李曉栩，崔 宇，陽一棟，周曉英，矯 力，王辰元，楊誠忠，史 詩，黃 緘 (.陸軍軍醫(yī)大學(xué)高原軍事醫(yī)學(xué)系/高原生理學(xué)與病理學(xué)教研室/極端環(huán)境醫(yī)學(xué)教育部重點實驗室/全軍高原醫(yī)學(xué)重點實驗室，重慶 400038；.重慶醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校生理教研室，重慶 4033)

線粒體是一種存在于真核細胞內(nèi)、具有雙層膜結(jié)構(gòu)的細胞器，是細胞進行有氧氧化和能量轉(zhuǎn)換的主要場所[1]，細胞生命活動所需能量的80%來自線粒體，因而線粒體也被喻為細胞的動力工廠。線粒體的功能研究對于了解細胞的能量代謝尤為重要，通過檢測細胞的氧消耗量和三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)生成量可以反映線粒體的呼吸功能[2-4]。以往通常采用Clark電極來檢測線粒體的呼吸功能，但該方法需從完整的細胞中分離線粒體，無法保證線粒體的質(zhì)量和數(shù)量，且需要使用大量的電池、電極、染料、放射性物質(zhì)，并需要進行細胞裂解，具有很大的局限性。

細胞外流量檢測儀Seahorse XF-96是一款通過檢測細胞外流量分析線粒體有氧代謝、細胞代謝和糖酵解等的新型儀器，可以精準(zhǔn)、實時測量活細胞和組織的能量代謝[5]。該儀器可利用光學(xué)傳感器和特殊的微孔板設(shè)計，實現(xiàn)對耗氧率(oxygen consumption rate，OCR)和pH值的無創(chuàng)檢測。細胞外酸化率(extracellular acidification rate，ECAR)和OCR可分別反映糖酵解和線粒體呼吸功能，從而快速評估細胞內(nèi)線粒體的有氧代謝和糖酵解的能量代謝狀態(tài)[6]。以往關(guān)于細胞濃度對線粒體功能影響的研究較少，研究者往往通過查閱文獻，選擇相應(yīng)的細胞濃度或藥物濃度進行實驗，但在實際工作中，很多原代培養(yǎng)的細胞無可參考的細胞濃度，而是否進行細胞濃度的優(yōu)化對研究至關(guān)重要；此外，在檢測線粒體功能時，為了保持細胞活性，往往會在培養(yǎng)基中加入少量血清，但是血清是否會影響線粒體功能目前尚不清楚。因此，本研究擬利用Seahorse XF-96探討不同細胞濃度和血清對線粒體功能的影響，以期為后續(xù)建立穩(wěn)定的細胞模型提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

20 μL、200 μL多道移液器(德國Eppendorf公司)，電動吸液器(美國Axgen公司)，細胞外流量檢測儀Seahorse XF-96(美國Seahorse Bioscience公司)，超凈工作臺(蘇州金凈凈化設(shè)備科技有限公司)，細胞培養(yǎng)箱(美國NUAIRE公司)，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱(美國賽默飛世爾科技有限公司)，細胞計數(shù)儀(美國Becman公司)，純水儀(美國Millipore公司)，臺式低溫冷凍離心機(德國Eppendorf公司)。

U87細胞由美國國立衛(wèi)生研究院國家癌癥研究所提供，人臍靜脈內(nèi)皮細胞株(human umbilical vein endothelial cells，HUVEC)為高原生理學(xué)與病理學(xué)教研室保種，細胞線粒體應(yīng)激試劑盒、XF-96 V3聚苯乙烯細胞培養(yǎng)微孔板、XF校準(zhǔn)液、XF檢測液等購自美國安捷倫科技公司，胎牛血清、DMEM高糖培養(yǎng)基購自美國Gibco公司，丙酮酸鈉、葡萄糖購自德國Sigma公司，氫氧化鈉購自上海國藥集團化學(xué)試劑有限公司，鹽酸購自濟南大暉化工科技有限公司。

1.2 方法

檢測原理：在實驗中使用96孔檢測板，檢測板分為上下兩部分，上部分帶有傳感器探針，探針上帶有粉紅色的熒光物質(zhì)，可附著氫離子和氧氣，探針中間是帶有光纖的鋼針，檢測板下面放置鋪有單層細胞的細胞培養(yǎng)板。當(dāng)程序啟動后，儀器會推動探針形成一個暫時的密閉微環(huán)境，可在這個微環(huán)境中測量氧氣和pH值的變化；當(dāng)探針進入培養(yǎng)基液面后，會在每個孔中形成2.28 μL的小室，從而實時檢測氧分壓和pH值的變化；當(dāng)探針離開培養(yǎng)基液面，微環(huán)境又回到基線水平，可通過斜率計算OCR和ECAR。

