黃方舟，黃 艷，馮 習，黃佩琦 (長沙市第四醫(yī)院急診急救中心,湖南 長沙 410006)

急性肺損傷(acute lung injury，ALI)是由各種直接或間接損傷因素導致的臨床綜合征，特征為肺水腫、炎癥反應和表面活性物質(zhì)功能障礙，嚴重時還會出現(xiàn)急性呼吸窘迫綜合征和低氧血癥等[1-2]。因此，探索新的ALI治療方法和治療靶點非常有必要。

造成肺損傷的主要原因是機體炎癥反應和氧化應激失衡。炎癥反應涉及炎癥細胞的活化和炎癥細胞因子的釋放，會引起肺損傷和進一步的急性低氧性呼吸功能不全或呼吸衰竭[3]。當機體受到不利刺激時，氧化和抗氧化過程會變得不平衡，導致過氧化產(chǎn)物，包括活性氧(reactive oxygen species，ROS)和丙二醛(malondialdehyde，MDA)積累，從而導致細胞死亡[4]。此外，過氧化產(chǎn)物的積累也與炎癥反應的激活有關。ROS可通過核因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)途徑和染色質(zhì)重塑調(diào)節(jié)促炎因子的表達。據(jù)報道，抑制炎癥反應和氧化應激可有效減輕脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)誘導的ALI[5]。這種抑制作用是通過阻斷Toll樣受體4(Toll-like receptor 4，TLR4)/NF-κB途徑和核因子E2相關因子2(nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2)/血紅素加氧酶1(heme oxygenase 1，HO-1)途徑實現(xiàn)的[6]。因此，炎癥反應和氧化應激可能是ALI的治療靶標。甲潑尼龍是一種人工合成的糖皮質(zhì)激素，具有較強的抗炎活性，對多種疾病(如內(nèi)分泌失調(diào)、風濕性疾病、膠原性病、皮膚疾病、過敏反應等)具有治療作用。糖皮質(zhì)激素治療呼吸道疾病的應用價值已得到臨床證實，甲潑尼龍也被廣泛應用于呼吸道疾病的治療[7-9]。甲潑尼龍作為一種免疫抑制劑在減少COVID-19患者的呼吸道炎癥方面效果理想[10]；靜脈注射甲潑尼龍可迅速改善非感染性葡萄膜炎；甲潑尼龍可減輕圍產(chǎn)期中風缺氧缺血模型大鼠持續(xù)的缺血后炎癥反應，對L-精氨酸誘導的急性胰腺炎具有抗炎和抗氧化作用[11]；甲潑尼龍琥珀酸鈉可減少顱內(nèi)出血模型小鼠的血腦屏障破壞和炎癥；甲潑尼龍在肺組織中具有很強的滲透性，可用于治療慢性阻塞性肺病，起效迅速且抗炎作用顯著。另外，靜脈滴注甲潑尼龍還可以促進藥物對全身的作用，減少機體的炎癥反應，對緩解患者癥狀效果較好。但目前甲潑尼龍治療呼吸道疾病的作用機制尚不明確，因此，本研究通過探討甲潑尼龍對ALI的作用和相關分子機制，旨在為其臨床應用提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試劑

LPS(阿拉丁，上海)，甲潑尼龍(批號：100828-201603，常州四藥制藥有限公司)，地塞米松(批號：101116-202002，成都天臺山制藥有限公司)，腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)和白介素-6(interleukin-6，IL-6)試劑盒(博士德生物工程有限公司，武漢)，MDA、過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)試劑盒(碧云天，上海)，高遷移率族蛋白β1(chigh mobility group protein 1,HMGB1)、TLR4和TLR5抗體(Proteintech中國分公司，武漢)，Myd88、p65、p-P65、IκBα、p-IκBα一抗(Cincinnati，USA)，anti-GAPDH(Santa Cruz，USA)。

1.2 動物

48只SPF級雄性SD大鼠(湖南省實驗動物中心，SCXK湘2016-0001)，體質(zhì)量250～300 g，動物自由攝食飲水，飼養(yǎng)于溫度22～25 ℃和黑暗12 h/白天12 h的環(huán)境下，本研究通過我院倫理委員會批準。

