姜敏 趙玉軍

廣東省第二人民醫(yī)院普外二科，廣州 510317

肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是全球每年新發(fā)腫瘤第7位，2020年新增905 677例，占全部新發(fā)腫瘤4.7%，死亡病例830 180例，占癌癥相關(guān)死亡病例的8.3%，排在第3位［1］。手術(shù)為肝癌目前最好的治療手段，但由于肝癌起病隱匿，多數(shù)患者就診時(shí)已為中期甚至晚期，無法行根治性手術(shù)，通過介入等治療方法一定程度上提高了療效，但總體效果仍欠佳［2］。對晚期肝癌患者，靶向藥物索拉菲尼等的出現(xiàn)，使晚期肝癌的治療出現(xiàn)了明顯改善。接受索拉非尼治療的患者的中位生存期約為10.7個(gè)月，較接受安慰劑的患者延長近3個(gè)月。但索拉非尼組的腹瀉、體質(zhì)量減輕、手足皮膚反應(yīng)和低磷血癥更常見［3］。對免疫療法的反應(yīng)或原發(fā)耐藥的生物標(biāo)志物的研究也在推進(jìn)［4］。為了進(jìn)一步提高肝癌的療效，針對早期肝癌的診斷指標(biāo)及治療靶標(biāo)研究顯得尤為重要。ATP6V1C1基因編碼是液泡ATP酶（V?ATPase）的一種成分，是一種多亞基酶，可介導(dǎo)真核細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)區(qū)室的酸化。V?ATPase依賴性酸化對于蛋白質(zhì)分選、酶原激活、受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用和突觸囊泡質(zhì)子梯度生成等細(xì)胞內(nèi)過程是必需的。目前在乳腺癌、口腔癌、食管癌的研究均提示ATP6V1C1可以促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展，但ATP6V1C1在肝癌方面的研究仍未見報(bào)道［5?10］。因此本研究通過分析數(shù)據(jù)庫ATP6V1C1正常肝組織與腫瘤組織的相對表達(dá)量，以其為HCC提供了新的可能診斷及治療靶標(biāo)。

資料與方法

1、生物信息學(xué)分析

1.1、癌癥基因組圖譜數(shù)據(jù)庫（GEO）數(shù)據(jù)庫分析從GEO（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo）下載GSE121248、GSE14520、GSE36376、GSE62232、GSE74656，利用GEO2R分析各個(gè)芯片數(shù)據(jù)的差異表達(dá)基因（differentially expressed genes，DEG），篩選條件為P＜0.01、|logFc|≥1，共得出上調(diào)基因34個(gè)、下調(diào)基因37個(gè)。其中ATP6V1C1在以上數(shù)據(jù)集均明顯上調(diào)（圖1、表1），這引起我們進(jìn)一步的研究興趣，我們假設(shè)其高表達(dá)與肝癌患者預(yù)后相關(guān)，于是進(jìn)一步分析癌癥基因組圖譜（TCGA）相關(guān)數(shù)據(jù)庫。

圖1 GEO2R分析GSE121248、GSE14520、GSE36376、GSE62232、GSE74656共同差異基因71個(gè)，其中上調(diào)34個(gè)、下調(diào)37個(gè)

1.2、UALCAN數(shù)據(jù)庫分析 UALCAN（http：//ualcan.path.uab.edu/index.html）提供對公開可用的癌癥OMICS數(shù)據(jù)（TCGA、MET500和CPTAC），是一個(gè)用于分析癌癥數(shù)據(jù)庫，提供描繪蛋白質(zhì)編碼、miRNA編碼和lincRNA編碼基因的表達(dá)譜和患者存活信息［11］。在基于腫瘤分級和分期、患者年齡、性別、種族和體質(zhì)量的亞組分析中，LIHC中ATP6V1C1的表達(dá)顯著高于正常組織，并與臨床分期相關(guān)，高表達(dá)組預(yù)后更差（P＜0.05）（圖2）。

