趙帥，顧天天，侯麗娥，張揚(yáng)，曹正鋒，陳國(guó)宏,2，徐琪，張鈺*

（1.揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225009；2.揚(yáng)州大學(xué)教育部農(nóng)業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品安全國(guó)際合作聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，江蘇 揚(yáng)州 225009）

先天性免疫是防止病原微生物入侵的第一道防線[1]。自20 世紀(jì)90 年代發(fā)現(xiàn)Toll 樣受體（Tolllike receptor, TLR）以來(lái)，人們對(duì)模式識(shí)別受體（pattern recognition receptor,PRR）的認(rèn)識(shí)得到快速發(fā)展[2]，相繼發(fā)現(xiàn)了多種PRR。在PRR家族中，NOD樣受體（NOD-like receptor, NLR）在細(xì)胞質(zhì)中占很大比例，參與炎癥性疾病并促進(jìn)侵入性病原體的快速清除[3]。NLR由3個(gè)結(jié)構(gòu)域組成，包括N末端蛋白質(zhì)相互作用域、中央核苷酸結(jié)合域和C 末端富含亮氨酸的重復(fù)序列（leucine-rich repeat, LRR）。NLR的C端通常被認(rèn)為是微生物來(lái)源配體的識(shí)別和結(jié)合域，是動(dòng)物機(jī)體的危險(xiǎn)信號(hào)傳感器；N端是一個(gè)可變效應(yīng)域，主要由半胱氨酸蛋白酶募集域（caspase recruitment domain, CARD）、吡喃域（pyrin domain,PYD）和桿狀病毒抑制細(xì)胞凋亡蛋白重復(fù)域（baculoviral inhibition of apoptosis protein repeat domain,BIR）組成[4]。NLR 家族的成員按其N 末端結(jié)構(gòu)至少可分為5個(gè)亞家族，包括NLRA（包含酸性反式激活結(jié)構(gòu)域）、NLRB（包含凋亡蛋白重復(fù)序列的桿狀病毒抑制劑）、NLRC（包含CARD）、NLRP（包含吡喃結(jié)構(gòu)域）和NLRX（包含未知結(jié)構(gòu)域）[5]。

NLRC5 是NLRs 家族中最大的成員之一，它可以調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)和許多其他疾病，在炎癥反應(yīng)、先天性免疫反應(yīng)中起調(diào)節(jié)作用[5]。CHONWERAWONG等通過(guò)對(duì)小鼠感染幽門螺桿菌，發(fā)現(xiàn)與未感染的對(duì)照組小鼠相比，幽門螺桿菌感染小鼠的胃組織中NLRC5的信使RNA的水平顯著增加，并且與胃炎的嚴(yán)重程度相關(guān)，幽門螺桿菌通過(guò)NLRC5-/-THP-1巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)的趨化因子和細(xì)胞因子水平明顯高于對(duì)照組[6]。MARTH 等發(fā)現(xiàn)在大腸埃希菌侵入動(dòng)物子宮3 h內(nèi)，NLRC5表達(dá)量顯著增加，以響應(yīng)大腸埃希菌的入侵[7]。WANG等的研究結(jié)果表明，在體內(nèi)和體外脂多糖誘導(dǎo)的ALI 模型中NLRC5mRNA 和蛋白質(zhì)的表達(dá)量均增加[8]。QIU 等研究發(fā)現(xiàn)，NLRC5在雞白痢沙門菌感染的免疫應(yīng)答反應(yīng)中也發(fā)揮了重要作用[9]。此外CIRACI等用內(nèi)毒素處理雞的HD11細(xì)胞，導(dǎo)致其細(xì)胞內(nèi)受體NLRC5 的表達(dá)量顯著上調(diào)[10]。以上研究結(jié)果表明NLRC5 廣泛地參與了動(dòng)物的抗病毒和抗細(xì)菌疾病的免疫應(yīng)答反應(yīng)。

盡管越來(lái)越多的研究報(bào)道顯示，NLRC5在哺乳動(dòng)物機(jī)體識(shí)別入侵微生物、免疫信號(hào)傳遞及先天性免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要作用，但目前對(duì)水禽的NLRC5功能知之甚少。為探明其作用，本研究以揚(yáng)州鵝為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，分析鵝NLRC5 序列特征，并通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction, RT-qPCR）檢測(cè)NLRC5基因的組織表達(dá)譜，同時(shí)檢測(cè)雛鵝感染腸炎沙門菌后肝臟、脾臟和腎臟中NLRC5的表達(dá)情況，初步探明NLRC5在鵝免疫應(yīng)答中的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及樣品采集

