張 輝，王 良，付增娟，李曉東，趙尚敏，鄂圓圓，鄭文哲，張自強(qiáng)，張必周，張惠忠

(內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010031)

甜菜是2年生常異花作物，是重要的蔗糖榨取原料。2年生作物的生育周期較長(zhǎng)，制約了育種工作的進(jìn)程。目前，國(guó)內(nèi)生產(chǎn)上使用的甜菜品種幾乎都是單粒雜交種，而單粒雜交種的制備離不開(kāi)優(yōu)質(zhì)單粒不育系的選育工作，需要對(duì)花期授粉雜交進(jìn)行完整有效的控制。但是甜菜的花非常小，并且屬于無(wú)限花序，不利于人工去雄工作。因此，細(xì)胞質(zhì)雄性不育(CMS)的利用為甜菜雜交種的發(fā)展提供了一種快捷高效的途徑[1]。Owen[2]提出了歐文假說(shuō)，根據(jù)歐文假說(shuō)的理論，質(zhì)核互作型甜菜的不育性狀是由細(xì)胞質(zhì)基因(S)和細(xì)胞核基因(xxzz)共同控制的。質(zhì)核互作型單粒不育系的保持必須是由單粒保持系(基因型為Nxzxz，N為細(xì)胞質(zhì)可育基因)與其對(duì)應(yīng)的不育系(基因型為Sxzxz，S為細(xì)胞質(zhì)不育基因)雜交成對(duì)保持。Matsuhira等[3]研究發(fā)現(xiàn)，x基因位于Ⅲ號(hào)染色體上，并克隆了x的1個(gè)等位基因Rf1，其基因產(chǎn)物是類似于酵母線粒體蛋白質(zhì)量控制的OMA1蛋白。Suketomo等[4]研究發(fā)現(xiàn)，在中國(guó)水稻野生型細(xì)胞質(zhì)雄性不育系中，線粒體增強(qiáng)核基因逆向調(diào)控雄性不育的表達(dá)，導(dǎo)致花粉敗育。當(dāng)恢復(fù)系的表達(dá)減少時(shí)，育性恢復(fù)。PPR2基因編碼含有五肽重復(fù)域的蛋白質(zhì)，不負(fù)責(zé)育性恢復(fù)，而育性是通過(guò)降低逆向調(diào)控雄性不育的表達(dá)來(lái)恢復(fù)。Arakawa等[5]研究發(fā)現(xiàn)，甜菜育性相關(guān)的基因rf1與育性恢復(fù)的等位基因極為相近，但是它是一個(gè)非恢復(fù)等位基因，對(duì)其他育性基因存在協(xié)同作用。

在甜菜育種工作中，不育系的利用能大大提高雜交育種的效率。通常在花期進(jìn)行粒性和育性調(diào)查進(jìn)而對(duì)保持系和不育系材料進(jìn)行有效選擇。但在調(diào)查過(guò)程中難免存在漏查和誤查，從而導(dǎo)致后代選擇的材料出現(xiàn)不純的現(xiàn)象。Nishizawa等[6]研究發(fā)現(xiàn)，在甜菜線粒體基因組有4個(gè)不相關(guān)的串聯(lián)重復(fù)位點(diǎn)，并發(fā)現(xiàn)TR1位點(diǎn)插在重組重復(fù)序列(rrn26)。TR1由32 bp的串聯(lián)重復(fù)片段組成，在7個(gè)基因型的甜菜中被檢測(cè)出存在2～13個(gè)不同的重復(fù)數(shù)，開(kāi)發(fā)出了TR1、TR2、TR3和TR4引物。Cheng等[7]利用VNTR分子標(biāo)記的方法對(duì)42個(gè)中國(guó)甜菜育種系正常和雄性不育型細(xì)胞質(zhì)進(jìn)行了鑒定分析，發(fā)現(xiàn)在所檢測(cè)的42個(gè)育種系中，14個(gè)具有完全正常的細(xì)胞質(zhì)，11個(gè)只有歐文細(xì)胞質(zhì)，其余17個(gè)同時(shí)包括正常和歐文細(xì)胞質(zhì)。Cheng等[8]利用4種線粒體微型衛(wèi)星技術(shù)研究了葉用和觀賞甜菜種質(zhì)資源的多樣性，鑒定了11個(gè)多位點(diǎn)單倍型，對(duì)不同類型的細(xì)胞質(zhì)進(jìn)行了梳理分類。分子鑒定技術(shù)可以在苗期進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室鑒定工作，為育種工作者提供較準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)支撐和參考。