1.3、TIMER數(shù)據(jù)庫分析 TIMER是系統(tǒng)分析不同癌癥類型免疫浸潤的綜合資源（https：//cistrome.shinyapps.io/timer/）［12］。TIMER數(shù)據(jù)庫包括來自癌癥基因組圖譜（TCGA）的32種癌癥類型的10 897份樣本，可估計(jì)基因在腫瘤與正常組織差異基因表達(dá)。分析結(jié)果顯示膀胱移行上皮癌、乳腺浸潤癌、膽管癌、結(jié)腸癌、食管癌、頭頸鱗狀細(xì)胞癌、肝癌、肺腺癌、肺鱗癌、直腸腺癌、胃食管癌均正常組織均明顯表達(dá)上調(diào)（圖3）。

1.4、The Human Protein Atlas數(shù)據(jù)庫分析 The Human Protein Atlas數(shù)據(jù)庫（https：//www.proteinatlas.org/）旨在利用各種組學(xué)技術(shù)的集成繪制細(xì)胞、組織和器官中的所有人類蛋白質(zhì)，包括基于抗體的成像、基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和系統(tǒng)生物學(xué)。數(shù)據(jù)庫示ATP6V1C1在正常組織和肝癌組織表達(dá)情況，正常肝組織了3例患者均未檢測到表達(dá)，檢測表達(dá)比例為0%（0/3）。腫瘤組織12例，4例檢測中等表達(dá)、4例檢測低表達(dá)、4例未檢測到表達(dá)，檢測表達(dá)比例為33.3%（4/12）（圖4）。

表1 芯片數(shù)據(jù)集上調(diào)及下調(diào)基因

圖2 ATP6V1C1在肝細(xì)胞癌不同分期、分化、種族、年齡、性別、體質(zhì)量與正常肝組織的比較

圖3 來自癌癥基因組圖譜數(shù)據(jù)庫的不同腫瘤類型中的ATP6V1C1表達(dá)水平

1.5、KEGG信號通路分析 KEGG（http：//www.kegg.jp/）是基因和基因組的百科全書［13］。在分子和更高水平上為基因和基因組分配功能意義是KEGG數(shù)據(jù)庫項(xiàng)目的主要目標(biāo)。經(jīng)過查閱KEGG，發(fā)現(xiàn)ATP6V1C1在mTOR通路可激活Ragulator復(fù)合物的形成，從而激活RasA/B/C/D，最終促進(jìn)MTORC1表達(dá)。MTORC1的磷酸化抑制ATG1，然后參與到自噬相關(guān)的調(diào)控［14］。自噬在癌癥發(fā)展的不同背景和階段中起著動態(tài)的腫瘤抑制或腫瘤促進(jìn)作用。在腫瘤的早期，可能防止腫瘤發(fā)生并抑制癌癥進(jìn)展。一旦腫瘤進(jìn)展到晚期并建立并受到環(huán)境壓力，自噬可促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移來促進(jìn)癌癥的侵襲性，甚至增加腫瘤的化學(xué)抗性［15?16］。另外MTORC1可磷酸化激活S6K，參與到P13K?AKT負(fù)反饋調(diào)控（圖5）。

2、體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)了解ATP6V1C1過表達(dá)及干擾對肝癌細(xì)胞的生物學(xué)功能影響

細(xì)胞孵育箱條件：溫度37℃、5%CO2，完全培養(yǎng)基為90%改良依格爾（DMEM）（美國，Gibco）加10%胎牛血清（美國，Gibco），1%青霉素?鏈霉素（美國，Invitrogen）。

細(xì)胞轉(zhuǎn)染：對照組NC質(zhì)粒為pcDNA3.1（+），目的過表達(dá)質(zhì)粒自己構(gòu)建，pcDNA3.1（+）?ATP6V1C1，使 用Lipofectamine2000（美國，Invitrogen）在說明書的指導(dǎo)下進(jìn)行。轉(zhuǎn)染前使用無血清培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染后6 h換成完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，保證轉(zhuǎn)染效率。

