吳垵夢(mèng)，馬志健，章 維，袁 靜，羅 良，米日古麗，鄭威楠 (.成都醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院預(yù)防醫(yī)學(xué)系，四川 成都 60500；.海南醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室，海南 ?？?5799；.成都醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)與組織胚胎學(xué)教研室/發(fā)育與再生四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 60500)

世界衛(wèi)生組織公布全球每年腫瘤患者病死人數(shù)約占總死亡人數(shù)的1/6[1]，2018年癌癥數(shù)據(jù)顯示，每分鐘里有7人診斷為癌癥[2]。肝癌是癌癥相關(guān)死亡的第三大因素，全球每年肝癌病死人數(shù)超過(guò)500 000人[3-4]。肝癌發(fā)病原因復(fù)雜，治療效果差，易復(fù)發(fā)，因此，尋找新的篩查指標(biāo)具有重要意義。干擾素誘導(dǎo)的跨膜蛋白1(interferon-induced transmembrane protein 1，IFITM1)定位于人類11號(hào)染色體pl5.5區(qū)域，其缺失與多種腫瘤的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)[5]。有研究表明，IFITM1與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，其可參與腫瘤同型黏附和增生信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)，與增生、病毒感染等有關(guān)[6-7]。IFITM1在肝癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中可抑制病毒的表達(dá)，從而發(fā)揮抗病毒作用，因此，IFITM1有可能成為新的肝癌腫瘤標(biāo)記物和篩查指標(biāo)。前期研究發(fā)現(xiàn)IFITM1在維吾爾族婦女宮頸癌組織中低表達(dá)，但I(xiàn)FITM1表達(dá)水平與宮頸癌的病理分級(jí)無(wú)相關(guān)性[8]，且既往研究未闡明IFITM1在肝癌組織病理分級(jí)中的意義。因此，本研究探討IFITM1在肝癌組織中的表達(dá)及其在病理分級(jí)中的意義，以期為臨床提供診斷依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本與試劑

選取2015～2019年海南醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院肝癌手術(shù)中切除的術(shù)前未經(jīng)放療及化療的新鮮組織標(biāo)本和活檢新鮮肝組織標(biāo)本108例，所有取材均經(jīng)患者同意，并經(jīng)海南醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)(HYLL-2021-378)。其中肝癌的石蠟標(biāo)本60例，正常肝組織的石蠟標(biāo)本48例。所有切片均由2位臨床病理學(xué)副主任醫(yī)師采用雙盲法閱片診斷。

實(shí)驗(yàn)所用IFITM1兔抗人單克隆抗體購(gòu)于美國(guó)MILLIPORE公司，二抗試劑(SP9001山羊抗兔)購(gòu)于北京中杉金橋公司。

1.2 方法

正常肝組織HE染色：二甲苯(Ⅰ、Ⅱ)脫蠟各10 min；100%、90%、80%、70%酒精脫水各5 min；蘇木精染色4 min，流水輕輕沖洗；5%乙酸分化1 min，流水沖洗，用吸管滴加5%乙酸，布滿玻片上的組織即可。伊紅染色1 min，流水沖洗；70%、80%、90%、100%酒精醇洗及脫水各10 s；最后二甲苯透明1 min，自然晾干5 min，滴中性樹(shù)膠封片。

采用免疫組織化學(xué)法對(duì)肝癌的石蠟標(biāo)本進(jìn)行染色,以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。常規(guī)二甲苯(Ⅰ、Ⅱ)脫臘處理(各20 min)，并以100%、95%、80%、70%酒精脫水處理(各10 min)。滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶：30%過(guò)氧化氫37 ℃孵育10 min，PBS沖洗5 min,循環(huán)3次?？乖迯?fù)：標(biāo)本在0.01%枸櫞酸緩沖液(pH為6.0)中孵育2～3 min，自然冷卻50 min，PBS沖洗5 min,循環(huán)3次。使用正常羊血清封閉。滴加一抗，4 ℃冰箱孵育過(guò)夜，PBS沖洗5 min；滴加二抗，37 ℃孵育30 min，PBS沖洗5 min,循環(huán)3次。滴加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉素卵白素，37 ℃孵育30 min，PBS沖洗5 min,循環(huán)3次。DAB顯色、蘇木素復(fù)染，常規(guī)脫水，透明，干燥，封片。陽(yáng)性細(xì)胞判斷標(biāo)準(zhǔn)：染色后IFITM1細(xì)胞漿或細(xì)胞膜呈棕黃色顆粒。標(biāo)本染色結(jié)果評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：標(biāo)本染色結(jié)果評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)低于1%，為陰性(-)，記0分；陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占1%～15%，為弱陽(yáng)性(+)，記1分；陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占15%～50%，呈棕黃色，為陽(yáng)性(++)，記2分；陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占50%以上，呈棕褐色，為強(qiáng)陽(yáng)性(+++)，記3分。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)以率(%)表示，采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 IFITM1在肝癌不同病理分級(jí)的免疫組化結(jié)果

