林 旭，丁李春，李志剛

（寧德市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，福建 福安 355017）

暗褐網(wǎng)柄牛肝菌（Phlebopus portentosus），隸屬小牛肝菌科（Boletinellaceae） 脈柄牛肝菌屬（Phlebopus）[1]。該品種主要分布在我國(guó)云南省，被當(dāng)?shù)厝怂追Q為“黑牛肝菌”[2]。其子實(shí)體營(yíng)養(yǎng)豐富，富含蛋白質(zhì)、多種氨基酸及鉀、鈣、鐵、鋅、錳等人體所需的礦質(zhì)元素[3-4]。脂肪、總糖、粗纖維、多種礦質(zhì)元素和氨基酸，兼具食藥性質(zhì)，可起到降血脂、抗氧化等作用，對(duì)高血脂等疾病有較好的功效[5]。

松針是松屬植物的主要藥用部位，富含活性成分，多種氨基酸、維生素等[6]，具有較高的保健價(jià)值。目前國(guó)外松針主要用于畜牧飼料研發(fā)，在我國(guó)松針主要應(yīng)用于藥用、食用，如松針茶、松針?lè)鄣萚7-8]。福建是松樹(shù)的主要分布范圍之一，在食用菌栽培研究方面已有松木屑在繡球菌生產(chǎn)中的應(yīng)用[9-10]，但在牛肝菌生產(chǎn)中的應(yīng)用未見(jiàn)報(bào)道。

因此，通過(guò)在暗褐網(wǎng)柄牛肝菌母種培養(yǎng)基中添加松針浸出物，通過(guò)單因素試驗(yàn)觀測(cè)菌絲生長(zhǎng)狀態(tài)及生長(zhǎng)速率，初步確定適宜的添加量。再與其他添加物（馬鈴薯、葡萄糖、蛋白胨等）通過(guò)L9（34）正交試驗(yàn)確定最優(yōu)暗褐網(wǎng)柄牛肝菌母種培養(yǎng)基配方，以期為后續(xù)暗褐網(wǎng)柄牛肝菌的菌種培養(yǎng)及活性成分鑒定、提取提供研究基礎(chǔ)。

1 試驗(yàn)材料與方法

1.1 供試材料

暗褐網(wǎng)柄牛肝菌母種，為云南野生暗褐網(wǎng)柄牛肝菌子實(shí)體，2019年分離培養(yǎng)獲得。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 基礎(chǔ)母種培養(yǎng)基配制

去皮馬鈴薯200 g，水1 L，100℃下煮沸20 min后過(guò)濾。馬鈴薯濾液定容至1 L，加入葡萄糖20 g，瓊脂16 g，蛋白胨1 g，121℃高溫滅菌20 min。

1.2.2 松針添加量單因素試驗(yàn)

松針加水煮沸20 min，過(guò)濾后與200 g·L-1馬鈴薯濾汁混合，加入基礎(chǔ)母種培養(yǎng)基中，配制成松針浸出液。濃度分別為 10 g·L-1、25 g·L-1、50 g·L-1、100 g·L-1的松針母種培養(yǎng)基，121℃高溫滅菌20min。以基礎(chǔ)母種培養(yǎng)基作為對(duì)照，探究不同濃度松針添加量對(duì)暗褐網(wǎng)柄牛肝菌菌絲生長(zhǎng)情況的影響。

1.2.3 接種培養(yǎng)

將暗褐網(wǎng)柄牛肝菌菌塊（5 mm） 接種于試驗(yàn)培養(yǎng)基上，置于27℃恒溫黑暗條件下培養(yǎng)，每天觀察菌絲生長(zhǎng)勢(shì)、菌絲顏色，利用“十”字交叉法統(tǒng)計(jì)菌絲生長(zhǎng)速率等指標(biāo)，每個(gè)處理5個(gè)重復(fù)。

1.2.4 正交試驗(yàn)確定最適培養(yǎng)基配方

在松針添加量的單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，通過(guò)L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，因素水平見(jiàn)下表1。

表1 正交試驗(yàn)因素及水平L9(34)Tab.1 Orthogonal test factors and levels L9(34)

如表1所示，以菌絲生長(zhǎng)勢(shì)、菌絲先端整齊度、菌絲生長(zhǎng)速度等作為試驗(yàn)指標(biāo)，利用正交試驗(yàn)確定松針浸出液及其他添加物馬鈴薯、葡萄糖、蛋白胨的最佳配比添加量，優(yōu)化確定最佳培養(yǎng)基配方。

