王鳳琴，張來軍，李 聃

(1.隴東學(xué)院 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，甘肅 慶陽745000；2.海南熱帶海洋學(xué)院 水產(chǎn)與生命學(xué)院，海南 三亞 572022)

0 引言

蚯蚓是土壤中生物量最大的無脊椎動物，能夠分解轉(zhuǎn)化土壤中的有機(jī)物質(zhì)，改善土壤的結(jié)構(gòu)，富集重金屬、殺蟲劑等各種污染物?，F(xiàn)已被廣泛用于土壤環(huán)境的指示生物，進(jìn)行土壤污染研究和監(jiān)測工作。通過觀察蚯蚓行為，皮膚、細(xì)胞和組織解剖學(xué)結(jié)構(gòu)，檢測蚯蚓的生理生化反應(yīng)相關(guān)酶類的變化，全面了解和診斷土壤重金屬污染和各種有機(jī)污染[1-3]；通過研究蚯蚓腸道中的微生物群落組成，探知蚯蚓對某些污染物的富集和轉(zhuǎn)化，促進(jìn)土壤污染的修復(fù)[4]。蚯蚓細(xì)胞DNA損傷也是檢測污染物致癌、致畸、致突變效應(yīng)的理想生物標(biāo)志物，用于土壤污染遺傳毒性分析和環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測[5-6]。由于人工飼養(yǎng)蚯蚓的方法簡便，甚至可以進(jìn)行無菌培養(yǎng)[7]，體腔細(xì)胞分離便捷，分離的細(xì)胞數(shù)量多且純凈，可以開發(fā)用于更廣泛的研究用途。

單細(xì)胞凝膠電泳技術(shù)是檢測有核細(xì)胞DNA損傷最常用的方法之一，試驗(yàn)周期短、樣品用量少、結(jié)果靈敏、快速高效，廣泛應(yīng)用于新藥開發(fā)、遺傳毒性檢測以及農(nóng)藥等環(huán)境安全檢測。將蚯蚓體腔細(xì)胞與單細(xì)胞凝膠電泳技術(shù)結(jié)合進(jìn)行的各種細(xì)胞毒理實(shí)驗(yàn)也多有報(bào)道[8-9]。本實(shí)驗(yàn)通過單細(xì)胞凝膠電泳技術(shù)分析過氧化氫對蚯蚓離體體腔細(xì)胞DNA損傷的影響，尋找兩者之間的相關(guān)性，為將蚯蚓替代其他實(shí)驗(yàn)動物以初步篩選具有抗氧化功能、對細(xì)胞有保護(hù)作用的天然抗氧化劑的研究提供參考。

1材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料與儀器

赤子愛勝蚓(Eiseniafetida)由河北省石家莊市晉州市蚯蚓養(yǎng)殖場提供，且在室內(nèi)飼養(yǎng)4周以上。H2O2為西安化學(xué)試劑廠分析純試劑；低熔點(diǎn)瓊脂糖(LMA)、正常熔點(diǎn)瓊脂糖(NMA，西班牙)、Triton X-100、肌氨酸鈉、二甲基亞砜(DMSO)均為Amresco分裝產(chǎn)品；愈瘡木酚甘油醚(Guaiacol Glyceryl Ether)及其余試劑均為國產(chǎn)分析純。倒置熒光顯微鏡(德國Leica 公司DMI3000)、電泳儀(Tanon EPS 300)、電泳槽(北京六一生物技術(shù)有限公司，DYCP-33A)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 蚯蚓體腔細(xì)胞的分離提取

挑選體質(zhì)量為400～500 mg、體長約6～7 cm，最好是還未長出生殖帶的健康蚯蚓進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將蚯蚓在25 ℃，濕度65%，暗環(huán)境下清腸24 h。經(jīng)過預(yù)實(shí)驗(yàn)，H2O2濃度梯度設(shè)置為0、60、120、240、480 μmol·L-15個梯度。

根據(jù)Eyambe的方法[10]提取蚯蚓體腔細(xì)胞，略有改動。選2～3條蚯蚓，避開生殖帶，剪取體后部約三分之一長的軀干放入離心管，加入400 μL預(yù)冷的體腔細(xì)胞提取液(EM:5% C2H5OH，95% 生理鹽水，10 mg·mL-1Guaiacol glyceryl ether，2.5 mg·mL-1Na2EDTA，pH 7.3)；1 min后，加入3倍體積預(yù)冷的PBS緩沖液，棄蚯蚓，1 000 r·min-1低速離心3 min，沖洗體腔細(xì)胞，再加入適量預(yù)冷的LBSS緩沖液(75.5 mmol·L-1NaCl，4.8 mmol·L-1KCl，1.1 mmol·L-1MgSO4·7H2O，0.4 mmol·L-1KH2PO4，0.3 mmol·L-1Na2HPO4，4.2 mmol·L-1NaHCO3,pH 7.4)。顯微鏡下觀察細(xì)胞活力，瑞氏姬姆薩染液染色后觀察細(xì)胞形態(tài)。將細(xì)胞懸液混勻后平均分為5份，分別加入不同濃度的H2O2，室溫(25 ℃)脅迫60 min，脅迫結(jié)束后，離心收集細(xì)胞，重新懸浮于PBS溶液中，調(diào)整細(xì)胞密度，準(zhǔn)備電泳。