在正常肝組織中IFITM1高表達(dá)，表達(dá)較均一，而肝癌組織中IFITM1低表達(dá)，表達(dá)不均一，且肝癌分化程度不同，蛋白表達(dá)水平也不同；肝癌組織病理分級(jí)與IFITM1表達(dá)水平密切相關(guān)，肝癌組織的分化程度越高，IFITM1表達(dá)水平越高，肝癌的惡性程度越低；而肝癌組織的分化程度越低，IFITM1表達(dá)水平越低，肝癌的惡性程度越高，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見(jiàn)圖1。

a:正常肝組織HE染色；b：陰性對(duì)照；c：正常肝組織中IFITM1的表達(dá)；d：高分化肝癌組織中IFITM1的表達(dá)；e：中分化肝癌組織中IFITM1的表達(dá)；f：低分化肝癌組織中IFITM1的表達(dá)

免疫組織化學(xué)法分析顯示，60例肝癌組織中強(qiáng)陽(yáng)性1例(1.67%)、陽(yáng)性11例(18.33%)、弱陽(yáng)性41例(68.33%)、陰性7例(11.67%)，48例正常肝組織中強(qiáng)陽(yáng)性1例(2.08%)、陽(yáng)性40例(83.33%)、陽(yáng)性7例(14.58%)。肝癌組織中IFITM1低表達(dá)或不表達(dá)，與正常肝組織相比，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=46.292，P<0.01)。

2.2 IFITMI在肝癌患者中的表達(dá)與臨床特征的關(guān)系

60例肝癌組織分為高、中、低分化癌，其中5例高分化肝癌組織中強(qiáng)陽(yáng)性2例、陽(yáng)性2例、弱陽(yáng)性1例；15例中分化肝癌組織中強(qiáng)陽(yáng)性3例、陽(yáng)性7例、弱陽(yáng)性5例；40例低分化肝癌組織中強(qiáng)陽(yáng)性1例、陽(yáng)性3例、弱陽(yáng)性35例、陰性1例。肝癌組織中包膜完整16例，包膜不完整44例。16例包膜完整的肝癌組織中陽(yáng)性3例、弱陽(yáng)性7例、陰性6例；44例包膜不完整的肝癌組織中強(qiáng)陽(yáng)性1例、陽(yáng)性8例、弱陽(yáng)性34例、陰性1例。腫瘤直徑小于5 cm的肝癌組織16例；腫瘤直徑大于或等于5 cm的肝癌組織44例。16例腫瘤直徑小于5 cm的肝癌組織中陽(yáng)性1例、弱陽(yáng)性10例、陰性5例；44例腫瘤直徑大于或等于5 cm的肝癌組織中強(qiáng)陽(yáng)性1例、陽(yáng)性10例、弱陽(yáng)性31例、陰性2例。肝癌患者不同病理分級(jí)IFITM1表達(dá)水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見(jiàn)表1。

表1 IFITM1在不同病理分級(jí)肝癌患者中的表達(dá)與臨床特征的關(guān)系[例(%)]

3 討論

2018年全球消化道惡性腫瘤的患者死亡人數(shù)占全部腫瘤相關(guān)死亡人數(shù)的40%以上[9]。海南地區(qū)肝癌病死率居各類惡性腫瘤的第一位[10]，其中海南南部地區(qū)少數(shù)民族人群的肝癌病死率較高，地域分布特征明顯[11]。海南肝癌高發(fā)與病毒感染及生活環(huán)境、習(xí)慣等相關(guān)[11]。

