徐連彬，任怡飛，蘭偉，侯鵬飛，劉紅云

（浙江大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院奶業(yè)科學(xué)研究所，杭州 310058）

乳腺炎是奶牛的常見疾病，嚴(yán)重影響動物福利和牧場的經(jīng)濟效益[1]。大腸埃希菌是一種革蘭氏陰性菌，也是臨床型乳腺炎的常見致病菌。有研究表明，來自大腸埃希菌的內(nèi)毒素脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）以劑量依賴的方式引起奶牛乳腺組織的炎癥反應(yīng)[2]。在實際生產(chǎn)中，牧場通常采用抗生素來治療奶牛的乳腺炎[3]。然而，抗生素的濫用通常會引起細(xì)菌的耐藥性，進而威脅動物安全和公共衛(wèi)生健康[4-5]。因此，開發(fā)針對乳腺炎的新型防治方法迫在眉睫。

雷帕霉素（rapamycin,RAP）是一種大環(huán)內(nèi)酯類免疫抑制劑，可抑制哺乳動物雷帕霉素靶蛋白的活性。前人的研究發(fā)現(xiàn)，雷帕霉素同樣具有抵抗炎癥的作用。在載脂蛋白-E敲除小鼠中，雷帕霉素抑制單核細(xì)胞的趨化性并減緩動脈粥樣硬化斑塊的發(fā)展[6]；口服雷帕霉素可減輕小鼠炎癥的進展[7]。有證據(jù)表明，核因子-κB（nuclear factor-κB,NF-κB）和絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase,MAPK）信號通路對炎癥起始及抗炎因子的產(chǎn)生具有重要的調(diào)控作用[8-9]。然而，人們關(guān)于雷帕霉素對奶牛乳腺上皮細(xì)胞（mammary alveolar cell-T,MAC-T）炎癥反應(yīng)的影響及作用機制還缺乏進一步的認(rèn)識。本研究旨在探究雷帕霉素能否通過NFκB/MAPK 通路緩解LPS誘導(dǎo)的MAC-T細(xì)胞炎癥，相關(guān)結(jié)果可為評估雷帕霉素治療乳腺炎的應(yīng)用前景提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗細(xì)胞：MAC-T 細(xì)胞由美國佛蒙特大學(xué)趙鳳啟教授饋贈。

1.2 試劑

LPS（貨號：L2630）購自美國Sigma 公司；達(dá)爾伯克改良依格爾培養(yǎng)基（Dulbecco’s modified Eagle medium,DMEM）和胎牛血清（貨號：10091155）購自美國Gibco 公司；青霉素和鏈霉素混合液（貨號：CP010）購自杭州科易生物技術(shù)有限公司；二喹啉甲酸（bicinchoninic acid, BCA）蛋白濃度測定試劑盒（貨號：P0012S）、蛋白質(zhì)印跡法（Western blotting）封閉液（貨號：P0235）、細(xì)胞計數(shù)試劑盒-8（cell counting kit-8,CCK8）、NF-κB 激活-核轉(zhuǎn)運檢測試劑盒（貨號：SN368）、Cy3 標(biāo)記山羊抗兔IgG（貨號：A0516）、4′，6-二脒基-2-苯基吲哚二鹽酸鹽[2-(4-amidinophenyl)-6-indolecarbamidine dihydrochloride,DAPI]細(xì)胞核染色液（貨號：C1002）和Annexin VFITC/PI 細(xì)胞凋亡試劑盒（貨號：C1062L）均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；蛋白質(zhì)印跡法及免疫熒光染色實驗中采用的磷酸化/總的c-Jun N 末端激酶（c-Jun N-terminal kinase,JNK）一抗購自杭州華安生物技術(shù)有限公司；p38 MAPK（貨號：4511/9212）、NF-κB p65（貨號：8242/3033）和內(nèi)參βactin（貨號：3700）一抗購自美國CST（Cell Signaling Technology）公司；白介素-8（interleukin-8,IL-8）、白介素-1β（interleukin-1β, IL-1β）和腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）酶聯(lián)免疫試劑盒購自上海酶聯(lián)生物技術(shù)有限公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)與處理