1.2.5 試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理和分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel、SPSS 20.0進(jìn)行分析處理。將菌絲生長(zhǎng)勢(shì)和菌絲邊緣整齊度指標(biāo)折算成數(shù)字（＋代表1，-代表0），每個(gè)處理5個(gè)重復(fù)，統(tǒng)計(jì)后進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果分析

2.1 松針浸出液濃度單因素試驗(yàn)

不同松針浸出液對(duì)暗褐網(wǎng)柄牛肝菌母種菌絲生長(zhǎng)的影響試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 不同濃度松針浸出液對(duì)暗褐網(wǎng)柄牛肝菌母種生長(zhǎng)情況的影響Tab.2 Effects of different concentrations of pine needle extract on the growth of Phlebopus portentosus stock culture

由表2可知，不同濃度松針浸出液對(duì)暗褐網(wǎng)柄牛肝菌菌絲生長(zhǎng)的影響存在一定差異，隨著松針浸出液的添加量的增加，暗褐網(wǎng)柄牛肝菌的菌絲生長(zhǎng)速度呈現(xiàn)先增后降的趨勢(shì)。在松針浸出液濃度為25 g·L-1時(shí)，菌絲生長(zhǎng)速度最快，達(dá)到2.56 mm·d-1，菌絲生長(zhǎng)勢(shì)旺盛，菌絲顏色為黃色。當(dāng)松針浸出液濃度達(dá)到100 g·L-1時(shí)，菌絲生長(zhǎng)速度明顯降低。

2.2 母種配方優(yōu)化正交試驗(yàn)

正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果Tab.3 Orthogonal test results

由表3菌絲生長(zhǎng)速率各因素的極差R可知，影響菌絲生長(zhǎng)速率的主次因素分別為D＞C＞B＞A，即馬鈴薯＞葡萄糖＞松針浸出液＞蛋白胨。最優(yōu)方案為A2B1C1D3，即馬鈴薯添加量100 g·L-1，葡萄糖添加量 1 g·L-1，松針浸出液 25 g·L-1，蛋白胨添加量 2 g·L-1。

由表3菌絲生長(zhǎng)勢(shì)各因素的極差R可知，影響菌絲生長(zhǎng)勢(shì)的主次因素分別為C＞D＞B＞A，即葡萄糖＞馬鈴薯＞松針浸出液＞蛋白胨。最優(yōu)方案為A3B2C1D2，即馬鈴薯添加量200 g·L-1，葡萄糖添加量1 g·L-1，松針浸出液 50 g·L-1，蛋白胨添加量 3 g·L-1。

由表3菌絲顏色試驗(yàn)結(jié)果可知，菌絲顏色與蛋白胨添加量存在一定的相關(guān)性。在一定范圍內(nèi)，蛋白胨添加量越大，菌絲顏色越黃。

2.3 方差分析

各因素對(duì)菌絲生長(zhǎng)速率的影響方差分析見(jiàn)表4。

表4 菌絲生長(zhǎng)速率單因素方差分析Tab.4 One way ANOVA of mycelial growth rate

由表4可知，葡萄糖、馬鈴薯2個(gè)因素對(duì)菌絲生長(zhǎng)速率的影響是極顯著的（顯著性＜0.01），松針浸出液對(duì)菌絲生長(zhǎng)速率影響顯著（顯著性＜0.05），蛋白胨的影響不顯著（顯著性＞0.05）。

各因素對(duì)菌絲生長(zhǎng)勢(shì)的影響方差分析見(jiàn)表5。

由表5可知，葡萄糖、馬鈴薯兩個(gè)因素對(duì)菌絲生長(zhǎng)勢(shì)的影響是極顯著的（顯著性＜0.01），松針浸出液添加量對(duì)菌絲生長(zhǎng)勢(shì)的影響顯著（顯著性＜0.05），蛋白胨對(duì)菌絲生長(zhǎng)勢(shì)的影響不顯著（顯著性＞0.05），方差顯著性分析結(jié)果與菌絲生長(zhǎng)勢(shì)單因素方差分析結(jié)果相同。