本研究將TR1鑒定引物應(yīng)用于2年生甜菜保持系和不育系胞質(zhì)類型鑒選中，旨在為加快甜菜不育系選育、縮短育種進(jìn)程提供理論指導(dǎo)和技術(shù)支持。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

甜菜保持系材料為960767，不育系材料為N9849，其他待鑒定的試驗(yàn)材料28份，均為內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院自育或引進(jìn)材料。其中保持系960767和不育系N9849已經(jīng)過(guò)多年田間調(diào)查驗(yàn)證并經(jīng)過(guò)分子鑒定應(yīng)用[9]，為已成型穩(wěn)定的成對(duì)保持系和不育系材料。其他鑒定材料為經(jīng)過(guò)田間性狀調(diào)查待鑒定胞質(zhì)類型的材料，具體材料名稱見(jiàn)表1。

表1 試驗(yàn)材料名稱Tab.1 Test materials names

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 取樣 在試驗(yàn)材料苗期取甜菜植株中心的新鮮幼嫩葉片2～3片，稱0.8～1.2 g。

1.2.2 葉片的粉碎 將取樣后的新鮮嫩葉置于超低溫冷凍干燥機(jī)凍干48 h，干燥后的樣品分裝置于2 mL的離心管中，然后裝入鋼珠，用高通量破碎機(jī)將葉片打碎成粉末狀，之后即可用于DNA的提取。凍干后的葉片可以在干燥的環(huán)境下長(zhǎng)期保存。

1.2.3 DNA的提取 選用新型植物基因組DNA提取試劑盒(天根)，對(duì)已經(jīng)進(jìn)行破碎處理的葉片進(jìn)行DNA提取，操作按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.2.4 DNA的檢測(cè) 將提取后的DNA樣品5 μL與6×Loading Buffer緩沖液1 μL預(yù)混后點(diǎn)樣5 μL，使用1%的瓊脂糖凝膠在1×TAE的電泳緩沖液中進(jìn)行電泳，電泳條件為120 V，30 min 左右。用凝膠成像系統(tǒng)紫外光檢測(cè)電泳結(jié)果。

1.2.5 PCR擴(kuò)增 引物：可變數(shù)量的串聯(lián)重復(fù)TR1引物，序列為：5′-AGAACTTCGATAGGCGAGAGG-3′，5′-GCAATTTTCAGGGCATGAACC-3′[10]。PCR反應(yīng)體系為15 μL：包括 7.5 μL 2×Taq Master Mix，1 μL上游引物(0.5 μmol/L)，1 μL下游引物(0.5 μmol/L)，3 μL DNA(0.3 ng/μL)，2.5 μL ddH2O。PCR 反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性 30 s，55 ℃ 退火30 s，72 ℃延伸1 min，循環(huán)35 次；72 ℃延伸 10 min，4 ℃保存。

1.2.6 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè) 將PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物點(diǎn)樣5 μL，使用 1%瓊脂糖凝膠1×TAE的電泳緩沖液進(jìn)行電泳，在 120 V 電壓下電泳 30 min 左右，凝膠成像儀照相保存圖片。

1.2.7 田間育性性狀調(diào)查 在甜菜開(kāi)花始期(種株開(kāi)花達(dá)到 15%)進(jìn)行田間性狀調(diào)查，調(diào)查內(nèi)容為甜菜花藥的發(fā)育狀況、花粉粒的特征和散粉的能力。2年生甜菜育性類型分為 5 類：全不育型、半不育一型、半不育二型、半可育型、可育型[11]。具體性狀類型見(jiàn)參考文獻(xiàn)[12]。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA提取和檢測(cè)

選用新型植物基因組DNA提取試劑盒(天根)對(duì)樣品進(jìn)行全基因組DNA的提取，1%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行檢測(cè)，點(diǎn)樣孔上樣量為5 μL，經(jīng)檢測(cè)提取的DNA濃度可以用來(lái)進(jìn)行PCR檢測(cè)，DNA檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖1 。

1—28.除去960767和N9849的其他試驗(yàn)材料的電泳檢測(cè)結(jié)果。1—28.The electrophoresis detection results of the other test materials excluding 960767 and N9849.

