌株、ΔChEP085突變菌株及CΔChEP085互補菌株致病力的測定 參照1.2.7獲得希金斯炭疽菌野生型菌株和各敲除突變體的孢子懸浮液，調(diào)孢子濃度為1.0×106個/mL，采用噴霧接種的方法接種活體擬南芥，每個菌株噴霧接種3株擬南芥，擬南芥葉面與葉背都噴霧接種完全后放進塑料盆中，并在塑料盆上鋪上一層保鮮膜，于25 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)光照條件為16 h光照、8 h黑暗，培養(yǎng)4 d后觀察活體擬南芥發(fā)病情況并拍照記錄。

接種后第5天，按照表2 所列的病情分級標(biāo)準(zhǔn)，對擬南芥進行病情指數(shù)統(tǒng)計。

表2 擬南芥接種希金斯炭疽菌后的病情分級標(biāo)準(zhǔn)Tab.2 Disease grading criteria for Arabidopsis thaliana inoculated with Colletotrichum higginsianum

病情指數(shù)=∑(病級葉片株數(shù)×病級數(shù)值)/(葉片總和×發(fā)病最高級的代表數(shù)值)×100。

2 結(jié)果與分析

2.1 ChEP085生物信息學(xué)分析

希金斯炭疽菌ChEP085基因(GenBank登錄號：OBR03416)的序列長度為675 bp，無內(nèi)含子，編碼224個氨基酸，翻譯產(chǎn)物為假定蛋白；通過SingnalP 4.1 分析表明，其N端含有一段21個氨基酸的信號肽序列(圖1)，利用Conserved Domain Datebase進行預(yù)測，未發(fā)現(xiàn)已知功能的結(jié)構(gòu)域。

圖1 希金斯炭疽菌效應(yīng)子ChEP085在SingnalP 4.1的信號肽預(yù)測Fig.1 Signal peptide prediction of effector ChEP085 of Colletotrichum higginsianum in SingnalP 4.1

2.2 ChEP085基因在希金斯炭疽菌侵染擬南芥過程中誘導(dǎo)表達(dá)

為探索效應(yīng)子ChEP085在希金斯炭疽菌侵染寄主過程中的表達(dá)情況，分析了ChEP085基因在分生孢子懸浮液噴霧接種擬南芥6，12，24，36，48，60 h后的表達(dá)情況，0 h樣品為菌絲。從圖2可看出，ChEP085基因在菌絲中有一定表達(dá)；在侵染后，ChEP085基因一開始表達(dá)量較低，在24 h有最大表達(dá)量，之后該基因表達(dá)量下降，達(dá)到接種初期水平。

圖2 希金斯炭疽菌效應(yīng)蛋白基因ChEP085的表達(dá)模式Fig.2 Expression patterns of effector gene ChEP085 of Colletotrichum higginsianum

2.3 效應(yīng)子ChEP085的亞細(xì)胞定位

由圖3可知，表達(dá)空載pBinceGFP的綠色熒光在細(xì)胞核(紅色箭頭指示)和細(xì)胞膜上均有分布，表明載體上的綠色熒光蛋白在煙草細(xì)胞中成功表達(dá)；重組表達(dá)載體pBinceGFP-ChEP085的綠色熒光大部分分布在細(xì)胞膜上，有少量堆積在細(xì)胞質(zhì)中；而重組表達(dá)載體pBinceGFP-ChEP085-noSP的綠色熒光在細(xì)胞核(紅色箭頭指示)、細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中都有定位。以上結(jié)果說明，信號肽在效應(yīng)子ChEP085的定位過程中起到重要作用。