1.3 ALI造模與分組

48只SD大鼠隨機分為對照組、模型組(ALI)、低劑量(甲潑尼龍0.4 mg/kg)組、中劑量(甲潑尼龍4 mg/kg)組、高劑量(甲潑尼龍40 mg/kg)組和陽性藥(地塞米松2 mg/kg)組，每組8只。參考文獻[12-13]，給予LPS(2 mg/kg)前1 h，對照組和模型組腹腔注射生理鹽水，甲潑尼龍組和陽性藥組腹腔注射相應劑量的甲潑尼龍或地塞米松，然后LPS刺激12 h，處死大鼠。

1.4 蘇木精—伊紅(HE)染色

收集肺組織樣本，用10%甲醛固定24 h，然后石蠟包埋，并切片(5 μm)。根據(jù)說明書用蘇木精和伊紅染色，顯微鏡下觀察肺組織病理變化。參考文獻[14]進行肺損傷評分，肺泡充血、肺泡壁增厚和水腫、肺泡細胞浸潤等3個指標按照無、輕度、中度、嚴重4個等級分為0、1、2、3分，最高分別為3分，總分為9分。

1.5 肺濕干重比值(wet/dry weight ratio,W/D)

解剖分離新鮮的大鼠肺組織，測量肺組織的濕重；然后將肺組織置于70 ℃的烤箱中24 h，去除所有水分，測量干重，計算肺組織的W/D。

1.6 酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)

使用ELISA試劑盒根據(jù)說明書檢測肺灌洗液中TNF-α、IL-1β和IL-6的含量。

1.7 肺組織中MDA、MPO和SOD含量

將肺組織勻漿并離心，使用放射免疫沉淀裂解緩沖液裂解細胞，然后將裂解物離心以獲得上清液。采用BCA蛋白定量試劑盒檢測蛋白濃度，然后用生理鹽水稀釋至1 mg/mL。隨后，根據(jù)說明書使用MDA、MPO和SOD試劑盒測定含量。

1.8 Western blot

提取肺組織總蛋白，使用BCA蛋白定量試劑盒檢測蛋白濃度。通過10% SDS-PAGE分離等量(20 μg)的蛋白質(zhì)，轉移到聚偏二氟乙烯膜上，將蛋白與一抗(HMGB1、TLR4、TLR5、Myd88、p65、p-p65、IκBα、p-IκBα、GAPDH，按1∶1 000稀釋)在4 ℃下孵育過夜。隨后，將膜與HRP標記的羊抗兔抗體或羊抗鼠二抗(1∶5 000)在室溫下孵育2 h。用化學發(fā)光試劑顯色，并通過Gel-Pro-Analyzer軟件分析光密度值。將GAPDH作為內(nèi)參，以標準化目標蛋白表達水平。

1.9 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 甲潑尼龍對ALI大鼠肺損傷和W/D的影響

組織病理學結果顯示，與對照組比較，模型組出現(xiàn)肺泡出血和肺泡隔水腫，中性粒細胞大量浸潤到肺泡內(nèi)間隔和肺泡間隙；低劑量組也出現(xiàn)了上述變化；但與模型組比較，中劑量組、高劑量組及陽性藥組上述炎癥變化顯著減弱(圖1a)。肺損傷評分和W/D結果顯示，與對照組比較，模型組大鼠肺損傷評分和W/D增加(P<0.001)，但中劑量組、高劑量組及陽性藥組肺損傷評分和W/D較模型組均減少(P<0.01)，見圖1b、c。

a：HE染色結果；b：肺損傷評分；c：肺組織W/D ###：與對照組比較，P<0.001；***：與模型組比較，P<0.001

2.2 甲潑尼龍對ALI大鼠肺灌洗液中炎癥因子的影響

與對照組比較，模型組大鼠肺灌洗液中炎癥因子TNF-α、IL-6和IL-1β的含量顯著增加(P<0.001)；與模型組比較，低劑量組、中劑量組和高劑量組及陽性藥組大鼠肺灌洗液中炎癥因子TNF-α、IL-6和IL-1β含量顯著降低(P<0.01)，但陽性藥組與高劑量組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見圖2。

a：TNF-α含量；b：IL-6含量；c：IL-1β含量 ###：與對照組比較，P<0.001；**：與模型組比較，P<0.01;***：與模型組比較，P<0.001