細胞制備(實驗前準(zhǔn)備)：取對數(shù)生長期的細胞，常規(guī)胰酶消化后制備細胞懸液，取1 mL細胞懸液用細胞計數(shù)儀進行計數(shù)，調(diào)整細胞濃度為1×105/mL，在XF-96 V3聚苯乙烯細胞培養(yǎng)微孔板中加入80 μL細胞懸液，濃度為2×103～8×103/孔，預(yù)留背景校正孔(A1、A12、H1、H12角落的4個孔)不接種細胞，依據(jù)細胞濃度分為2 000組、4 000組、6 000組和8 000組。細胞接種完后，于37 ℃、5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜[6-7]。

測試板水化：在實驗前1 d每孔加入200 μL XF校準(zhǔn)液，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中水化過夜，以激活熒光探針。實驗前調(diào)節(jié)XF檢測液pH值至7.4，并置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中預(yù)熱。

細胞換液：移除細胞培養(yǎng)板中的培養(yǎng)液，每孔用200 μL XF檢測液清洗1次，去除XF檢測液后再加入175 μL新鮮檢測液，37 ℃孵育20 min。

藥物稀釋：選擇細胞線粒體應(yīng)激試劑盒，試劑盒中有寡霉素、解偶聯(lián)劑、抗霉素A和魚藤酮4種藥物，藥物濃度參考文獻[8-10]，實驗前每孔加入25 μL XF檢測液稀釋藥物[11]。檢測線粒體的基礎(chǔ)氧耗，然后在加藥孔A中加入寡霉素抑制有氧氧化的H+傳遞，測定OCR與基礎(chǔ)氧耗的差值，間接反映線粒體的ATP生成能力；在加藥孔B中加入解偶聯(lián)劑，測定線粒體最大呼吸能力和儲備的呼吸能力(最大呼吸能力與基礎(chǔ)氧耗的差值)；在加藥孔C中加入魚藤酮和抗霉素A抑制線粒體的氧化呼吸鏈，測定質(zhì)子漏(圖1)。加入寡霉素后的OCR與加入魚藤酮后的OCR差值即為非線粒體的氧耗，ATP生成能力與基礎(chǔ)氧耗的比值即為偶聯(lián)效率，最大呼吸能力與基礎(chǔ)氧耗的比值即為線粒體呼吸潛力。

圖1 線粒體OCR測定圖

血清實驗：HUVEC細胞懸液制備同上，調(diào)整細胞濃度為1×105/mL，在XF-96 V3聚苯乙烯細胞培養(yǎng)微孔板中加入80 μL細胞懸液，進行測試板水化、細胞換液等，分別使用含0.25%胎牛血清和無血清的培養(yǎng)基進行藥物稀釋，再分別加入濃度為2 μmol/L和5 μmol/L的解偶聯(lián)劑，分為血清+低解偶聯(lián)劑組、血清+高解偶聯(lián)劑組、無血清+低解偶聯(lián)劑組和無血清+高解偶聯(lián)劑組。

儀器設(shè)置：打開Seahorse XF-96和軟件，加載檢測模板或使用新的模板，設(shè)置循環(huán)數(shù)、檢測時間和藥物混合時間，修改保存路徑。

校正及檢測：點擊“Start”按鈕后，將測試版放入檢測儀中，儀器開始進行校正，10～15 min后儀器會自動彈出測試板，放入細胞板后儀器會按照預(yù)先設(shè)定的程序進行加藥、混合和檢測[8]。

1.3 觀察指標(biāo)

觀察不同濃度U87細胞和HUVEC細胞對線粒體OCR和ECAR的影響；比較不同濃度U87細胞和HUVEC細胞對基礎(chǔ)氧耗、儲備的呼吸能力、最大呼吸能力、非線粒體的氧耗、質(zhì)子漏、ATP生成能力、偶聯(lián)效率和線粒體呼吸潛力的影響以及兩種細胞上述指標(biāo)的差異；觀察血清對HUVEC細胞基礎(chǔ)氧耗、儲備的呼吸能力、最大呼吸能力、非線粒體的氧耗、質(zhì)子漏、ATP生成能力、偶聯(lián)效率和線粒體呼吸潛力的影響。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 細胞濃度對線粒體OCR和ECAR的影響