細(xì)胞干擾：小干擾RNA（Small interfering RNA，siRNA）參考并從吉瑪公司（中國）購買，靶向序列5′?CAATGCTACTTCAGCCCAA?3′，使用Lipofectamine RNAiMAX（美國，Invitrogen），在說明書的指導(dǎo)下進(jìn)行［17］。干擾前使用無血清培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，干擾后6 h換成10%培養(yǎng)基培養(yǎng)，保證干擾效率。

3、Western blot、Transwell、增殖及平板集落形成實(shí)驗(yàn)均采用過表達(dá)或干擾48 h的細(xì)胞樣品

Western blot實(shí)驗(yàn)：細(xì)胞樣本PBS洗滌后，使用添加PMSF蛋白酶抑制劑的Western及IP細(xì)胞裂解液（中國，碧云天）冰上裂解30 min，提取細(xì)胞總蛋白，通過SDS?PAGE凝膠電泳分離總蛋白，轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜（美國，Millipore）上，5%牛奶封閉2 h，在4℃條件下一抗（中國，Proteintech）孵育14～16 h（ATP6V1C1 1∶1 000，β?actin 1∶4 000），然后在37℃二抗孵育2 h，化學(xué)顯色后檢測相關(guān)蛋白的表達(dá)。

圖4 The Human Protein Atlas示正常肝組織（A）與腫瘤組織（B）免疫組化染色檢測ATP6V1C1蛋白表達(dá)情況（鏡下標(biāo)尺20μm，10×10倍）

圖5 ATP6V1C1對mTOR信號通路的作用

Transwell實(shí)驗(yàn)：侵襲實(shí)驗(yàn)，將基質(zhì)膠（美國，Corning）按1∶7比例與無血清培養(yǎng)基冰上混勻，取40μl平鋪于Transwell腔室，置入孵育箱1 h凝固。將200μl包含1.5×105個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞懸液均勻鋪展到孔徑為8μm的24孔Transwell腔室（美國，Corning），下腔室添加完全培養(yǎng)基，孵育48 h后，PBS洗滌，甲醇室溫固定15 min，0.7%結(jié)晶紫染色5 min，棉簽輕拭去未遷移至下室的細(xì)胞，在顯微鏡10×10拍照后用Image J軟件統(tǒng)計(jì)遷移的細(xì)胞數(shù)量。遷移實(shí)驗(yàn)不鋪基質(zhì)膠，余步驟同侵襲，收集小室時(shí)間為24 h。

增殖實(shí)驗(yàn)：消化后完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，將含1×104個(gè)細(xì)胞的1 ml細(xì)胞懸液接種于24孔板，設(shè)3個(gè)復(fù)孔，共5 d，連續(xù)記錄每組細(xì)胞生長數(shù)，繪制生長曲線。

平板集落形成實(shí)驗(yàn)：細(xì)胞消化完全培養(yǎng)基重懸后取500個(gè)細(xì)胞的懸液均勻接種于含4 ml 10%培養(yǎng)基的6孔板中，并設(shè)3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10～14 d，單克隆的細(xì)胞集落約含50個(gè)細(xì)胞并肉眼可見時(shí)終止培養(yǎng)，吸掉培養(yǎng)基，PBS洗滌，甲醇固定15～30 min，1%1 ml結(jié)晶紫室溫染色15 min，洗去多余染色液，干燥后拍照，Image J軟件統(tǒng)計(jì)集落數(shù)目。

4、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS26（美國，IBM）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，除特殊說明外，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，使用GraphPad Prism8.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1、過表達(dá)ATP6V1C1后檢測HepG2細(xì)胞前后的功能改變

過表達(dá)ATP6V1C1后Western blot檢測ATP6V1C1蛋白增多，肝癌細(xì)胞HepG2侵襲、遷移、增殖及平板集落形成能力增強(qiáng)（圖6）。

2、干擾ATP6V1C1后檢測HepG2細(xì)胞前后的功能改變

干擾TP6V1C1后Western blot檢測ATP6V1C1蛋白減少，肝癌細(xì)胞HepG2侵襲、遷移、增殖及平板集落形成能力減弱（圖7）。

討 論

肝癌在全球發(fā)病率中位于第7位，病死率為第3位，其早期診斷方法較少，治療效果有限，患者預(yù)后較差。因此，探究肝癌的發(fā)病分子機(jī)制，有助于尋找肝癌的早期診斷標(biāo)志物和有效治療靶點(diǎn)，對提高患者生存率及時(shí)間有重要意義。