MAC-T 細(xì)胞生長于含25 mmol/L 葡萄糖、10%胎牛血清、100 IU/mL 青霉素和100 IU/mL 鏈霉素的DMEM（對照組培養(yǎng)基，記為CK）中。細(xì)胞貼壁后，棄去培養(yǎng)基并替換為含不同質(zhì)量濃度（0、1、10、100 μg/mL）LPS 的新鮮培養(yǎng)基，分別培養(yǎng)6、12 和24 h 以獲得合適的LPS 處理濃度和時間。隨后，在對照培養(yǎng)基（CK）和合適的LPS 處理條件下分別添加不同濃度（0、10、50 和100 mmol/L）的雷帕霉素，以確定雷帕霉素的適宜處理濃度。結(jié)果表明：100 μg/mL LPS 處理24 h 顯著增加了培養(yǎng)基上清液中IL-8、IL-1β和TNF-α的濃度；同時，10 mmol/L 雷帕霉素顯著降低了LPS 誘導(dǎo)的IL-1β和TNF-α分泌量。故選擇100 μg/mL LPS和10 mmol/L雷帕霉素作為后續(xù)的處理條件。

為研究雷帕霉素對LPS 誘導(dǎo)的炎癥的調(diào)節(jié)作用，分別在以下4種培養(yǎng)基中處理MAC-T細(xì)胞24 h，以確定雷帕霉素對LPS 誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)的影響：1）不添加LPS和雷帕霉素的對照培養(yǎng)基（CK）；2）在對照培養(yǎng)基中添加100 μg/mL LPS（記為LPS100）；3）在對照培養(yǎng)基中添加10 mmol/L的雷帕霉素（記為RAP10）；4）在對照培養(yǎng)基中添加100 μg/mL LPS 和10 mmol/L 雷帕霉素（記為LPS100＋RAP10）。每組6個重復(fù)，處理結(jié)束后，收集細(xì)胞和上清液用于后續(xù)測定。

1.4 細(xì)胞活力和凋亡測定

將100 μL 5×104mL－1MAC-T細(xì)胞接種于96孔板中，細(xì)胞貼壁后用LPS或雷帕霉素刺激24 h，處理結(jié)束后，棄去培養(yǎng)基并替換為含10 μL CCK8的新鮮培養(yǎng)基后繼續(xù)處理4 h。采用SpectraMAX M5酶標(biāo)儀（美國Molecular Devices公司）測定每孔在550 nm波長下的吸光度以計算細(xì)胞活力變化。采用Annexin V-FITC/PI 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒測定處理后MAC-T 細(xì)胞的凋亡情況，具體操作如下：以5×104mL－1的密度將MAC-T細(xì)胞接種于6孔板中，處理結(jié)束后采用胰酶消化細(xì)胞并轉(zhuǎn)移至離心管中，按比例加入Annexin V-FITC 和PI 2 種染料，并設(shè)置Annexin V-FITC和PI雙染組、Annexin V-FITC或PI單染組以及不加染料的陰性對照組；避光孵育15 min后采用流式細(xì)胞儀（美國BD公司）進行檢測。

1.5 細(xì)胞炎癥因子濃度測定

對細(xì)胞進行上述處理后，吸取培養(yǎng)基至離心管中，在4 ℃條件下，以3 000 r/min離心15 min后收集上清液。參考上海酶聯(lián)生物技術(shù)有限公司相關(guān)試劑盒的操作說明檢測相關(guān)炎癥因子的濃度。

1.6 免疫熒光測定

免疫熒光檢測參考NF-κB激活-核轉(zhuǎn)運檢測試劑盒的操作說明。處理結(jié)束后用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline,PBS）沖洗細(xì)胞并對細(xì)胞進行固定和透化；封閉結(jié)束后，在4 ℃條件下，將細(xì)胞與p65 抗體孵育過夜，隨后采用Cy3 標(biāo)記山羊抗兔IgG室溫孵育1 h，并加入細(xì)胞核染色液室溫染色5 min；最后，向細(xì)胞中滴加適量抗熒光淬滅封片液并用蓋玻片封片，于IX81-FV1000激光共聚焦顯微鏡（日本Olympus公司）下進行觀察。

