汪巧菊 胡雨萌 溫亞亞 宋麗 孟闖 潘志明 焦新安

（揚(yáng)州大學(xué)/江蘇省人獸共患病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/江蘇省動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全生物性危害因子（動(dòng)物源）控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/教育部農(nóng)業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品安全國際合作聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，揚(yáng)州 225009）

2019年底，由新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）引起的新型冠狀病毒肺炎（COVID-19）已在全球流行，嚴(yán)重威脅著經(jīng)濟(jì)發(fā)展和人類生命健康［1］。SARSCoV-2是β-冠狀病毒屬的一種正鏈RNA病毒，基因組全長約為30 kb，其結(jié)構(gòu)蛋白編碼區(qū)主要是編碼4種結(jié)構(gòu)蛋白，包括刺突蛋白（spike，S），膜蛋白（membrane，M），包膜蛋白（envelope，E）和核衣殼蛋白（nucleocapsid，N）［2-3］。其中，S蛋白負(fù)責(zé)識(shí)別并結(jié)合細(xì)胞表面受體，誘導(dǎo)膜融合，是病毒侵入細(xì)胞的關(guān)鍵蛋白［4］。S蛋白包括兩個(gè)功能亞基，即負(fù)責(zé)病毒與宿主細(xì)胞受體結(jié)合的S1亞基和介導(dǎo)病毒與細(xì)胞膜融合的S2亞基［5-6］。S1亞基含能直接結(jié)合受體的RBD序列，其在檢測(cè)抗SARS-CoV-2的敏感性和特異性方面分別優(yōu)于受體結(jié)合域（RBD）和天然的三聚體S蛋白［7］。因此，S1蛋白在疾病診斷、藥物及疫苗研發(fā)方面具有重要價(jià)值。

目前，已有研究表明利用大腸桿菌、哺乳動(dòng)物細(xì)胞及桿狀病毒-昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)可以成功獲得冠狀病毒的RBD蛋白、N蛋白及S1蛋白等［8-12］。相比于真核表達(dá)系統(tǒng)，大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)具有操作方便、研究周期短、易于純化、表達(dá)量高等特點(diǎn)，且對(duì)于蛋白質(zhì)的分析和表達(dá)的干擾很少，是工業(yè)生產(chǎn)中比較理想的表達(dá)方式［13-14］，但目前有關(guān)SARSCoV-2 S1蛋白原核表達(dá)的報(bào)道較少。

因此，本研究構(gòu)建了含SARS-CoV-2 S1基因的重組質(zhì)粒，利用冷休克載體pCold I 進(jìn)行蛋白的原核表達(dá)，并使用Ni2+親和層析柱純化從而獲得高純度且免疫活性良好的可溶性表達(dá)的S1蛋白，為后續(xù)COVID-19的研究提供了生物材料。

1 材料與方法

1.1 材料

BL21（pCold I）菌株和RAW264.7細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存；大腸桿菌DH5α、BL21感受態(tài)細(xì)胞、高保真Taq酶、限制性核酸內(nèi)切酶、凝膠回收試劑盒和PrimeScript RT Reagent Kit購自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司；ClonExpress? Ultra One Step Cloning Kit、RNeasy Plus Mini Kit和 AceQ Universal SYBR qPCR Master Mix購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；Anti-S1多克隆抗體（貨號(hào)ab275759）購自英國Abcam公司；羊抗兔IgG-HRP購自美國GIBCO公司；His Bind Purification Kit購自德國Novagen公 司；ProteoSpinTMEndotoxin Removal Kit Maxi for protein & peptides購自加拿大Norgen公司。

1.2 方法

1.2.1 引物的設(shè)計(jì)與合成 參考NCBI的SARSCoV-2的S蛋 白 全 長 基 因 序 列（GenBank：NC_045512.2），經(jīng)過密碼子優(yōu)化后，由金斯瑞（南京）生物科技有限公司進(jìn)行合成，目的基因序列連入載體pUC57。

選取S1蛋白對(duì)應(yīng)的基因序列作為靶序列，并使用同源臂的方法設(shè)計(jì)引物，分別以Sac I和BamH I兩個(gè)限制內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn)設(shè)計(jì)上、下游引物，S1-F 為 ：5′- GAAGGTAGGCATATGGAGCTCGTTAATCTTACAACCAGAACTCAATTACC-3′；S1-R 為：5′-GACAAGCTTGAATTCGGATCCACGTGCCCGCCGAGGAGA -3′（斜體加粗部分為酶切位點(diǎn)），預(yù)期擴(kuò)增的目的片段大小為2 010 bp。