2.4 ChEP085信號肽的功能研究

為明確效應(yīng)子ChEP085信號肽的功能，將其缺失信號肽的序列構(gòu)建至PVX表達(dá)載體，利用農(nóng)桿菌瞬時表達(dá)系統(tǒng)注射煙草，注射6 d后觀察葉片壞死情況。以空載PVX為陰性對照、INF1為陽性對照，表達(dá)效應(yīng)子ChEP085和去除信號肽的效應(yīng)子ChEP085-noSP，6 d后觀察壞死情況，結(jié)果顯示，去除信號肽后，仍能引起煙草葉片壞死反應(yīng)(圖4)，說明信號肽的缺失不影響ChEP085引起煙草葉片壞死的功能。

A.空載pBinceGFP熒光分布；B.pBinceGFP-ChEP085熒光分布；C.pBinceGFP-ChEP085-noSP熒光分布。A.The localization of empty vector pBinceGFP under fluorescence microscope；B.The localization of pBinceGFP-ChEP085；C.The localization of pBinceGFP-ChEP085-noSP.

A.含有相應(yīng)重組載體的農(nóng)桿菌菌液處理注射 6 d 后的本氏煙表型觀察；B.本氏煙葉片經(jīng)過脫色處理后的表型觀察。1.PVX；2.PVX-INF1；3.PVX-ChEP085；4.PVX-ChEP085-noSP。

2.5 效應(yīng)子基因ChEP085的敲除及回補

本研究采用同源重組的方法對編碼該蛋白的基因進行敲除，之后再將該基因回補，以驗證該效應(yīng)子的功能，敲除策略如圖5所示。

圖5 ChEP085基因敲除策略Fig.5 Knockout strategy of gene ChEP085

以清水和希金斯炭疽菌野生型菌株基因組DNA為對照，使用3對引物對敲除突變體進行驗證。使用ChEP085基因引物85-F和85-R進行擴增時，基因敲除突變體不能擴增到條帶，而希金斯炭疽菌野生型菌株可擴增得到大小為675 bp的條帶(圖6-A)；使用潮霉素基因引物Hyg-F和Hyg-R擴增時，基因敲除突變體可以擴增得到一條大小為865 bp的條帶，而希金斯炭疽菌野生型菌株不能擴增到條帶(圖6-B)；使用基因敲除引物85ko-F和85ko-R擴增時，基因敲除突變體可以擴增得到一條大小為2 515 bp的條帶，而希金斯炭疽菌野生型菌株擴增得到一條大小為1 770 bp的條帶(圖6-C)。

A.引物85-F/R擴增PCR產(chǎn)物；B.引物Hyg-F/R擴增PCR產(chǎn)物；C.引物85ko-F/R擴增PCR產(chǎn)物。M.DL5000 Marker；1—4.ΔChEP085-1/-2/-6/-8 敲除轉(zhuǎn)化子；5.雙蒸水；6.野生型菌株。A.PCR products were amplified using primers 85-F/R；B.PCR products were amplified using primers Hyg-F/R；C.PCR products were amplified using primers 85ko-F/R.M.DL5000 Marker；1—4.ΔChEP085-1/-2/-6/-8 knockout mutants；5.ddH2O；6.Wild type.

本研究一共驗證得到4株正確的基因敲除突變體，分別命名為ΔChEP085-1、ΔChEP085-2、ΔChEP085-6、ΔChEP085-8，之后再隨機選取2個突變體ΔChEP085-2、ΔChEP085-8，以希金斯炭疽菌野生型菌株基因組DNA為對照，進行Southern Blot驗證。由于選取探針位置在潮霉素基因上，故希金斯炭疽菌野生型菌株基因組沒有雜交條帶，而基因敲除突變體雜交得到一條大小為2 577 bp的條帶，如圖7所示，結(jié)果證明了ChEP085基因被成功敲除，且替換目的基因的潮霉素基因片段在基因敲除突變體中為單拷貝。后期選取ΔChEP085-8基因敲除突變體(后統(tǒng)稱為ΔChEP085)進行了相關(guān)生物學(xué)性狀的觀察。

1.野生型菌株；2.基因敲除突變體ΔChEP085-2；3.基因敲除突變體ΔChEP085-8。1.Wild type；2.ΔChEP085-2 knockout mutant；3.ΔChEP085-8 knockout mutant.