1.7 蛋白免疫印跡分析

蛋白免疫印跡分析參考前期研究中描述的方法[10]，即吸取20 μg蛋白質(zhì)，經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE）凝膠電泳分離后轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride,PVDF）膜上，在室溫條件下封閉2 h，并分別與磷酸化蛋白質(zhì)和總的JNK、p38 及p65 一抗在4 ℃條件下孵育過夜；之后，采用辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase,HRP）標(biāo)記的山羊抗兔二抗于室溫下繼續(xù)孵育2 h并用化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)檢測條帶的灰度。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

試驗數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，采用SAS 9.2軟件的MIXED程序進行數(shù)據(jù)分析，統(tǒng)計模型包括處理的固定效應(yīng)和試驗批次的隨機效應(yīng)。采用Tukey HSD 檢驗對組間的差異進行分析，以P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。采用Origin 2018軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 LPS 對MAC-T 細(xì)胞炎癥因子分泌的影響

不同濃度的LPS處理不同時間對MAC-T細(xì)胞炎癥因子分泌的影響不同。與對照組（CK）相比，100 μg/mL LPS 處理24 h 顯著增加了培養(yǎng)基上清液中IL-8的濃度（P＜0.05，圖1A），而IL-1β和TNF-α濃度則在這3個處理時間點均顯著升高（P＜0.05，圖1B～C）。如圖2A 所示，與對照組相比，100 μg/mL LPS處理后，藍(lán)色DAPI標(biāo)記的細(xì)胞核區(qū)域內(nèi)紅色標(biāo)記的p65蛋白明顯增加，表明LPS促進了p65蛋白從細(xì)胞質(zhì)到細(xì)胞核的轉(zhuǎn)移。此外，100 μg/mL LPS處理未顯著改變MAC-T細(xì)胞的活力與凋亡（圖2B）。

圖1 不同濃度LPS對MAC-T細(xì)胞炎癥因子分泌的影響Fig.1 Effects of different concentrations of LPS on inflammatory cytokine secretions in MAC-T cells

圖2 100 μg/mL LPS 對MAC-T 細(xì)胞NF-κB 通路、活力和凋亡的影響Fig.2 Effects of 100 μg/mL LPS on NF-κB signaling pathway,viability and apoptosis of MAC-T cells

2.2 雷帕霉素對MAC-T細(xì)胞炎癥因子分泌的影響

由圖3A 可知，不同濃度的雷帕霉素處理未改變細(xì)胞培養(yǎng)基上清液中IL-1β和TNF-α的濃度。然而，與對照組相比，添加10 mmol/L雷帕霉素顯著抑制了LPS 刺激的IL-1β和TNF-α的分泌（P＜0.05，圖3B），鑒于雷帕霉素對乳蛋白合成的抑制作用，故選取該濃度為后續(xù)的處理條件。

圖3 不同濃度雷帕霉素對MAC-T 細(xì)胞炎癥因子分泌的影響Fig.3 Effects of different concentrations of rapamycin oninflammatory cytokine secretions in MAC-T cells

2.3 雷帕霉素對MAC-T 細(xì)胞NF-κB 信號通路的影響

與對照組相比，100 μg/mL LPS 處理細(xì)胞24 h顯著增加了NF-κB 信號通路中p65 蛋白的磷酸化水平（P＜0.05，圖4A），同時促進了p65 蛋白從細(xì)胞質(zhì)向細(xì)胞核的轉(zhuǎn)移（圖4B）。與對照組相比，雷帕霉素單獨處理不影響MAC-T 細(xì)胞p65 蛋白的磷酸化水平（P＞0.05）；然而，在LPS 處理基礎(chǔ)上添加雷帕霉素降低了p65蛋白的磷酸化水平并抑制其向核轉(zhuǎn)移（P＜0.05，圖4A～B）。