1.2.2 目的基因的擴(kuò)增與鑒定 S1蛋白靶基因序列的擴(kuò)增以pUC57-S為模板，以S1-F和S1-R為引物，反應(yīng)條件為：95℃，3 min；95℃，30 s，60℃，30 s；72℃，2 min，34個(gè)循環(huán)；72℃，10 min，4℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，使用凝膠回收試劑盒獲取目的基因。

1.2.3 重組質(zhì)粒pCold I-S1的構(gòu)建與鑒定 利用ClonExpress? Ultra One Step Cloning Kit進(jìn)行雙酶切后的pCold I載體（Sac I和BamH I）與S1基因的同源重組連接反應(yīng)，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布于羧芐青霉素抗性的LB固體培養(yǎng)基。次日，挑取單菌落，提取質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定，經(jīng)鑒定正確的重組質(zhì)粒pCold I-S1送擎科生物科技有限公司測(cè)序。

1.2.4 重組蛋白S1的表達(dá)與純化 將重組質(zhì)粒pCold I-S1轉(zhuǎn)化至BL21感受態(tài)細(xì)胞，將陽性克隆BL21（pCold I-S1）接種于5 mL羧芐青霉素抗性的LB液體培養(yǎng)基，180 r/min搖床37℃振蕩培養(yǎng)過夜；次日，以1∶50擴(kuò)大培養(yǎng)，180 r/min搖床37℃振蕩培養(yǎng)3 h；當(dāng)OD600=0.6-0.8時(shí)，冰浴30 min后，加入1 mmol/L IPTG，150 r/min搖床15℃振蕩培養(yǎng)24 h；收集菌體，超聲裂解后取上清液用His Bind Purification Kit進(jìn)行蛋白純化，最后以每管1 mL收集洗脫的目的蛋白。

1.2.5 Western blotting鑒定 將純化的S1蛋白在12%的聚丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行電泳；將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜后，封閉液（含5%脫脂奶的PBST）室溫封閉2 h；PBST洗滌3次后，使用兔源anti-S1（1∶1 000）多克隆抗體作為一抗，4℃搖床孵育過夜；PBST洗滌5次后，加入羊抗兔IgG-HRP（1∶5 000），室溫孵育1 h；PBST洗滌7次，使用ECL底物進(jìn)行顯色，并用Amersham Imager 600成像系統(tǒng)進(jìn)行圖片采集。

1.2.6 蛋白去內(nèi)毒素 將提取的S1蛋白按照ProteoSpinTMEndotoxin Removal Kit Maxi for protein &peptides說明書進(jìn)行去內(nèi)毒素，簡(jiǎn)述如下：取450 μL蛋白樣品，加入適量Binding Buffer J調(diào)整pH至3.5-4；加入500 μL的wash solution M至柱體，8 000 r/min離心1 min，以活化柱子；將蛋白和1%的Endotoxin Removal Solution加入活化柱中，混合后室溫靜置5 min；加入10%的異丙醇，混合后離心10 min；加入500 μL wash solution M離心1 min，以洗滌柱子；柱子干燥后，加入50 μL Elution Buffer G洗脫蛋白。使用鱟試劑（LAL）試劑盒檢測(cè)內(nèi)毒素含量，直至內(nèi)毒素含量最終濃度低于0.05 EU/μg。

1.2.7 體外刺激巨噬細(xì)胞 將小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7用完全DMEM培養(yǎng)基在37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)過夜（24孔板，2×105個(gè)/孔）；次日，用1 μg/mL的去內(nèi)毒素S1蛋白刺激細(xì)胞，5 h后收集細(xì)胞、提取RNA、進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)。

1.2.8 RNA提取及qRT-PCR檢測(cè)細(xì)胞因子和趨化因子 參照RNeasy Plus Mini Kit說明書方法提取小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7的總RNA，簡(jiǎn)述如下：每孔加入500 μL RL裂解液，渦旋振蕩30 s；加至去除gDNA離心柱中，12 000 r/min離心30 s，收集濾液；加入0.5倍體積的無水乙醇，混合后加至FastPure RNA Columns Ⅲ離心柱中離心30 s；依次加入700 μL Buffer RW1、700 μL Buffer RW2、500 μL Buffer RW2溶液，分別離心30 s、30 s、2 min；柱子干燥后，加入100 μL RNase-free H2O，以洗脫提取的細(xì)胞RNA。