2.2 細(xì)胞質(zhì)育性分子標(biāo)記鑒定

試驗(yàn)總共檢測(cè)了30個(gè)試驗(yàn)材料的787個(gè)植株樣品，共檢測(cè)出598份結(jié)果。在這598份材料中共檢測(cè)出750 bp條帶的細(xì)胞質(zhì)類型116份，材料分別為960767、T152、T328、T334、T306、T360；檢測(cè)出500 bp條帶的細(xì)胞質(zhì)類型300份，材料分別為N9849、T766、T154、N122、I-1、B-3、Z-1、41419、10320、B-3-23、S865、S301、S151、S327、S333、S115、S305、S153、S359、S137、S163和S313；檢測(cè)出大于500 bp小于750 bp條帶的細(xì)胞質(zhì)類型84份，材料分別為T302、T116；同時(shí)含有500，750 bp的細(xì)胞質(zhì)類型9份，材料分別為T302、I-1和B-3的不同植株。970767和N9849為多年田間選育鑒定的試驗(yàn)材料，田間性狀表現(xiàn)為可育型和全不育型，為成對(duì)穩(wěn)定的保持系和不育系，經(jīng)TR1引物分子標(biāo)記鑒定檢測(cè)后，960767和N9849檢測(cè)到的條帶分別為750，500 bp，即750 bp條帶為N1型細(xì)胞質(zhì)，500 bp條帶為S型細(xì)胞質(zhì)(圖2)。圖3顯示了部分材料經(jīng)TR1引物PCR擴(kuò)增后的檢測(cè)結(jié)果，檢測(cè)材料分別為T334、S333、S115、T116、T302、S301、960767、I-1、B-3、Z-1、41419、10320、B-3-23。這些材料中只有960767和T334為N1型細(xì)胞質(zhì)，而T302和T116為特異性類型，其經(jīng)過(guò)PCR檢測(cè)后條帶位置為500～750 bp(圖3)。將T302、T116、S301和S115再次取樣經(jīng)TR1引物檢測(cè)(圖4)，驗(yàn)證后確定T302和T116檢測(cè)后的條帶位置為500～750 bp。結(jié)合連續(xù)幾年的田間調(diào)查情況可知,T302和S301分別為可育型和全不育型材料，并且T302對(duì)S301具有不育性狀的保持能力，因此，T302、T116類型屬于另外一種N2型細(xì)胞質(zhì)，其微衛(wèi)星串聯(lián)重復(fù)序列重復(fù)數(shù)為9，而N1類型細(xì)胞質(zhì)微衛(wèi)星串聯(lián)重復(fù)序列為18。同時(shí)含有500，750 bp條帶的T302、I-1和B-3部分植株為同時(shí)包括正常和歐文細(xì)胞質(zhì)的材料，屬于特質(zhì)性材料[5，7]。圖5，6分別為部分田間調(diào)查性狀為可育和不育型材料經(jīng)TR1引物PCR擴(kuò)增后的檢測(cè)結(jié)果。圖5中T766存在一植株檢測(cè)條帶與其他不一致，為N1胞質(zhì)類型，可能由于選擇過(guò)程中不同株系材料本身存在差異或存在雜株現(xiàn)象。將所有檢測(cè)材料按照條帶位置的不同進(jìn)行胞質(zhì)類型分類，具體結(jié)果見(jiàn)表2。

1—8.保持系材料960767不同植株的TR1引物檢測(cè)結(jié)果；9—17.不育系材料N9849不同植株的TR1引物檢測(cè)結(jié)果。1—8.The TR1 primer test results of different plants of maintainer material 960767；9—17.The TR1 primer test results of different plants of sterile line material N9849.