圖4 LPS 和雷帕霉素對MAC-T 細(xì)胞NF-κB 信號通路的影響Fig.4 Effects of LPS and rapamycin on NF-κB signaling pathway of MAC-T cells

2.4 雷帕霉素對MAC-T細(xì)胞MAPK通路的影響

由圖5 可知：與對照組相比，LPS100處理增加了MAPK 通路中JNK 和p38 蛋白的磷酸化水平，而雷帕霉素單獨處理則降低了2 種蛋白的磷酸化水平（P＜0.05）；相比LPS100處理組，LPS100＋RAP10組MAC-T細(xì)胞中JNK 和p38 蛋白的磷酸化水平顯著下降（P＜0.05）。

圖5 LPS和雷帕霉素對MAC-T細(xì)胞MAPK信號通路的影響Fig.5 Effects of LPS and rapamycin on MAPK signaling pathway of MAC-T cells

3 討論與結(jié)論

乳腺炎是奶牛中的常見疾病，多由細(xì)菌感染引起[11]。傳統(tǒng)抗生素在乳腺炎治療中的濫用導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性增加和藥物殘留等諸多問題[1]。以往研究表明，雷帕霉素具有一定的抗炎作用，但其在奶牛乳腺上皮細(xì)胞中的作用效果及具體機制尚不明確。而本研究發(fā)現(xiàn)，添加雷帕霉素后可通過NF-κB/MAPK信號通路緩解MAC-T細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。

NF-κB 信號通路在奶牛乳腺炎癥反應(yīng)中具有重要的調(diào)節(jié)作用[12]。在未受刺激的細(xì)胞中，NF-κB二聚體通過與其抑制分子IκB相互作用被隔離在細(xì)胞質(zhì)中[13]。當(dāng)LPS 刺激時，IκB 被磷酸化，導(dǎo)致其與NF-κB解離，進而轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核中并促進炎癥因子產(chǎn)生[14]。本研究中，LPS 處理顯著增加了NF-κB 通路中p65 蛋白的磷酸化水平并促進其向細(xì)胞核轉(zhuǎn)移，提示細(xì)胞炎癥模型構(gòu)建成功。此外，雷帕霉素添加可有效抑制LPS刺激的炎癥因子分泌和p65蛋白向細(xì)胞核轉(zhuǎn)移，提示雷帕霉素對MAC-T 細(xì)胞的炎癥反應(yīng)具有一定的緩解作用。這與BAO 等[15]報道的結(jié)果類似，即雷帕霉素引起的mTORC1抑制降低了巨噬細(xì)胞中鞭毛蛋白誘導(dǎo)的TNF-α和IL-6 分泌。與此相反，另有研究報道，增加雷帕霉素的使用可能會引起一些炎癥反應(yīng)，例如淋巴細(xì)胞性肺泡炎和腎小球腎炎等[16-17]。因此，雷帕霉素治療乳腺炎的具體效果及機制還需要進一步研究與驗證。

MAPK 信號通路與奶牛乳腺炎癥的起始存在一定關(guān)系，其主要包括3 個級聯(lián)蛋白：JNK1/2/3、胞外信號相關(guān)激酶（extracellular signal-related kinases,ERK1/2）和p38-MAPK[18]。MUNOZ等[9]指出，MAPK通路的激活信號是神經(jīng)炎癥的重要調(diào)節(jié)因子，并在神經(jīng)退行性疾病中發(fā)揮重要作用。這一報道與我們觀察到的LPS刺激JNK和p38蛋白的磷酸化水平上升相一致。已有研究表明，p38-MAPK軸可調(diào)節(jié)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞炎癥因子的合成與分泌[19-20]。本研究中，雷帕霉素的添加抑制了LPS 對p38 和JNK 蛋白磷酸化水平的刺激作用，提示MAPK信號通路可能介導(dǎo)了雷帕霉素對MAC-T細(xì)胞炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)。

綜上所述，雷帕霉素的添加緩解了LPS 誘導(dǎo)的MAC-T細(xì)胞炎癥反應(yīng)。在該過程中，NF-κB/MAPK信號通路可能發(fā)揮了重要的調(diào)節(jié)作用。