2.3 甲潑尼龍對ALI大鼠肺組織氧化應激因子的影響

與對照組比較，模型組大鼠肺組織中MPO活性和MDA含量顯著增加(P<0.001)，SOD活性顯著降低(P<0.001)；與模型組比較，中劑量組、高劑量組及陽性藥組大鼠肺組織中MPO活性和MDA含量顯著降低(P<0.05)，SOD活性增加(P<0.05)，見圖3。

a：MPO活性；b：MDA含量；c：SOD活性 ###：與對照組比較，P<0.001；*：與模型組比較，P<0.05；**：與模型組比較，P<0.01；***：與模型組比較，P<0.001

2.4 甲潑尼龍對ALI大鼠肺組織NF-κB信號分子表達的影響

與對照組比較，模型組大鼠肺組織中p-p65和p-IκBα蛋白表達水平上調(diào)(P<0.05)；低劑量組、中劑量組、高劑量組和陽性藥組大鼠肺組織中p-p65和p-IκBα蛋白表達水平較模型組下調(diào)(P<0.05)，但各組大鼠肺組織中p65蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義，見圖4。

#：與對照組比較，P<0.05；*：與模型組比較，P<0.05

2.5 甲潑尼龍對HMGB1/TLRs信號分子表達的影響

與對照組比較，模型組大鼠肺組織中HMGB1、TLR4和TLR5蛋白表達水平上調(diào)(P<0.05)；中劑量組、高劑量組和陽性藥組大鼠肺組織中HMGB1、TLR4和TLR5蛋白表達水平較模型組下調(diào)(P<0.05)；高劑量組與陽性藥組HMGB1、TLR4和TLR5蛋白表達水平比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見圖5。

#：與對照組比較，P<0.05；*：與模型組比較，P<0.05

3 討論

ALI作為一種嚴重的炎癥性疾病，是急性呼吸衰竭綜合征，由與肺炎、嚴重膿毒癥、胃食管反流、肺泡出血等相關的肺泡—毛細血管屏障障礙引起，其發(fā)病率和病死率均較高。但目前臨床尚無有效的ALI藥物，故預防具有重要意義。糖皮質(zhì)激素是一類有效的抗炎藥，其主要通過與細胞質(zhì)糖皮質(zhì)激素受體結合發(fā)揮作用。糖皮質(zhì)激素受體復合物可與特定的DNA序列(糖皮質(zhì)激素反應元件)結合，從而激活基因轉錄，或與DNA結合轉錄因子(如NF-κB和激活蛋白-1)結合,調(diào)節(jié)促炎細胞因子(如IL-6、IL-17a和TNF-α等)的轉錄。此外，糖皮質(zhì)激素與天然抗炎細胞因子(如IL-1、IL-4、IL-10和IL-13受體拮抗劑)具有協(xié)同作用。但目前臨床關于人工合成型糖皮質(zhì)激素甲潑尼龍抗ALI的研究較少，故本研究就甲潑尼龍的抗ALI活性和相關機制展開探討。

炎癥反應是肺損傷的重要原因，在炎癥過程中，炎癥因子TNF-α、IL-6和IL-1β調(diào)節(jié)細胞內(nèi)級聯(lián)炎癥信號。TNF-α具有很強的炎癥破壞能力，是人體內(nèi)最強的炎癥介質(zhì)之一；IL-6是表征炎癥性疾病嚴重程度的重要指標；IL-1β是炎癥的主要介質(zhì)，可破壞血管內(nèi)皮和肺上皮細胞。有研究發(fā)現(xiàn)，在肺損傷動物模型和急性呼吸窘迫綜合征患者中均觀察到嚴重的炎癥反應和大量的炎癥因子(IL-1β、TNF-α和IL-6)[15-16]。此外，有研究表明包括IL-6在內(nèi)的炎癥因子的高表達還與急性呼吸窘迫綜合征患者的預后不良有關[17]。本研究結果顯示，LPS處理的大鼠炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-6含量增加，與先前的結果一致[5]；而甲潑尼龍可以顯著降低ALI大鼠肺灌洗液中的炎癥因子含量，并且能夠抑制中性粒細胞大量浸潤到肺泡內(nèi)間隔和肺泡間隙，對ALI大鼠表現(xiàn)出抗炎活性。