實(shí)驗(yàn)用揚(yáng)州鵝均由江蘇省揚(yáng)州天歌鵝業(yè)發(fā)展有限公司提供，在實(shí)驗(yàn)前使用血清玻板凝集實(shí)驗(yàn)檢測(cè)，確定其未感染腸炎沙門菌。選取5 只健康的35日齡揚(yáng)州鵝，頸動(dòng)脈放血后，采集心臟、肝臟、脾臟、肺、腎臟、十二指腸、肌胃、大腦、肌肉等的組織，放于－80 ℃冰箱中凍存，備用。選取40只1日齡揚(yáng)州鵝，隨機(jī)分為2 組，每組20 只：采用皮下注射，實(shí)驗(yàn)組20 只雛鵝通過(guò)頸部皮下接種0.2 mL 腸炎沙門菌（1×108CFU/mL），對(duì)照組20 只雛鵝注射0.2 mL 的生理鹽水，自由采食和飲水，分別在注射后0、1、2、4 d進(jìn)行樣本采集，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)每組均隨機(jī)選取3只雛鵝，采集其肝臟、脾臟和腎臟組織，置于液氮中保存，隨后放于－80 ℃冰箱中凍存，備用。本實(shí)驗(yàn)由揚(yáng)州大學(xué)機(jī)構(gòu)動(dòng)物護(hù)理和使用委員會(huì)審查并批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)：151-2014）。根據(jù)《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物事務(wù)管理規(guī)定》（中國(guó)揚(yáng)州大學(xué)，2012 年）和《實(shí)驗(yàn)實(shí)踐管理標(biāo)準(zhǔn)》（中國(guó)江蘇省，2008年）執(zhí)行程序。

1.2 總RNA 提取和cDNA 合成

按照總RNA 提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取各組織的總RNA，使用超微量紫外分光光度計(jì)檢測(cè)總RNA的濃度和純度，隨后取1 μg 各組織總RNA，根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明合成cDNA第一鏈，用于NLRC5基因表達(dá)量的測(cè)定。

1.3 氨基酸序列分析與同源性比對(duì)

利用NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/），從中下載包括鵝在內(nèi)的7 種脊椎動(dòng)物的NLRC5氨基酸序列，采用NCBI Conserved Domain（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/）對(duì)鵝的NLRC5氨基酸序列進(jìn)行結(jié)構(gòu)域分析，利用DNAMAN 軟件進(jìn)行同源性比對(duì)，采用MEGA Ⅹ軟件計(jì)算奈氏遺傳距離矩陣，并以距離矩陣鄰接法（neighbor joining）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)

根據(jù)GenBank（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/）上提供的序列，采用Primer 5 軟件設(shè)計(jì)引物，引物序列見(jiàn)表1，由北京擎科生物技術(shù)有限公司合成。使用PowerUpTMSYBRTMGreen Master Mix試劑盒在QuantStudioTM5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀（美國(guó)Thermos Fisher Scientific公司）上進(jìn)行反應(yīng)。PCR反應(yīng)體系：2×PowerUpTMSYBRTMGreen Master Mix 10 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各0.4 μL，cDNA模板2 μL，ddH2O 7.2 μL。PCR 反應(yīng)程序：50 ℃激活2 min，95 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃變性15 s，60 ℃延伸1 min，40 個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參基因，采用2－ΔΔCT法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。

表1 RT-qPCR引物信息Table 1 Primer information for RT-qPCR

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

數(shù)據(jù)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，實(shí)驗(yàn)采用Excel 2016建立數(shù)據(jù)庫(kù)，采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 鵝感染腸炎沙門菌后的臨床癥狀

對(duì)照組雛鵝注射生理鹽水后均正常采食和活動(dòng)，無(wú)明顯不適癥狀。實(shí)驗(yàn)組雛鵝在感染腸炎沙門菌后1 d 出現(xiàn)腹瀉、精神萎靡等癥狀；感染后2 d，腹瀉、精神萎靡癥狀加劇并出現(xiàn)3 只死亡情況；感染后3 d，增加死亡1 只，剩余鵝臨床癥狀得到緩解；感染后4 d，腹瀉癥狀進(jìn)一步緩解，精神恢復(fù)正常。