1.T334；2.S333；4，5.S115；3，6.T116；8，10.T302；7，9.S301；11，12.960767；13—15.I-1；16—18.B-3；19—21.Z-1；22—24.41419；25—26.10320；27—28.B-3-23。

1—5.不育型材料S301不同植株樣品檢測(cè)；6—10.不育型材料S115不同植株樣品檢測(cè)；11—15.N2型細(xì)胞質(zhì)材料T302不同植株樣品檢測(cè)；16—20.N2型細(xì)胞質(zhì)材料T116不同植株樣品檢測(cè)。1—5.Detection of different plants of sterility material S301；6—10.Detection of different plants of sterile material S115；11—15.Detection of different plants of N2 cytoplasmic materials T302；16—20.Detection of different plants of N2 cytoplasmic materials T116.

1—6.960767不同植株檢測(cè)；7—13.T152不同植株檢測(cè)；14—20.T328不同植株檢測(cè)；21—27.T334不同植株檢測(cè)；28—31.T306不同植株檢測(cè)；32—35.T360不同植株檢測(cè)；36—40.T302不同植株檢測(cè)；41—44.T116不同植株檢測(cè)；45—48.T766不同植株檢測(cè)；49—54.N122不同植株檢測(cè)。

1—2.S865不同植株檢測(cè)；3—4.S301不同植株檢測(cè)；5—6.S151不同植株檢測(cè)；7—8.S327不同植株檢測(cè)；9—10.S333不同植株檢測(cè)；11—12.S115不同植株檢測(cè)；13—14.S305不同植株檢測(cè)；15—16.S315不同植株檢測(cè)；17—18.S359不同植株檢測(cè)；19—20.S137不同植株檢測(cè)；21—22.S163不同植株檢測(cè)；23—24.S313不同植株檢測(cè)。

表2 不同試驗(yàn)材料經(jīng)TR1引物擴(kuò)增鑒定及田間育性調(diào)查Tab.2 Identification of amplification and field breeding investigation by TR1 primers of different test materials

2.3 田間育性性狀調(diào)查

根據(jù)花粉育性調(diào)查標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行田間育性性狀調(diào)查可知，30份試驗(yàn)材料共計(jì)調(diào)查了787個(gè)植株樣品，其中可根據(jù)調(diào)查結(jié)果將試驗(yàn)材料分為以下幾類：可育型包括960767、T766、T302、T152、T328、T334、T116、T360、N122、I-1、B-3、Z-1、41419、10320、B-3-23，這些材料均存在大量花粉并進(jìn)行開(kāi)裂；半可育型，包括T306、T154，這些材料含有無(wú)受精能力的花粉粒及少量正常的花粉粒；全不育型，包括N9849、S301、S151、S327、S333、S359、S313，這些材料無(wú)花粉，或含少數(shù)小孢子退化的花粉粒，花粉不開(kāi)裂；半不育一型，包括S305，其具有退化的小孢子或較之略發(fā)達(dá)的花粉粒，但不開(kāi)裂；半不育二型，包括S865、S115、S153、S137、S163，這些材料有花粉膜，可見(jiàn)花粉孔，含多個(gè)花粉粒，但無(wú)受精能力，花藥幾乎不開(kāi)裂。田間調(diào)查結(jié)果對(duì)應(yīng)分子鑒定結(jié)果T766、T154、N122、I-1、B-3、Z-1、41419、10320、B-3-23均為可育型，但鑒定其胞質(zhì)類型屬于S型細(xì)胞質(zhì)，根據(jù)歐文理論，這些材料的細(xì)胞核基因應(yīng)該含有可育基因x，因此，這些材料在具體應(yīng)用時(shí)不建議選作保持系材料。而S865、S115、S305、S153、S137、S163屬于S型細(xì)胞質(zhì)，但花粉顏色呈淡黃和橙色，在選育過(guò)程中建議再進(jìn)行隔離套袋純化，待選擇較純后再用于不育系的選擇。