回補突變體經(jīng)過G418的初步篩選后，以希金斯炭疽菌野生型菌株和基因敲除突變體DNA為對照，使用2對引物對基因回補突變體進行驗證：使用引物85-F和85-R擴增時，希金斯炭疽菌野生型菌株和基因回補突變體可以擴增得到一條大小為672 bp的條帶，而基因敲除突變體不能擴增到條帶(圖8-A)；使用引物G418-F和G418-R擴增時，野生型菌株和基因敲除突變體不能擴增到條帶，只有基因回補突變體可擴增得到大小為715 bp的條帶(圖8-B)。最后得到4株驗證正確的基因回補菌株，包括M12、2-13、8-7、8-9。后期選取M12回補突變體(后統(tǒng)稱為CΔChEP085)進行了相關(guān)生物學(xué)性狀的觀察。

A.引物85-F/R擴增結(jié)果；B.引物G418-F/R擴增結(jié)果；M.DS2000 Marker；1.雙蒸水；2.野生型菌株；3.ΔChEP085突變體；4.回補質(zhì)粒p822-85hb；5—9(M12、2-13、8-5、8-7、8-9).回補轉(zhuǎn)化子。

2.6 野生型菌株、ΔChEP085突變菌株及互補菌株基本生長情況的測定

菌絲生長5 d后(圖9-A)，觀察菌落形態(tài)，同時測量菌落直徑發(fā)現(xiàn)，野生型菌株、ΔChEP085突變菌株及互補菌株的菌落形態(tài)無顯著差異，菌落直徑也無顯著差異(圖9-B)。

A.PDA 培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)；B.菌落直徑比較；圖中數(shù)據(jù)為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤。不同字母表示在 P<0.05 時差異顯著。圖10—11同。

2.7 野生型菌株、ΔChEP085突變菌株及CΔChEP085互補菌株產(chǎn)保量及致病力情況分析

為明確ChEP085基因?qū)Ξa(chǎn)孢量的影響，對希金斯炭疽菌野生型菌株、ΔChEP085突變菌株及互補菌株的產(chǎn)孢量進行了測定(圖10)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ΔChEP085突變菌株的產(chǎn)孢量顯著低于野生型和CΔChEP085(P<0.05)。說明ChEP085基因在希金斯炭疽菌產(chǎn)孢中起著重要的作用。

圖10 野生型菌株、ΔChEP085突變菌株及CΔChEP085互補菌株的產(chǎn)孢量分析Fig.10 Analysis of conidia production of wild type，ΔChEP085 mutants and CΔChEP085 conplementary strains

此后，為研究該效應(yīng)子對致病力的影響，分別將野生型、ΔChEP085和CΔChEP085菌株的孢子濃度調(diào)節(jié)到1.0×106個/mL，然后噴灑至寄主植物擬南芥葉片上，在27 ℃、濕度100%、12 h/12 h光照/黑暗交替條件下培養(yǎng)5 d后，再觀察發(fā)病情況(圖11-A)。根據(jù)葉片的發(fā)病面積，劃分為不同的病級，并統(tǒng)計病情指數(shù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ΔChEP085突變菌株的病情指數(shù)為42.0±2.65，顯著低于野生型90.0±6.7和CΔChEP085菌株87.7±2.52(P<0.05)(圖11-B)。說明該效應(yīng)子ChEP085在希金斯炭疽菌致病過程中起到了重要作用。

A.野生型、ΔChEP085突變菌株及CΔChEP085互補菌株孢子噴灑擬南芥5 d后，擬南芥的發(fā)病情況；B.對應(yīng)的病情指數(shù)統(tǒng)計。