干擾素誘導(dǎo)的跨膜蛋白(interferon-induced transmembrane protein，IFITM)是一個(gè)小的同源蛋白家族，定位于細(xì)胞漿和內(nèi)溶酶體膜，可賦予細(xì)胞對(duì)許多病毒的抗性，IFITM家族有IFITM1、IFITM2、IFITM3，是抗多種RNA病毒的宿主效應(yīng)蛋白。人類11號(hào)染色體pl5.5區(qū)域的缺失被認(rèn)為與多種癌癥的發(fā)病機(jī)理密切相關(guān)，而IFITM1定位于此區(qū)域[5]，最初是作為淋巴細(xì)胞的表面抗原而被發(fā)現(xiàn)[12-14]。

Pan等[15]研究發(fā)現(xiàn)，IFITM1在維吾爾族婦女宮頸癌組織中低表達(dá)，但I(xiàn)FITM1在宮頸癌中的表達(dá)水平與病理分級(jí)無(wú)關(guān)。IFITM1在不同組織器官中的表達(dá)形式、表達(dá)水平不同[16]。IFITM1在卵巢癌[17]、子宮內(nèi)膜異位癥[18]、小細(xì)胞肺癌[19]、口腔癌及頭頸部腫瘤[20]、膽囊鱗狀細(xì)胞癌/腺鱗癌和腺癌[21]、直腸癌[22]、乳腺癌[23]等患者的腫瘤組織中呈高表達(dá)，但在胰腺癌[24]、低級(jí)別擴(kuò)散的星型細(xì)胞瘤[25]等患者的腫瘤組織中呈低表達(dá)甚至不表達(dá)。在肝癌和乳腺癌中，miR-29a以及Ras-GTP酶激活蛋白SH3結(jié)構(gòu)域結(jié)合蛋白均能與IFITM mRNA的3’-UTR結(jié)合，而IFITM mRNA的3’-UTR正向調(diào)控IFITM1表達(dá)[26-28]，但其機(jī)制尚未明確。肝炎病毒感染是全球肝細(xì)胞癌和肝硬化發(fā)生的主要原因之一，Wilkins等[29]的研究證實(shí)IFITM1是一種肝細(xì)胞緊密連接蛋白，也是一種有效的抗丙型肝炎病毒的效應(yīng)分子，IFITM1表達(dá)在Ⅰ型干擾素治療肝細(xì)胞的早期被誘導(dǎo)，通過(guò)與丙型肝炎病毒共受體(包括CD81和occludin閉合蛋白)相互作用，從而破壞病毒進(jìn)入的過(guò)程，提示IFITM1可通過(guò)阻斷病毒共受體功能來(lái)控制丙型肝炎病毒感染。Xie等[30]研究顯示，IFITM1作為p53的下游效應(yīng)因子，可能受到p53介導(dǎo)的自噬及母參堿誘導(dǎo)的人肝癌細(xì)胞自噬的調(diào)控，使自噬轉(zhuǎn)變?yōu)榈蛲?，?duì)肝癌具有抑制作用。本研究結(jié)果顯示，正常肝組織中IFITM1表達(dá)水平較高，而肝癌組織中IFITM1表達(dá)水平明顯較低，IFITM1在肝癌中的表達(dá)與性別、年齡無(wú)關(guān)，但與腫瘤直徑、腫瘤包膜完整性及分化程度有關(guān)。IFITM1肝癌組織病理分級(jí)及IFITM1表達(dá)水平與肝癌預(yù)后不良密切相關(guān)，肝癌的分化程度越高，IFITM1表達(dá)水平越高，肝癌的惡性程度相對(duì)越低；而分化程度越低，IFITM1表達(dá)水平相對(duì)越低，肝癌的惡性程度相對(duì)越高。由此，IFITM1表達(dá)與患者預(yù)后不良相關(guān)，IFITM1有可能是一個(gè)潛在的抑制肝癌發(fā)展的基因，可能成為肝癌診斷、治療的標(biāo)志物。