參照PrimeScript RT Reagent Kit說明書方法將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA后，利用qRT-PCR檢測(cè)細(xì)胞因子和趨化因子的mRNA水平，反應(yīng)體系（20 μL）為：稀 釋 的 cDNA（40 ng），2×Universal SYBR qPCR Master（Rox），上游引物（10 μmol/L），下游引物（10 μmol/L），RNase-free H2O補(bǔ)足。將反應(yīng)混合液置于ABI 7500熒光定量PCR儀進(jìn)行基因擴(kuò)增，反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性 30 s；95℃，5 s；60℃，60 s，40個(gè)循環(huán)。以2—△△CT方法計(jì)算熒光值并以管家基因?yàn)閮?nèi)參計(jì)算相對(duì)表達(dá)量，qRT-PCR中使用的引物見表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

2 結(jié)果

2.1 目的基因S1的克隆與鑒定

以pUC57-S為模板，克隆目的基因S1，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果（圖1）顯示條帶大小為2 010 bp，與預(yù)期一致，表明目的基因擴(kuò)增成功。

圖1 S1基因PCR產(chǎn)物電泳分析Fig. 1 Electrophoresis analysis of S1 gene PCR product

2.2 重組質(zhì)粒pCold I-S1的構(gòu)建與鑒定

將擴(kuò)增基因S1與雙酶切后回收的載體pCold I進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入DH5α感受態(tài)細(xì)胞，以羧芐青霉素抗性篩選陽性克隆，提取質(zhì)粒并進(jìn)行PCR鑒定。電泳結(jié)果（圖2）顯示，目的條帶S1大小正確，重組質(zhì)粒pCold I-S1測(cè)序正確。

圖2 重組質(zhì)粒pCold I-S1的PCR鑒定Fig. 2 PCR identification of recombinant plasmid pCold I-S1

2.3 S1蛋白的表達(dá)

將重組質(zhì)粒pCold I-S1轉(zhuǎn)化至BL21感受態(tài)細(xì)胞，構(gòu)建重組菌BL21（pCold I-S1）。將陽性克隆接種于羧芐青霉素抗性的LB液體培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)至OD600= 0.6-0.8時(shí)，加入IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后進(jìn)行SDSPAGE分析。結(jié)果（圖3）顯示，在75 kD處有目的條帶，即含His標(biāo)簽的S1蛋白正確表達(dá)，且主要為包涵體表達(dá)，上清表達(dá)量相對(duì)較少。

圖3 S1蛋白的SDS-PAGE分析Fig. 3 SDS-PAGE analysis of S1 protein

2.4 S1蛋白的純化

將重組菌BL21（pCold I-S1）按照2.3的誘導(dǎo)培養(yǎng)條件進(jìn)行大量表達(dá)，超聲裂解菌體后取上清液使用Ni2+親和層析柱純化目的蛋白，并結(jié)合12% SDSPAGE電泳觀察分析。結(jié)果（圖4）顯示，目的蛋白分子量約為75 kD，有明顯條帶，與預(yù)期相符，即已獲得濃度、純度較高的可溶性表達(dá)的S1蛋白。

圖4 純化后S1蛋白的SDS-PAGE分析Fig. 4 SDS-PAGE analysis of purified S1 protein

2.5 S1蛋白的Western blotting鑒定

以兔源S1多克隆抗體進(jìn)行S1蛋白的Western blotting分析，結(jié)果（圖5）顯示，在75 kD處有一條明顯的特異性條帶，表明目的蛋白能與S1多克隆抗體發(fā)生強(qiáng)烈的反應(yīng)。

圖5 純化后S1蛋白的Western blotting鑒定Fig. 5 Western blotting identification of purified S1 protein

2.6 S1蛋白刺激小鼠巨噬細(xì)胞

將狀態(tài)良好的RAW264.7細(xì)胞鋪板過夜；次日，使用去內(nèi)毒素的S1蛋白刺激細(xì)胞，5 h后收集細(xì)胞，通過qRT-PCR檢測(cè)細(xì)胞因子（IL-1β和TNF-α）及趨化因子（MIP-2和IP-10）的mRNA水平，評(píng)價(jià)RAW264.7細(xì)胞的活化水平。結(jié)果（圖6）顯示，與未刺激組相比，S1蛋白能顯著提高細(xì)胞因子IL-1β（30.9 倍，P＜0.001）、TNF-α（2.6 倍，P＜0.05）和趨化因子MIP-2（32.18倍，P＜0.01）、IP-10（1.5倍，P＜0.05）的表達(dá)水平。

圖6 S1蛋白刺激RAW264.7細(xì)胞后的細(xì)胞因子及趨化因子表達(dá)水平Fig. 6 Expression levels of cytokines and chemokines in RAW264.7 cells stimulated by S1 protein