3 結(jié)論與討論

甜菜在選育過(guò)程中育性恢復(fù)基因是一個(gè)非常復(fù)雜的性狀，這個(gè)復(fù)雜性可能是由于遺傳基因的主效和微效因子Rfs，在這個(gè)過(guò)程中還有環(huán)境因素的影響。Tourmente等[13]發(fā)現(xiàn)，可變數(shù)目的串聯(lián)重復(fù)序列(VNTRs)在真核生物基因組中豐富且普遍存在。這些序列與多個(gè)基因座雜交，并且本質(zhì)上是高變的，因此被證明對(duì)遺傳分析具有高度的信息性。Buard等[14]發(fā)現(xiàn)，串聯(lián)重復(fù)序列通常分為微衛(wèi)星序列(重復(fù)單元的長(zhǎng)度為5 bp或更短)和微型衛(wèi)星序列(重復(fù)單元的長(zhǎng)度5～100 bp)。盡管微衛(wèi)星和微型衛(wèi)星有相似的結(jié)構(gòu)特征，但它們似乎在幾個(gè)方面不同。例如，微衛(wèi)星起源的密切聯(lián)系并且與DNA復(fù)制或錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)中的缺陷相關(guān)的變異是明顯的[15-16]。而同源重組過(guò)程，包括基因轉(zhuǎn)換和重復(fù)之間的不平等交換，被認(rèn)為有微衛(wèi)星參與[17-21]。植物線粒體基因組的一個(gè)基本標(biāo)志是其跨重復(fù)序列重組的傾向。所有測(cè)序的重組重復(fù)序列都沒(méi)有序列基序，這表明重組是通過(guò)同源機(jī)制而不是位點(diǎn)特異性機(jī)制發(fā)生的。這增加了植物線粒體基因組也可能包含類似小衛(wèi)星VNTRs的可能性。

甜菜線粒體基因組的可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列(VNTRs)已被證明提供了一種快速和復(fù)雜的方法來(lái)區(qū)分正常細(xì)胞質(zhì)和雄性不育細(xì)胞質(zhì)的不同來(lái)源[5，10，22]。本研究利用其開(kāi)發(fā)的TR1引物對(duì)國(guó)內(nèi)部分品系材料進(jìn)行細(xì)胞質(zhì)鑒定，以成型的成對(duì)保持系和不育系材料作為對(duì)照，初步摸清了被檢測(cè)材料的細(xì)胞質(zhì)類型。檢測(cè)到30份材料中T766、T154、N122、I-1、B-3、Z-1、41419、10320、B-3-23為與選育方向不一致的材料，均為可育型，但屬于S型細(xì)胞質(zhì)，根據(jù)歐文理論，這些材料的細(xì)胞核基因應(yīng)該含有顯性可育基因x，需要根據(jù)育種要求進(jìn)行調(diào)整。T302和T116為具有不育系保持能力的另外一種細(xì)胞質(zhì)類型，被認(rèn)定為N2型細(xì)胞質(zhì)類型。由于N2型細(xì)胞質(zhì)和S型細(xì)胞質(zhì)在條帶上差異較小，在今后的選育過(guò)程中，應(yīng)該結(jié)合串聯(lián)重復(fù)序列的重復(fù)數(shù)檢測(cè)進(jìn)行鑒別，為今后的不育系選育提供技術(shù)指導(dǎo)和參考。在檢測(cè)中還有部分材料檢測(cè)到不同植株間存在差異，或者兼有2種條帶類型，推測(cè)應(yīng)該是在試驗(yàn)中存在收獲混雜及樣品污染等情況。雖然該項(xiàng)技術(shù)不能涵蓋所有的甜菜類型，但在結(jié)合田間選育后能做出較為準(zhǔn)確的判斷。眾多的科研人員從事育性基因相關(guān)的機(jī)理研究[23-25]，相信未來(lái)細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核特異性引物的有效結(jié)合應(yīng)用將更有效地推進(jìn)分子輔助選擇在甜菜育種中的應(yīng)用。