活化的肝星狀細(xì)胞在肝纖維化中起關(guān)鍵作用，我們都知道肝纖維化與病毒性肝炎、長期酗酒等有關(guān)，未經(jīng)治療的病毒性肝炎、肝纖維化被認(rèn)為是肝癌主要病因［17］。而敲低ATP6V1C1可一定程度延緩肝纖維化［18］。ATP6V1C1是V?ATPase的一個(gè)亞基，與其他亞基相比，ATP6V1C1是口腔鱗狀細(xì)胞癌中上調(diào)明顯的基因，可影響單個(gè)細(xì)胞內(nèi)的pH值，它被認(rèn)為控制著腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移［6?8］。它在牙髓疾病的破骨細(xì)胞明顯升高，它的過表達(dá)可促進(jìn)破骨細(xì)胞的作用，敲低ATP6V1C1減緩了牙髓疾病的進(jìn)展，防止了骨侵蝕，并可能通過調(diào)節(jié)TLR信號來減輕根尖周組織和牙周韌帶的炎癥［16，19?20］。ATP6V1C1在乳腺癌轉(zhuǎn)移中起著關(guān)鍵作用，ATP6V1C1敲低降低了癌細(xì)胞的細(xì)胞增殖并損害了mTORC1通路的激活［5］。磷脂酰肌醇3?激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）/哺乳動物西羅莫司靶蛋白（mTOR）信號通路在肝癌組織中存在過度表達(dá)，這可能是肝癌發(fā)生、進(jìn)展及轉(zhuǎn)移的一個(gè)機(jī)制，可能是肝癌防治的一個(gè)新靶點(diǎn)［21］。同時(shí)有研究表明，ATP6V1C1的高表達(dá)會影響乳腺癌細(xì)胞的肌動蛋白結(jié)構(gòu)，從而促進(jìn)乳腺癌轉(zhuǎn)移［22］。另外在食管癌的研究提示ATP6V1C1抑制自噬并增強(qiáng)食管鱗狀細(xì)胞癌的放療抗性［10］。

圖6 過表達(dá)ATP6V1C1后檢測HepG2細(xì)胞前后的功能改變

圖7 干擾ATP6V1C1后檢測HepG2細(xì)胞前后的功能改變

在這項(xiàng)研究中，我們通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)了ATP6V1C1在肝癌組織中明顯上調(diào)，并發(fā)現(xiàn)其與患者預(yù)后相關(guān)，體外細(xì)胞過表達(dá)或干擾ATP6V1C1能明顯改變肝癌細(xì)胞的生物學(xué)功能，為肝癌獨(dú)立預(yù)測因素。根據(jù)文獻(xiàn)閱讀提示ATP6V1C1可能與mTOR信號通路相關(guān)，并影響自噬從而導(dǎo)致影響腫瘤生長。后續(xù)研究需要新鮮病理組織進(jìn)一步驗(yàn)證是否與TCGA肝癌表達(dá)一致，進(jìn)一步探索其對肝癌細(xì)胞株功能改變的分子機(jī)制，同時(shí)構(gòu)建穩(wěn)定過表達(dá)及敲除ATP6V1C1細(xì)胞株檢測小鼠原位成瘤及轉(zhuǎn)移模型進(jìn)一步評估。

我們發(fā)現(xiàn)ATP6V1C1在肝癌組織中上調(diào)，其過表達(dá)可促進(jìn)肝癌細(xì)胞侵襲、遷移、增殖及克隆形成能力，相反，干擾該基因可導(dǎo)致以上功能下降。這些結(jié)果提示，ATP6V1C1可能在肝癌的發(fā)生發(fā)展過程中起到重要作用，并有發(fā)展為肝癌的診斷及靶向治療藥物的潛力。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突