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        蝦青素保護(hù)AFB1 誘導(dǎo)AML12 細(xì)胞損傷的最適濃度篩選

        2022-05-07 06:49:30任欣慧姚強(qiáng)黃慶年朱彥彬王琳張?jiān)卢?/span>陳志寶
        關(guān)鍵詞:實(shí)驗(yàn)

        任欣慧 ,姚強(qiáng) ,黃慶年 ,朱彥彬 ,王琳 ,張?jiān)卢?,陳志寶

        (1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院,大慶 163319;2.中國(guó)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心;3.廣東海洋大學(xué)濱海農(nóng)業(yè)學(xué)院)

        近年來,隨著公眾對(duì)食品衛(wèi)生安全問題的關(guān)注,有關(guān)霉菌毒素污染的問題亟待解決。黃曲霉在自然界中是一種常見的腐生真菌[1],多見于發(fā)霉的花生,玉米,小麥,油菜籽等農(nóng)作物中[2],隨著畜牧業(yè)的迅猛發(fā)展,動(dòng)物飼料中也經(jīng)常能檢測(cè)到黃曲霉的存在。一般來說,長(zhǎng)期處于濕熱環(huán)境且營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富的食物更易被黃曲霉污染,且不易去除,滋生毒素危害健康。黃曲霉毒素(Aflatoxin,AFs)是黃曲霉等一系列霉菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物[3],其中AFB1 是已知黃曲霉毒素中毒性最強(qiáng)的物質(zhì),并且有著超強(qiáng)的致癌性,其毒性約為 HCN 的 10 倍,As2O3的 68 倍,致癌效應(yīng)約為 N,N-二甲基亞硝胺的 75 倍,1,2,3-三嗪-2,4,6-三胺的416 倍,奶黃油的900 倍[4],是目前研究最為廣泛且危害最強(qiáng)的一種真菌毒素[5]。AFB1 對(duì)人和動(dòng)物內(nèi)臟器官都有影響,尤其對(duì)于肝臟的破壞能力極強(qiáng),長(zhǎng)期低劑量的攝入AFB1 更會(huì)誘發(fā)肝癌的產(chǎn)生。有研究表明,AFB1 是引起肝臟壞死、空泡變性、脂肪變性、巨噬細(xì)胞增多和肝細(xì)胞雙核化等組織病理學(xué)改變的最強(qiáng)肝毒劑,此外,還觀察到膽管增生和門靜脈周圍纖維化[6]。隨著研究的不斷深入,霉菌毒素污染得到了初步的控制,但在玉米等農(nóng)作物、獸用飼料中檢測(cè)出AFB1 的新聞依舊屢見不鮮[7],因此,尋找有效手段干預(yù)AFB1 中毒已成為亟待解決的問題。

        據(jù)研究表明,AFB1 對(duì)肝臟細(xì)胞內(nèi)部會(huì)產(chǎn)生損傷,包括肝細(xì)胞的脂質(zhì)損傷和線粒體損傷,嚴(yán)重會(huì)導(dǎo)致肝癌,可以發(fā)現(xiàn),氧化應(yīng)激可能是AFB1 導(dǎo)致肝損傷的一個(gè)重要潛在致病因素[8]。另外曾有研究提出,通過在飼料中添加抗氧化劑來提高機(jī)體內(nèi)的抗氧化能力,可以緩解霉菌毒素造成的機(jī)體損傷[9]。因此我們推測(cè),強(qiáng)效抗氧化劑的應(yīng)用可以有效緩解AFB1 對(duì)機(jī)體造成的損傷。查閱大量資料后發(fā)現(xiàn),蝦青素(AST)作為一種脂溶性的物質(zhì),通常以蛋白質(zhì)、酯化、游離三種形式存在,是迄今為止發(fā)現(xiàn)的強(qiáng)勁的天然抗氧化劑。隨著對(duì)蝦青素研究的深入,越來越多的國(guó)家同意并批準(zhǔn)了蝦青素可在日常生活中使用,并且發(fā)現(xiàn),蝦青素的淬滅單線態(tài)氧的能力是其他抗氧化物無法比擬的[10]。蝦青素在進(jìn)入體內(nèi)后,會(huì)在組織中積累,并無毒性作用[11]。在大量的體外研究發(fā)現(xiàn),蝦青素的強(qiáng)抗氧化能力離不開其穩(wěn)定的膜結(jié)構(gòu),其分子的極性末端可以橫跨細(xì)胞膜,降低膜的通透性,由于提高了細(xì)胞膜的機(jī)械強(qiáng)度,使過氧化物啟動(dòng)子無法輕易的進(jìn)入胞內(nèi),從而緩解細(xì)胞的氧化損傷[12]。