HUVEC細胞和U87細胞2 000組OCR顯著低于4 000組、6 000組和8 000組(P<0.01)；HUVEC細胞4 000組OCR與6 000組、6 000組與8 000組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，4 000組OCR顯著低于8 000組(P<0.01)；U87細胞4 000組OCR顯著低于6 000組和8 000組(P<0.01)，6 000組OCR與8 000組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖2。HUVEC細胞和U87細胞2 000組的ECAR顯著低于4 000組、6 000組和8 000組(P<0.01)，4 000組顯著低于6 000組和8 000組(P<0.01)；HUVEC細胞6 000組和8 000組ECAR比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；U87細胞6 000組ECAR顯著低于8 000組(P<0.01)，見圖3。

a:HUVEC細胞；b:U87細胞

a:HUVEC細胞；b:U87細胞

2.2 細胞濃度對線粒體功能的影響

在HUVEC細胞中，與2 000組比較，6 000組和8 000組的基礎(chǔ)氧耗、儲備的呼吸能力、ATP生成能力和最大呼吸能力顯著增強(P<0.05)，2 000組與4 000組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與2 000組比較，8 000組非線粒體的氧耗和質(zhì)子漏顯著增強(P<0.05)，4 000組及6 000組與2 000組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；線粒體的偶聯(lián)效率和線粒體呼吸潛力各組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖4。在U87細胞中，與2 000組比較，6 000組和8 000組的基礎(chǔ)氧耗、非線粒體的氧耗和最大呼吸能力顯著增強(P<0.05)，2 000組與4 000組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與2 000組比較，8 000組ATP生成能力、儲備的呼吸能力和質(zhì)子漏顯著增強(P<0.05)，4 000組及6 000組與2 000組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；線粒體的偶聯(lián)效率和線粒體呼吸潛力各組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖5。

*：與2 000組比較，P<0.05

*：與2 000組比較，P<0.05

2.3 不同濃度下兩種細胞線粒體功能的比較

HUVEC細胞和U87細胞2 000組、4 000組、6 000組的質(zhì)子漏比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，U87細胞8 000組的質(zhì)子漏顯著高于HUVEC細胞(P<0.05)；HUVEC細胞2 000組、6 000組和8 000組的偶聯(lián)效率顯著高于U87細胞(P<0.05)；HUVEC細胞6 000組的ATP生成能力和儲備的呼吸能力顯著高于U87細胞(P<0.05)；兩種細胞各組間基礎(chǔ)氧耗、最大呼吸能力、非線粒體的氧耗、線粒體呼吸潛力比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖6。

a：基礎(chǔ)氧耗；b：最大呼吸能力；c：質(zhì)子漏；d：非線粒體的氧耗；e：ATP生成能力；f：儲備的呼吸能力；g：偶聯(lián)效率；h：線粒體呼吸潛力1：HUVEC細胞；2：U87細胞；*：與HUVEC細胞比較，P<0.05圖6 不同細胞濃度下兩種細胞線粒體功能比較

2.4 血清對線粒體功能的影響

血清+低解偶聯(lián)劑組儲備的呼吸能力和線粒體呼吸潛力顯著高于無血清+低解偶聯(lián)劑組(P<0.05)，非線粒體的氧耗、基礎(chǔ)氧耗、最大呼吸能力、質(zhì)子漏、ATP生成能力、偶聯(lián)效率組間比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；血清+高解偶聯(lián)劑組和無血清+高解偶聯(lián)劑組的線粒體功能各指標(biāo)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖7。

1：無血清+低解偶聯(lián)劑組；2：血清+低解偶聯(lián)劑組；3：無血清+高解偶聯(lián)劑組；4：血清+高解偶聯(lián)劑組 *：與無血清+低解偶聯(lián)劑組比較，P<0.05圖7 血清對HUVEC細胞線粒體功能的影響