2.2 鵝NLRC5 序列特征分析

利用DNAMAN軟件對(duì)氨基酸序列進(jìn)行同源性比對(duì)，結(jié)果（圖1）顯示：NLRC5 蛋白序列包括NACHT、Atypical_Card、NLRC4_HD2、NOD2_WH等結(jié)構(gòu)域。NLRC5氨基酸序列在哺乳動(dòng)物、禽類和魚(yú)類中高度保守，其中，鵝與鴨的NLRC5 同源性最高（89.12%），其次是鵝與雞（77.78%），而鵝與其他物種相比同源性均在30%左右（表2）。

表2 各物種的NLRC5氨基酸序列同源性比對(duì)Table 2 Homology alignment of NLRC5 amino acid sequences of various species%

圖1 NLRC5氨基酸序列分析Fig.1 Analysis of NLRC5 amino acid sequence

2.3 鵝NLRC5 基因及其編碼的蛋白質(zhì)分析

利用MEGA Ⅹ中的鄰接法構(gòu)建NLRC5氨基酸序列進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果（圖2）顯示，進(jìn)化樹(shù)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)可分為哺乳動(dòng)物、鳥(niǎo)類和魚(yú)3大類，其進(jìn)化分支與同源性比對(duì)結(jié)果相符，且鳥(niǎo)類NLRC5 在進(jìn)化中相當(dāng)保守。參與比對(duì)的物種有鵝（Anser cygnoides domesticus，XP_013032006.1）、鼠（Mus musculus，ACP40992.1）、野豬（Sus scrofa，AGG68119.1）、人（Homo sapiens，NP_001371883.1）、雞（Gallus gallus，AEY11256.1）、鴨（Anas platyrhynchos，XP_012955437.2）、斑馬魚(yú)（Danio rerio，AFN73230.1）。

圖2 NLRC5基因的進(jìn)化樹(shù)分析Fig.2 Phylogenetic tree analysis of NLRC5 gene

2.4 鵝NLRC5 基因組織表達(dá)譜分析

為探明NLRC5在揚(yáng)州鵝各組織中的表達(dá)分布，本研究檢測(cè)了揚(yáng)州鵝心臟、肝臟、脾臟、肺、腎臟、十二指腸、肌胃、大腦和肌肉等組織中NLRC5的相對(duì)表達(dá)量，并以心臟為對(duì)照計(jì)算其他組織或器官相對(duì)于其的倍數(shù)并繪圖。結(jié)果（圖3）表明，NLRC5基因在揚(yáng)州鵝各組織中均有表達(dá)，其中在脾臟中的表達(dá)量最高，其次是在十二指腸和肺中的表達(dá)，在肌胃組織中的表達(dá)量最低。

圖3 鵝NLRC5基因在各組織中的表達(dá)譜分析Fig.3 Expression profiles of NLRC5 mRNA in goose tissues

2.5 感染腸炎沙門菌對(duì)雛鵝組織中NLRC5 表達(dá)量的影響

由圖4 可知：雛鵝在感染腸炎沙門菌后1 d，NLRC5在肝臟中的表達(dá)量顯著升高（P＜0.05），感染后2～4 d，NLRC5的表達(dá)量相對(duì)感染1 d 時(shí)顯著降低（P＜0.05），但仍顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）；雛鵝在感染腸炎沙門菌后1 d，NLRC5在脾臟和腎臟中的表達(dá)量無(wú)顯著變化，感染后2 d，NLRC5在脾臟和腎臟中的表達(dá)量顯著升高（P＜0.05），隨后表達(dá)量降低并在感染后4 d恢復(fù)到正常水平。

圖4 腸炎沙門菌感染后雛鵝不同組織中NLRC5 mRNA的表達(dá)量變化Fig.4 Changes of NLRC5 mRNA expression in different tissues of goslings after being infected with S.enteritidis

3 討論

NOD 樣受體（NLRs）位于細(xì)胞質(zhì)溶膠，作為胞內(nèi)PRR成員之一，是一類天然免疫反應(yīng)中針對(duì)病原微生物的感受器，能夠識(shí)別細(xì)胞內(nèi)的細(xì)菌產(chǎn)物，啟動(dòng)免疫反應(yīng)。NLRs在機(jī)體固有免疫應(yīng)答中發(fā)揮獨(dú)特的功能，目前在人、小鼠、豬、雞等中均有研究[3,5,9,11]，但在鵝中尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，開(kāi)展鵝NLRC5基因在水禽先天性免疫中的功能研究具有重要作用。