3 討論

SARS-CoV-2傳播性極強(qiáng)、容易變異，嚴(yán)重威脅著人類健康［15］，但是目前尚無針對(duì)該病毒的特效藥，因而針對(duì)其疫苗的研制和診斷技術(shù)的開發(fā)十分重要。

在SARS-CoV-2的4種結(jié)構(gòu)蛋白中，S蛋白具有較強(qiáng)的免疫原性，是基因組中變異最大的部分，與其他冠狀病毒序列的同源性比N蛋白低，特異性優(yōu)于N蛋白［12，16］。與同時(shí)使用S蛋白和RBD蛋白進(jìn)行免疫測(cè)定相比，單獨(dú)使用 S1抗原即可實(shí)現(xiàn)檢測(cè)COVID-19抗體的高靈敏度和特異性［7］，從而提高效率、降低成本。此外，S1蛋白作為抗原時(shí)，能比RBD蛋白誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生更高水平的中和抗體［17-18］。

目前已有商品化的SARS-CoV-2 S1蛋白，它們大多利用哺乳動(dòng)物細(xì)胞及桿狀病毒-昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)生產(chǎn)，但技術(shù)復(fù)雜、價(jià)格昂貴等缺點(diǎn)限制了其在大規(guī)模生產(chǎn)中的應(yīng)用［19］。與其他表達(dá)系統(tǒng)相比，大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)因其簡(jiǎn)單、快速及成本最低的優(yōu)勢(shì)，已經(jīng)成為廣泛用于表達(dá)外源蛋白的宿主［20］。已有研究表明，原核表達(dá)的SARS-CoV及SARS-CoV-2 S1蛋白能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生較高的免疫反應(yīng)［21-23］。但是，S1蛋白的可溶性表達(dá)并不理想，因此本研究選用能提高蛋白溶解度和穩(wěn)定性的pCold I原核表達(dá)載體［24］，在低溫下促進(jìn)目的蛋白的表達(dá)。本文構(gòu)建的BL21（pCold I-S1）重組菌經(jīng)大量誘導(dǎo)表達(dá)后，使用Ni2+柱親和層析純化細(xì)菌的裂解上清液，可得到濃度和純度較高的S1蛋白，且Western blotting結(jié)果表明，該蛋白能與商品化的S1多克隆抗體發(fā)生良好的反應(yīng)。

巨噬細(xì)胞是參與機(jī)體免疫應(yīng)答的主要細(xì)胞之一，它的活化是激發(fā)細(xì)胞因子介導(dǎo)產(chǎn)生的免疫病理的主要因素［25］。COVID-19患者血清中的促炎細(xì)胞因子（如IL-1β、TNF-α、IP-10和MCP-1等）明顯增加，可能導(dǎo)致Th1細(xì)胞反應(yīng)被激活［26-27］。在機(jī)體內(nèi)，IL-1β和TNF-α均具有較強(qiáng)的促炎活性，可誘導(dǎo)產(chǎn)生多種促炎介質(zhì)；MIP-2和IP-10可以招募活化的NK細(xì)胞、中性粒細(xì)胞及淋巴細(xì)胞，促進(jìn)多種細(xì)胞因子分泌；以上效應(yīng)相疊加，導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生廣泛而失調(diào)的炎癥反應(yīng)，進(jìn)而引起細(xì)胞因子風(fēng)暴［28］。已有報(bào)道指出，真核表達(dá)的SARS-CoV-2 S蛋白可以與ACE2相互作用從而誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞活化，表現(xiàn)為IL-6、MIP-1α和TNF-α等促炎細(xì)胞因子的表達(dá)量明顯上升［29］。以上結(jié)論與本研究結(jié)果相一致，即RAW264.7細(xì)胞在S1蛋白的刺激下，細(xì)胞因子（IL-1β和TNF-α）及趨化因子（MIP-2和IP-10）的表達(dá)水平均顯著上調(diào)，表明本研究中原核表達(dá)的S1蛋白有良好的免疫原性，具有應(yīng)用于COVID-19檢測(cè)方法及防控產(chǎn)品研究的潛力。

4 結(jié)論

本研究成功構(gòu)建了BL21（pCold I-S1）重組菌，經(jīng)原核表達(dá)系統(tǒng)獲得了純度較高的可溶性SARSCoV-2 S1蛋白。S1蛋白能與S1多克隆抗體發(fā)生良好的反應(yīng)，且能誘導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞上調(diào)表達(dá)多種細(xì)胞因子和趨化因子，具有良好的免疫原性。