3 討論

以往研究僅單獨對U87細胞和HUVEC細胞的線粒體OCR和ECAR進行分析，未對兩種細胞進行比較。HUVEC細胞濃度有10 000/孔[12]、15 000/孔[13]、30 000/孔[14]，U87細胞濃度有12 000/孔[15]或(20 000～30 000)/孔[16]，不同研究結(jié)果差異較大。本研究對U87細胞和HUVEC細胞進行濃度優(yōu)化，結(jié)果顯示，隨著細胞濃度的升高，線粒體的呼吸功能增強；當(dāng)細胞濃度為2 000/孔時，HUVEC細胞、U87細胞的線粒體OCR和ECAR之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義，而當(dāng)細胞濃度為4 000/孔時，兩種細胞的OCR和ECAR之間存在顯著差異。這可能是由于細胞濃度過低容易使本身存在差異的數(shù)據(jù)被掩蓋，出現(xiàn)假陰性結(jié)果。本研究的OCR和ECAR都不高，在后續(xù)的實驗中，可以適當(dāng)提高細胞濃度，選擇8 000/孔或更高的細胞濃度，以期獲得更高的OCR和ECAR，更準(zhǔn)確地反映其對線粒體功能的影響。

細胞的線粒體OCR和ECAR分別反映了細胞的氧化磷酸化水平和糖酵解水平，不同細胞類型之間OCR差異較大，其代表著粒線體處于基礎(chǔ)狀態(tài)時的耗氧效率。有文獻報道，U87細胞的ECAR較高，OCR相對較低，僅為20～80 pmol·min-1[15]；而HUVEC細胞的OCR一般在50～200 pmol·min-1[13,17]。本研究結(jié)果顯示，各組基礎(chǔ)氧耗無統(tǒng)計學(xué)差異，且兩種細胞的OCR都低于文獻報道，這可能是由不同實驗所使用的細胞濃度不同所致。U87細胞的OCR較低可能是由腫瘤細胞的Warburg效應(yīng)導(dǎo)致，健康細胞依靠線粒體氧化糖類分子釋放能量，而腫瘤細胞產(chǎn)生能量的方式比較特別，大多數(shù)腫瘤細胞是通過產(chǎn)能率相對較低的糖酵解作用為自身供能，不需要氧氣及線粒體參與。因此，有學(xué)者推測這種變化的代謝是癌癥發(fā)生的根本原因[15]，對有氧代謝和糖酵解的調(diào)控也一直是癌癥研究的重點。癌細胞一般具有高耗氧能力，但其在低氧環(huán)境中仍然能夠生存，如高級別膠質(zhì)瘤，尤其是膠質(zhì)母細胞瘤，其特征是具有高速增殖的能力，U87細胞就是一種增殖速度相對較快的膠質(zhì)瘤細胞系。較高的ECAR提示糖酵解的增加，U87細胞的主要能量代謝途徑是糖酵解，而內(nèi)皮細胞的線粒體含量較低，也主要通過糖酵解氧化葡萄糖，但具體機制還需進一步研究加以驗證[18]。

本研究比較了HUVEC細胞和U87細胞在不同濃度時線粒體功能的變化，結(jié)果顯示，當(dāng)細胞濃度為2 000/孔、4 000/孔和6 000/孔時，兩種細胞的質(zhì)子漏無顯著差異，而當(dāng)細胞濃度升高到8 000/孔時，U87細胞的質(zhì)子漏顯著高于HUVEC細胞。解偶聯(lián)劑可破壞三磷酸腺苷合酶的合成，將其加入到細胞的線粒體中可產(chǎn)生典型的質(zhì)子漏。在生理情況下，線粒體質(zhì)子漏的發(fā)生使得氧化磷酸化得到最優(yōu)的偶聯(lián)系數(shù)，從而使產(chǎn)熱和氧化磷酸化這兩個對機體十分重要的過程達到精確的平衡[19]。質(zhì)子漏的耗氧對細胞呼吸具有很強的控制作用，同時質(zhì)子漏也是重要的產(chǎn)熱過程，且能引起線粒體內(nèi)膜通透性改變的物質(zhì)都可以影響質(zhì)子漏。因此，HUVEC細胞和U87細胞質(zhì)子漏的差異不僅與其本身的基礎(chǔ)代謝有關(guān)，也反映了線粒體內(nèi)膜通透性的差異。在實驗中，我們加入解偶聯(lián)劑用來測定細胞儲備的呼吸能力，其為評估線粒體儲備能力的一個極其穩(wěn)定的功能參數(shù)，可反映線粒體滿足超出基礎(chǔ)水平的額外能量需求的能力，以應(yīng)對急性細胞應(yīng)激或沉重的工作負荷，靈敏度高[20]。本研究結(jié)果顯示，U87細胞6 000組儲備的呼吸能力顯著低于HUVEC細胞，說明在應(yīng)激情況下，U87細胞額外能量需求的能力不如HUVEC細胞，這可能是由于糖酵解并不是腫瘤細胞所特有的代謝表型，想要探尋這種差異的原因還需要更深入的研究。