1.2.2單細(xì)胞凝膠電泳

按Zhang等[11]改良方法鋪膠，將細(xì)胞懸液和1%低熔點(diǎn)膠1∶1混合均勻，鋪在預(yù)處理后的載玻片上。瓊脂糖凝固后，按常規(guī)單細(xì)胞凝膠電泳方法進(jìn)行操作，從裂解、變性解旋、電泳以及中和的所有過程需在4 ℃下進(jìn)行。EB染色20 min后，將載玻片置于熒光顯微鏡下觀察拍照，每個處理組隨機(jī)取約50個細(xì)胞的圖片。

對獲得的各處理組的彗星圖片經(jīng)CASP圖像分析軟件分析后，得到多項(xiàng)表示DNA損傷程度的參數(shù)。本實(shí)驗(yàn)選用尾部DNA含量(TDNA%)、尾長(TailLength，TL)、尾矩(從彗星頭的右邊界到彗星尾部末端的距離與尾部 DNA 含量的乘積，TailMoment，TM)和Olive尾矩(從頭光密度重心到尾光密度重心的距離與尾部 DNA 含量的乘積，Olive TailMoment，TOM)4項(xiàng)作為本實(shí)驗(yàn)衡量細(xì)胞DNA損傷程度的評價指標(biāo)。

以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3數(shù)據(jù)處理

用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)，單因素方差分析(ANOVA)進(jìn)行組間差異分析，采用LSD(方差齊性)或 Dunnett (方差不齊)進(jìn)行多重比較，將H2O2各濃度處理組與對照組之間進(jìn)行差異顯著性分析，顯著性以 3 個水平表示，分別為P<0.05、P<0.01 和P<0.001。繪圖在 Excel中完成，數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差來表示。

2結(jié)果與分析

2.1蚯蚓的體腔細(xì)胞

蚯蚓體腔細(xì)胞在細(xì)胞免疫中發(fā)揮著重要的作用，其細(xì)胞免疫功能主要是通過體腔細(xì)胞執(zhí)行。所提取的蚯蚓體腔細(xì)胞懸浮液由于其中大量黃細(xì)胞的存在而呈淡黃色。鏡下觀察，可看到大量大小、形狀各不相同的細(xì)胞存在于懸浮液中，如圖1(a)所示。用甲醇固定細(xì)胞后，瑞氏姬姆薩染液染色，細(xì)胞質(zhì)被染成粉紫色，細(xì)胞核被染成深紫色，如圖1(b)所示。其中黃細(xì)胞(A)數(shù)量居多，個體最大，核質(zhì)比小，紫色核居中或偏于細(xì)胞一側(cè)，這類細(xì)胞胞質(zhì)中會積累核黃素和外來物質(zhì)，比其他體腔細(xì)胞對污染物更為敏感[12]；嗜中性細(xì)胞(B)個體較大，細(xì)胞核也較大，呈紫色；嗜堿性細(xì)胞(C)個體較小，數(shù)量較多，染色質(zhì)致密，核深紫色，核質(zhì)比小。

A黃細(xì)胞;B嗜中性細(xì)胞;C嗜堿性細(xì)胞(a) 未染色蚯蚓體腔細(xì)胞 (b) 瑞氏姬姆薩染液染色圖1 蚯蚓體腔細(xì)胞(400×)

2.2 單細(xì)胞凝膠電泳

典型的蚯蚓體腔細(xì)胞單細(xì)胞凝膠電泳圖如圖2所示。

(a)H2O2濃度為60 μmol·L-1 (b)H2O2濃度為240 μmol·L-1圖2 典型的蚯蚓體腔細(xì)胞單細(xì)胞凝膠電泳圖(400×)

從圖2可知，由于H2O2的作用，細(xì)胞核中 DNA 斷裂，在堿性電泳緩沖液作用下，DNA超螺旋結(jié)構(gòu)松散，斷裂的 DNA 碎片從超螺旋結(jié)構(gòu)中釋放出來，在電泳時移向陽極。熒光染色后，在顯微鏡下觀察到尾部朝向陽極的彗星樣圖像。彗星頭部和尾部的熒光強(qiáng)度、彗星全長及慧尾的長度等特征均能夠反映核DNA損傷的程度，或與H2O2脅迫的濃度相關(guān)。