        研究通過CCK-8 實(shí)驗(yàn)篩選蝦青素和AFB1 最適藥物濃度及時(shí)間,建立AFB1 誘導(dǎo)的AML12 細(xì)胞損傷模型,以此探究蝦青素預(yù)保護(hù)對(duì)于AFB1 誘導(dǎo)的AML12 損傷的保護(hù)作用,為后續(xù)研究打下基礎(chǔ)。

        1 材料和方法

        1.1 細(xì)胞

        AML12 小鼠肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞系,來自實(shí)驗(yàn)室保藏細(xì)胞,經(jīng)鑒定后使用。

        1.2 主要儀器試劑

        主要儀器:Thermo 二氧化碳恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱、水浴鍋、高速離心機(jī)、KQ-600DB 型超聲波破碎儀、ELx800 型酶標(biāo)儀、倒置顯微鏡、生物安全柜、96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板。

        主要試劑:蝦青素(批號(hào):0000091156,純度>97%,美國(guó) Sigma 公司),AFB1(批號(hào):2J1J17,純度>99%,Pribolab 公司),DMEM-F12 培養(yǎng)基(Hyclone 公司),100×青鏈霉素混合液、胰蛋白酶-EDTA 消化液、磷酸鹽緩沖液(Biosharp 公司),二甲基亞砜(Solarbio試劑公司),胎牛血清(Clark 公司),胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒(Gibco 公司),地塞米松(納川生物技術(shù)公司),CCK-8 試劑盒、臺(tái)盼藍(lán)溶液(Beyotime 公司)。

        1.3 試驗(yàn)方法

        1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)

        配制完全培養(yǎng)基,500 mL 的DMEM-F12 中內(nèi)包含地塞米松 40 ng·mL-1、10%的 FBS、1%的 ITS 以及1%的100×青鏈霉素混合液。取出液氮中凍存的AML12 細(xì)胞,37 ℃迅速融化,加入雙無培養(yǎng)基以取出凍存液,隨后將其接種至DMEM-F12 完全培養(yǎng)基中,放于培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng),溫度37 ℃、5%CO2。定時(shí)觀察細(xì)胞形態(tài),更換培養(yǎng)液,當(dāng)細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)至90%左右時(shí),進(jìn)行傳代,通過細(xì)胞計(jì)數(shù)使細(xì)胞密度保持在1×105個(gè)·mL-1,將細(xì)胞鋪至 96 孔細(xì)胞板中繼續(xù)培養(yǎng)。

        1.3.2 細(xì)胞分組

        將細(xì)胞分4 組:溶劑對(duì)照組(C 組)、藥物模型組 (AFB1 組,濃度梯度分 別為 0、5、10、15、20、40 μmol·L-1)、蝦青素組(AST 組,濃度梯度分別為 0、20、50、100、150、200 μmol·L-1)、蝦青素+黃曲霉毒素B (AST+AFB1 組,AST 的濃度梯度分別為 20、50、100、150、200 μmol·L-1,AFB1 濃度為 20 μmol·L-1)。C 組為0.01% DMSO 溶劑對(duì)照組。每個(gè)濃度梯度重復(fù)5 次。

        1.3.3 CCK-8 法檢測(cè)不同濃度時(shí)間AFB1 對(duì)AML12細(xì)胞影響

        參照“1.3.1”的步驟在96 孔板中進(jìn)行細(xì)胞的貼壁培養(yǎng),培養(yǎng)體系200 μL,培養(yǎng)箱中培養(yǎng)條件為溫度37 ℃、5% CO2。用 DMSO(細(xì)胞級(jí))溶解 AFB1 粉末,配置成1 mg·mL-1儲(chǔ)備液,臨用前用DMEM-F12 雙無培養(yǎng)基稀釋,配置成 0、5、10、15、20、40 μmol·L-1共6 個(gè)濃度梯度。