通過(guò)對(duì)不同物種的氨基酸序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)鵝與鴨的NLRC5蛋白質(zhì)序列具有高度同源性，達(dá)89.12%，表明鵝NLRC5可能具有和鴨相似的功能。NLRC5在哺乳動(dòng)物中能識(shí)別多種細(xì)菌，抵抗病原入侵，增強(qiáng)機(jī)體自身免疫力[12-13]。目前，已知NLRC5 可以識(shí)別脂多糖、口腔炎病毒，并誘導(dǎo)下游信號(hào)通路，激活核因子-κB（nuclear factor-κB,NF-κB）從而引起β干擾素的產(chǎn)生[14]。

研究表明，NLRC5在免疫相關(guān)組織（包括骨髓、淋巴結(jié)、脾臟和胸腺）以及某些具有黏膜表面的器官（如肺、小腸、結(jié)腸和子宮）中高表達(dá)[15]，揭示NLRC5可能在免疫調(diào)節(jié)中起作用，并且其表達(dá)對(duì)黏膜免疫防御至關(guān)重要。在人類細(xì)胞系中，NLRC5在THP-1 巨噬細(xì)胞中高表達(dá)；在鼠類組織中，NLRC5在淋巴結(jié)、脾臟和胸腺以及肝臟和肺中高表達(dá)[16-17]。本研究也出現(xiàn)了類似的結(jié)果，NLRC5在心臟、肝臟、脾臟、肺、腎臟、十二指腸、肌胃、大腦、肌肉組織中均有表達(dá)，且在脾臟中的表達(dá)水平最高，其次在十二指腸和肺中的表達(dá)量也顯著高于其他組織。脾臟是機(jī)體最大的免疫器官，肺和腸道存在黏膜免疫系統(tǒng)，因此NLRC5在脾臟、肺和十二指腸中高表達(dá)也在情理之中。

NLRC5 在免疫疾病的發(fā)生和發(fā)展中起著至關(guān)重要的調(diào)節(jié)作用[18]。NLRC5參與了先天抗病毒免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)。例如，已有研究表明NLRC5可通過(guò)抑制RIG-Ⅰ和激活MDA5，從而抑制Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生來(lái)有效預(yù)防病毒感染[19]。同時(shí)，在含有微生物成分的免疫組織和炎性細(xì)胞中，NLRC5和促炎細(xì)胞因子的表達(dá)量顯著增加，說(shuō)明NLRC5在特異性識(shí)別非自身致病微生物和消極調(diào)節(jié)炎癥性細(xì)胞因子的表達(dá)中起關(guān)鍵作用[15-16,20]。此外，NLRC5在細(xì)菌和病毒感染的組織或細(xì)胞中高表達(dá)，并且誘導(dǎo)相關(guān)炎性因子的表達(dá)[21]。本研究表明，雛鵝在感染腸炎沙門菌后NLRC5的表達(dá)量在肝臟、脾臟和腎臟中先迅速增加后降低。NLRC5作為反映炎癥嚴(yán)重程度的指標(biāo)[22-23]，在炎癥反應(yīng)的第一階段起著積極的作用，但其作用效果隨著炎癥過(guò)程發(fā)生而逐漸減弱[24]。NLRC5的表達(dá)量在有免疫疾病的小鼠免疫組織，如骨髓、淋巴結(jié)和胸腺中急劇增加[25]。同時(shí)，LIU等的研究證實(shí)，雞在感染腸炎沙門菌期間，能誘導(dǎo)其盲腸和其他免疫組織產(chǎn)生免疫反應(yīng)，從而顯著上調(diào)NLRC5基因表達(dá)[26]。本研究結(jié)果中，雛鵝在感染腸炎沙門菌后，脾臟中NLRC5的表達(dá)量在短期內(nèi)迅速上調(diào)，以上結(jié)果表明NLRC5可能在免疫調(diào)節(jié)中起重要作用。

4 結(jié)論

本研究對(duì)不同物種的NLRC5 氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)NLRC5基因在物種間的進(jìn)化是高度保守的。組織表達(dá)譜分析結(jié)果表明，NLRC5在鵝脾臟中表達(dá)水平最高，此外，雛鵝感染腸炎沙門菌后其肝臟、脾臟和腎臟的NLRC5基因表達(dá)水平顯著上調(diào)，揭示了NLRC5 在鵝機(jī)體識(shí)別病原菌和抗胞內(nèi)菌感染中具有重要作用。本研究為進(jìn)一步探討鵝NLRC5 在機(jī)體先天性免疫應(yīng)答中的調(diào)控作用奠定了基礎(chǔ)。