用CASP軟件處理后，不同濃度H2O2各處理組彼此之間DNA損傷結(jié)果如圖3所示。用不同濃度H2O2脅迫蚯蚓體腔細(xì)胞1 h，進(jìn)行單細(xì)胞凝膠電泳，CASP軟件處理后得到TDNA%、TL、TM和TOM4項(xiàng)參數(shù)值，與0、60、120、240和480 μmol ·L-1的H2O2濃度相對應(yīng)的TDNA%分別為17.00±11.58、18.51±10.09、23.70±10.30、27.64±12.38和30.91±9.09；TL分別為24.85±9.73、28.46±8.46、30.00±7.13、31.71±7.65和34.12±3.78；TM分別為5.25±4.87、6.04±4.75、7.78±5.03、9.59±6.02和10.83±4.11；TOM分別為4.78±3.53、5.43±3.33、6.73±3.54、8.12±4.05和9.24±2.85。從圖3可以看出TDNA%、TL、TM、TOM值均隨H2O2濃度升高而提高。與對照組比較，除了最低濃度組60 μmol·L-1外，其他各處理組的TDNA%、TL、TM和TOM值都具有顯著差異(P<0.05)，且H2O2濃度越高，差異越顯著。最高濃度480 μmol·L-1的TDNA%比對照組提高了1.8倍(P<0.001)，TL提高了1.4倍(P<0.001)，TM提高了2.1倍(P<0.001)，TOM提高了1.9倍(P<0.001)。4組H2O2處理組組間的4項(xiàng)參數(shù)值差異隨濃度升高也均達(dá)到顯著水平(P<0.05)。實(shí)驗(yàn)揭示，H2O2脅迫蚯蚓的離體體腔細(xì)胞1 h后，細(xì)胞DNA產(chǎn)生了明顯的損傷，H2O2濃度越高，損傷越嚴(yán)重；H2O2濃度與蚯蚓體腔細(xì)胞DNA損傷程度兩者之間呈顯著的劑量-效應(yīng)關(guān)系。

注：*、**、***分別表示與空白對照相比，達(dá)到P<0.05、P<0.01、P<0.001顯著水平。圖3 不同濃度H2O2脅迫下蚯蚓體腔細(xì)胞單細(xì)胞凝膠電泳結(jié)果

圖3也表明，在本實(shí)驗(yàn)條件下，表示細(xì)胞DNA損傷的4個參數(shù)TDNA%、TL、TM、TOM變化較為一致，均能很好地反映出H2O2濃度與細(xì)胞DNA損傷程度之間的相關(guān)性。

3 討論

蚯蚓是土壤中生物量最大的無脊椎動物，對環(huán)境污染物表現(xiàn)出極強(qiáng)的耐性和抗性，是生態(tài)毒理學(xué)和土壤污染研究理想的實(shí)驗(yàn)材料。實(shí)驗(yàn)室人工飼養(yǎng)蚯蚓方法簡便，還可以無菌培養(yǎng)，這些優(yōu)勢使蚯蚓作為實(shí)驗(yàn)動物開發(fā)并用于更廣泛的研究創(chuàng)造了條件。李紅玉等[13]以秀麗線蟲為實(shí)驗(yàn)材料，嘗試開發(fā)抗氧化藥物篩選試劑盒，他認(rèn)為秀麗隱桿線蟲培養(yǎng)條件簡單，世代周期短，壽命短，容易實(shí)現(xiàn)高通量的優(yōu)勢，是體內(nèi)抗氧化藥物高通量篩選的理想模型。盡管蚯蚓也幾乎具有以上所有優(yōu)點(diǎn)，但極少有人做這方面的嘗試。

由于生物機(jī)體內(nèi)的H2O2通過生成OH自由基(·OH)，對細(xì)胞造成損害，抗氧化劑能清除外來或內(nèi)源性生成的活性氧(ROS)，拮抗DNA損傷，保護(hù)生物體完整性[14]。天然來源的抗氧化劑綠色環(huán)保，安全性高，用途廣泛[15-17]。對天然抗氧化劑的抗氧化活性的測試有很多方法，其中H2O2構(gòu)建的細(xì)胞損傷模型，常常用于對細(xì)胞具有保護(hù)作用的抗氧化劑的研究[18-19]。本研究將提取出的蚯蚓體腔細(xì)胞，用不同濃度的H2O2處理，結(jié)合單細(xì)胞凝膠電泳技術(shù)檢測體腔細(xì)胞DNA損傷程度，揭示H2O2與蚯蚓體腔細(xì)胞損傷之間的相關(guān)性，為探索能拮抗自由基，保護(hù)細(xì)胞免受DNA損傷的天然抗氧化劑的初步篩選提供新思路，這種方法節(jié)省成本，高效，經(jīng)濟(jì)。單細(xì)胞凝膠電泳實(shí)驗(yàn)結(jié)果揭示了隨H2O2濃度升高，代表DNA損傷程度的4個參數(shù)值TDNA%、TL、TM、TOM也隨之升高，H2O2濃度與蚯蚓體腔細(xì)胞DNA損傷程度兩者之間呈顯著的劑量-效應(yīng)關(guān)系，可以進(jìn)一步考慮將蚯蚓體腔細(xì)胞用于天然來源抗氧化劑抗氧化活性的研究。