表5 菌絲生長(zhǎng)勢(shì)單因素方差分析Tab.5 One way ANOVA of mycelial growth potential

各因素對(duì)菌絲邊緣整齊度和菌絲顏色的影響方差分析見(jiàn)表6。

表6 菌絲邊緣整齊度單因素方差分析Tab.6 One way ANOVA of mycelial edge uniformity

由表6可知，葡萄糖和松針浸出液對(duì)菌絲邊緣整齊度存在極顯著影響（顯著性＜0.01），蛋白胨和馬鈴薯濾汁對(duì)菌絲邊緣整齊度影響不顯著。

2.4 母種最佳培養(yǎng)基的確定及驗(yàn)證

對(duì)于菌絲生長(zhǎng)速率，因素D（馬鈴薯）的影響最大，D3為最優(yōu)值，對(duì)于菌絲生長(zhǎng)勢(shì)則D2最優(yōu)。根據(jù)菌絲生長(zhǎng)勢(shì)因素D的K分析，D2（9.8） 與D3（9.6） 差異不明顯，將D2和D3經(jīng)過(guò)單因素方差分析驗(yàn)證，得到二者顯著性為0.793（＞0.050），即菌絲生長(zhǎng)勢(shì)D2與D3差異不顯著。綜合因素D對(duì)菌絲生長(zhǎng)速率和菌絲生長(zhǎng)勢(shì)的影響，因素D的最優(yōu)方案確定為D3。因素C（葡萄糖）在菌絲生長(zhǎng)速率和菌絲生長(zhǎng)勢(shì)指標(biāo)中的最優(yōu)方案都為C1。因素B（松針浸出液），在菌絲生長(zhǎng)勢(shì)指標(biāo)中，B2最優(yōu)，但同時(shí)考慮到K1與K2差異較小，經(jīng)過(guò)單因素方差分析驗(yàn)證B1和B2差異不顯著（顯著性=0.601），故按照菌絲生長(zhǎng)速率的最優(yōu)方案確定B1為最優(yōu)值。由上表4、5可知蛋白胨對(duì)菌絲生長(zhǎng)速率和菌絲生長(zhǎng)勢(shì)影響不顯著，故蛋白胨可選擇生長(zhǎng)速率最優(yōu)方案A2，最終確定最優(yōu)方案為A2B1C1D3。

按照A2B1C1D3配置母種培養(yǎng)基，選擇基礎(chǔ)培養(yǎng)基和PDA培養(yǎng)基作為對(duì)照，結(jié)果見(jiàn)表7。

表7 驗(yàn)證試驗(yàn)Tab.7 Validation test

由表7可知，使用配方A2B1C1D3，菌絲生長(zhǎng)速率達(dá)到3.41 mm·d-1，菌絲顏色黃色，生長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)，故確定A2B1C1D3為暗褐網(wǎng)柄牛肝菌母種培養(yǎng)基最優(yōu)方案。

3 小結(jié)與討論

暗褐網(wǎng)柄牛肝菌母種生物學(xué)特性[11]、碳源、氮源添加量[12]試驗(yàn)等，前人已有開(kāi)展。在前人研究基礎(chǔ)上，結(jié)合本地區(qū)松針資源的應(yīng)用，通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)結(jié)合，進(jìn)一步優(yōu)化暗褐網(wǎng)柄牛肝菌母種的最優(yōu)配方。

試驗(yàn)結(jié)果顯示，在一定濃度范圍內(nèi)，母種培養(yǎng)基中適當(dāng)添加松針浸出液，暗褐網(wǎng)柄牛肝菌菌絲生長(zhǎng)速度顯著提高，菌絲生長(zhǎng)勢(shì)較旺，在松針浸出液濃度達(dá)到25 g·L-1時(shí)，菌絲生長(zhǎng)速度和生長(zhǎng)勢(shì)均表現(xiàn)較優(yōu)。

通過(guò)L9（34）正交試驗(yàn)優(yōu)化篩選出最佳培養(yǎng)基為馬鈴薯添加量100 g·L-1，葡萄糖添加量10 g·L-1，松針浸出液25 g·L-1，蛋白胨添加量2 g·L-1。通過(guò)進(jìn)一步的驗(yàn)證試驗(yàn)，確定此方案為本次試驗(yàn)的最佳方案。該配方培養(yǎng)下，菌絲生長(zhǎng)速率較快，菌絲生長(zhǎng)勢(shì)旺盛。

通過(guò)重點(diǎn)研究松針浸出液對(duì)暗褐網(wǎng)柄牛肝菌菌絲生長(zhǎng)情況的影響，并對(duì)其作為添加物的培養(yǎng)基進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化，以期為今后松針浸出液在牛肝菌培養(yǎng)中的應(yīng)用，及活性物質(zhì)的進(jìn)一步利用提供基礎(chǔ)。