在以往的實驗中，為了防止細胞在無血清培養(yǎng)基中時間過長，往往會添加低濃度的血清為細胞提供營養(yǎng)，保持細胞活性，但血清的添加是否會對線粒體功能造成影響目前尚無相關(guān)文獻報道。本研究通過在配制的藥物中加入低濃度(0.25%)的血清，觀察其是否會影響線粒體的呼吸功能，結(jié)果顯示，血清僅對線粒體儲備的呼吸能力和線粒體呼吸潛力產(chǎn)生影響，其余的線粒體功能指標(biāo)未受影響，提示在測定線粒體呼吸功能時，血清對HUVEC細胞線粒體功能的影響較小，但在其他細胞中是否也有相似的結(jié)果還需進一步研究。此外，本研究中血清組和無血清組的線粒體功能在解偶聯(lián)劑為5 μmol/L時均無顯著性差異，說明當(dāng)達到一定濃度后，持續(xù)增加解偶聯(lián)劑的濃度不會增強線粒體的呼吸功能。

在熒光技術(shù)之前，線粒體呼吸功能測定主要利用Clark電極[21-23]，這種氧分壓測量的方法最為經(jīng)典。但Clark電極主要適用于非黏附的細胞，如循環(huán)造血細胞或一些懸浮的腫瘤細胞等，其分析成本較低，但存在以下缺點：所需的樣本量較大，在測定原代培養(yǎng)物、臨床樣品或干細胞時具有較大的限制；通量較低，一般只能檢測1～2個樣本；需要分離線粒體，不能直接進行檢測，且樣本檢測后不能用于其他實驗。而通過Seahorse XF-96，研究者能更快、更簡易地了解細胞以及線粒體如何運用不同的物質(zhì)作為能量來源，評估疾病與氧代謝和線粒體狀態(tài)之間的相互作用，分析代謝調(diào)節(jié)藥物的生理效應(yīng)，快速篩選出具有開發(fā)潛力的藥物及進行藥物毒性評估等。目前，Seahorse XF-96已被廣泛應(yīng)用于藥物篩選、藥物轉(zhuǎn)化、病理毒理、細胞生理、細胞代謝等熱門研究領(lǐng)域，是進行細胞活力評價、藥物藥效評估、線粒體功能和代謝疾病分析等的有效手段[5]。

本研究總結(jié)實驗的注意事項如下：①為保證結(jié)果的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性，建議每組設(shè)置3～4個復(fù)孔；以第1列和第12列作為空白和對照，防止邊緣效應(yīng)。②根據(jù)實驗設(shè)計，細胞培養(yǎng)板需要在實驗開始前提前準(zhǔn)備，細胞需加入細胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)過夜，如需額外加入藥物，需提前種植細胞。③檢測板上部帶有傳感器探針，熒光探針若失效會嚴重影響實驗結(jié)果，應(yīng)在有效期內(nèi)使用，使用后可置于-20 ℃保存6個月。為了建立穩(wěn)定、可靠的實驗方法，得到真實、可靠、可重復(fù)的實驗數(shù)據(jù)，在進行線粒體功能測定之前一定要查閱文獻，若文獻中沒有所研究的細胞系，需要在實驗開始前進行預(yù)實驗摸索，選擇合適的細胞濃度及解偶聯(lián)劑、寡霉素、魚藤酮和抗霉素A濃度，嚴格按照說明書進行實驗。

綜上所述，細胞濃度會影響線粒體OCR和ECAR，HUVEC細胞和U87細胞的質(zhì)子漏和偶聯(lián)效率存在顯著差異，在后續(xù)的實驗中，HUVEC細胞和U87細胞可選擇8 000/孔或更高的細胞濃度，解偶聯(lián)劑濃度使用2 μmol/L，在使用血清進行藥物稀釋時，充分考慮血清對線粒體功能的影響，以建立穩(wěn)定的檢測線粒體功能的方法。本研究對于藥物濃度的摸索、實驗條件的進一步優(yōu)化沒有過多涉及，有待在后續(xù)的實驗中進一步完善。