氧化應激是造成肺損傷的另一個重要原因，其不僅可以直接損傷肺組織，還可以通過調(diào)節(jié)炎癥反應間接損傷肺組織[18]。氧化應激指標包括MPO、MDA和SOD等。MPO活性是肺組織中性粒細胞浸潤的標志，隨著ALI發(fā)展，大量的中性粒細胞浸潤到肺泡間隙，MPO活性增加。SOD是體內(nèi)的一種抗氧化酶，當肺組織受損時，清除的氧自由基被大量消耗，SOD活性降低。MDA是一種脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，當肺組織受損時，會與氧自由基含量成比例增加。本研究結果顯示，甲潑尼龍可以顯著抑制ALI大鼠肺組織MPO活性，并降低MDA含量，同時提高SOD活性，說明甲潑尼龍具有良好的抗氧化活性。以LPS誘導動物模型可引起肺組織中MPO和MDA的積累，與肺損傷患者臨床變化一致，表明氧化應激在誘導肺損傷中起關鍵作用[6]。有研究發(fā)現(xiàn)，抑制炎癥反應和氧化應激的藥物可有效減輕肺損傷，包括蝦青素、蟲草素和蒙花苷等[19-20]。上述研究結果說明甲潑尼龍可能通過調(diào)控機體氧化應激發(fā)揮抗肺損傷活性。

HMGB1是高度保守的非組蛋白染色體結合蛋白，與多種肺部疾病有關，包括肺炎、肺結核、慢性阻塞性肺部疾病、肺纖維化等[21-22]。正常情況下，HMGB1主要集中于細胞核，但當細胞受損或壞死時，HMGB1的賴氨酸殘基被乙?；⑦w移到細胞質(zhì)，然后在溶血磷脂酰膽堿作用下被分泌到細胞外[23]。細胞外HMGB1作用于Toll受體，通過激活NF-κB參與炎癥反應和氧化應激的調(diào)節(jié)[24]。HMGB1是TLR4的上游調(diào)節(jié)劑，在LPS誘導的肺損傷中，HMGB1介導了TLR4/NF-κB信號通路的激活，而HMGB1的下調(diào)阻斷了TLR4/NF-κB信號通路[25]。在LPS刺激下，IκBα磷酸化，且與NF-κB二聚體(p65和p50)分離，隨后被蛋白酶體降解?；罨腘F-κB從細胞質(zhì)轉移到細胞核，與靶基因啟動子或增強子中的κB位點結合，然后p65被蛋白激酶磷酸化，引發(fā)炎癥因子和氧化應激相關因子的轉錄[26]。因此，NF-κB通路對于誘導炎癥反應和氧化應激至關重要。此外，研究發(fā)現(xiàn)TLR4/NF-κB途徑的阻斷可有效抑制肺部的氧化應激和炎癥反應[27]。因此，HMGB1/TLR4/NF-κB途徑是誘導炎癥反應和氧化應激的重要通路。據(jù)報道，TLR5在炎癥性疾病和組織中高表達，TLR5的敲低顯著降低了炎癥因子的釋放，TLR5也可以激活NF-κB通路[28-29]。本研究結果顯示，LPS處理上調(diào)了肺組織中HMGB1、TLR4、TLR5、p-p65和p-IκBα的表達水平，但甲潑尼龍抑制了其表達。這說明甲潑尼龍可能通過HMGB1/TLRs/NF-κB途徑抑制LPS誘導的炎癥反應和氧化應激。

綜上所述，LPS可引發(fā)ALI，并伴有肺水腫、炎癥反應和氧化應激的增加，而甲潑尼龍可以通過抑制炎癥反應和氧化應激緩解ALI。此外，甲潑尼龍還可通過阻斷HMGB1/TLRs/NF-κB途徑減輕LPS誘導的ALI。