3 結(jié)論與討論

近年來，隨著越來越多的病原真菌基因組和轉(zhuǎn)錄組測序的完成，針對各種真菌效應(yīng)子的研究也逐漸深入，炭疽菌屬中效應(yīng)子的功能也越來越多地被揭示。在平頭炭疽菌(C.truncatum)中，效應(yīng)子CtNUDIX在活體營養(yǎng)階段后期表達(dá)，在煙草葉片中瞬時表達(dá)該基因能誘導(dǎo)類似過敏性反應(yīng)(HR)的細(xì)胞死亡，過表達(dá)該基因?qū)е虏≡ブ虏×?；膠孢炭疽菌(C.gloeosporioides)效應(yīng)子CgDN3能抑制寄主HR反應(yīng)，其敲除突變體喪失對寄主植物的侵染能力[19]；黃瓜炭疽菌(C.orbiculare)的分泌蛋白NIS1能誘導(dǎo)本氏煙草細(xì)胞死亡，且這一壞死反應(yīng)能在侵染后期被CgDN3所抑制[20]，另一個效應(yīng)子CoDN3能抑制NIS1誘導(dǎo)的煙草細(xì)胞壞死，表明其具有抑制ETI途徑的功能[19-20]，CoMC69對黃瓜炭疽菌成功侵染起關(guān)鍵作用[20]；而在希金斯炭疽菌中，基于全基因組測序，為研究關(guān)鍵致病基因提供了條件，其中侵染早期階段(附著胞穿透和活體營養(yǎng)階段)有大量編碼假定分泌效應(yīng)子的基因被激活[5]，這些效應(yīng)子可能干擾或抑制植物免疫反應(yīng)以促進病原菌的侵染。其中，效應(yīng)子ChELP1和ChELP2抑制幾丁質(zhì)觸發(fā)的寄主免疫反應(yīng)，且ChELP1是希金斯炭疽菌發(fā)揮毒力所必需的效應(yīng)子[21]；候選效應(yīng)子ChEC6和ChEC36集中分泌在附著胞孔處，而ChEC34、ChEC89則聚集在初生菌絲附近的界面體中[22]。

本研究基于本實驗室前期的研究結(jié)果[16]，借助煙草瞬時表達(dá)系統(tǒng)和qRT-PCR分析發(fā)現(xiàn)，ChEP085效應(yīng)子能夠穩(wěn)定引起煙草壞死，并且在亞細(xì)胞定位試驗中顯示綠色熒光蛋白(即ChEP085與綠色熒光蛋白融合表達(dá))聚集在細(xì)胞膜，ChEP085基因在整個侵染階段保持較低表達(dá)量的同時，在侵染擬南芥后24 h表達(dá)量明顯提高，說明編碼候選效應(yīng)子ChEP085的基因在希金斯炭疽菌侵染寄主的早期階段(附著胞穿透和活體營養(yǎng)階段)被激活，與此類似的是禾谷炭疽菌(C.graminicola)中，效應(yīng)子Cgf1和CgEP1就是在活體營養(yǎng)階段進行表達(dá)并幫助病原菌在寄主體內(nèi)成功定殖的[23-24]。因此，效應(yīng)子ChEP085很可能在此時對病原菌的成功侵染發(fā)揮著關(guān)鍵作用。本研究對編碼ChEP085效應(yīng)蛋白的基因進行敲除發(fā)現(xiàn)，該基因?qū)τ谙＝鹚固烤揖纳L和菌落形態(tài)幾乎沒有影響，但與野生型和CΔChEP085菌株相比，ΔChEP085突變體的產(chǎn)孢量及致病力均顯著降低。說明ChEP085基因與希金斯炭疽菌的產(chǎn)孢能力和致病力密切相關(guān)。綜上，效應(yīng)子ChEP085在希金斯炭疽菌體內(nèi)可能參與希金斯炭疽菌產(chǎn)孢的調(diào)控；在希金斯炭疽菌侵染過程中，ChEP085可能在活體營養(yǎng)階段被大量分泌，定殖于寄主植物的細(xì)胞膜上，并抑制寄主植物的免疫反應(yīng)，幫助病原菌侵入寄主植物。