        觀察細(xì)胞形態(tài),達(dá)到試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)后,棄去96 孔板中殘留的培養(yǎng)基,用 PBS 清洗,隨后加入 0、5、10、15、20、40 μmol·L-1AFB1 的培養(yǎng)基,分別進(jìn)行 6、12、18、24 h 的處理。處理結(jié)束后,棄96 孔板中殘留的培養(yǎng)液,PBS 清洗兩次后,參照CCK-8 說明書進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。100 μL 的培養(yǎng)體系中加入 10 μL 的 CCK-8 溶液;200 μL 的培養(yǎng)體系中加入 20 μL 的 CCK-8 溶液,依照培養(yǎng)細(xì)胞的條件在培養(yǎng)箱內(nèi)再培養(yǎng)1~2 h。培養(yǎng)結(jié)束后用酶標(biāo)儀在450 nm 處測(cè)定吸光度,以溶劑對(duì)照組作為空白組,通過計(jì)算各組間吸光度的比值,來比較在不同時(shí)間下不同濃度的AFB1 藥物的刺激對(duì)于AML12 細(xì)胞存在怎樣的影響,確定AFB1 對(duì)細(xì)胞半數(shù)致死劑量。

        1.3.4 CCK-8 法檢測(cè)不同濃度蝦青素對(duì)AML12 細(xì)胞影響

        參照“1.3.1”的步驟進(jìn)行細(xì)胞貼壁培養(yǎng)。用DMSO(細(xì)胞級(jí))溶解蝦青素,配置成5 mg·mL-1的蝦青素儲(chǔ)備液,使用前用DMEM-F12 雙無培養(yǎng)液稀釋,配置成0、20、50、100、150、200 μmol·L-1共 6 個(gè)濃度梯度。

        觀察細(xì)胞形態(tài),達(dá)到試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)后,棄去96 孔板中殘留的培養(yǎng)基,用 PBS 清洗,隨后加入 0、20、50、100、150、200 μmol·L-1蝦青素的培養(yǎng)基。處理結(jié)束后,棄96 孔板中殘留的培養(yǎng)液,PBS 清洗兩次后,參照CCK-8 說明書進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。在加入CCK-8 溶液后,依照培養(yǎng)細(xì)胞的條件在培養(yǎng)箱內(nèi)再培養(yǎng)1~2 h。培養(yǎng)結(jié)束后用酶標(biāo)儀在450 nm 處測(cè)定吸光度,通過計(jì)算各組間的吸光度來判斷蝦青素對(duì)于AML12 細(xì)胞的影響,主要判斷蝦青素對(duì)細(xì)胞是否存在損傷,來確定蝦青素對(duì)AML12 細(xì)胞處理的安全濃度范圍。

        1.3.5 CCK-8 法篩選蝦青素、AFB1 最適濃度時(shí)間范圍

        依舊參照“1.3.1”的步驟進(jìn)行細(xì)胞貼壁培養(yǎng)。觀察細(xì)胞形態(tài),達(dá)到試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)后,棄去96 孔板中殘留的培養(yǎng)基,用 PBS 清洗,加入 20、50、100、150、200 μmol·L-1的不同濃度的蝦青素,分別對(duì)細(xì)胞進(jìn)行3、6、9、12 h 四個(gè)不同時(shí)間的培養(yǎng)。時(shí)間結(jié)束后,棄掉96 孔板中殘留培養(yǎng)液,PBS 洗兩次,再加入含有20 μmol·L-1AFB1 的培養(yǎng)液,按要求在培養(yǎng)箱內(nèi)再培養(yǎng)24 h,處理結(jié)束后,棄96 孔板中殘留培養(yǎng)液,參照CCK-8 說明書進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。在加入CCK-8 溶液后,依照培養(yǎng)細(xì)胞的條件在培養(yǎng)箱內(nèi)再培養(yǎng)1~2 h。培養(yǎng)結(jié)束后用酶標(biāo)儀在450 nm 處測(cè)定吸光度,以觀察AFB1 對(duì)AML12 細(xì)胞的損傷是否會(huì)因?yàn)槲r青素的預(yù)保護(hù)得到緩解,根據(jù)吸光度來確定最佳處理濃度范圍及時(shí)間。

        1.3.6 數(shù)據(jù)分析

        將收集的數(shù)據(jù)進(jìn)行初步整理后使用SPSS 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析,采用Duncan's 法對(duì)各處理組進(jìn)行多重比較分析,對(duì)符合樣本運(yùn)用GraphPad Prism 5 軟件測(cè)試正態(tài)性,單因素方差分析。整理數(shù)據(jù),匯成柱狀圖,以便查看。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 不同濃度時(shí)間AFB1 對(duì)AML12 細(xì)胞影響

        對(duì) AML12 細(xì)胞進(jìn)行 0、5、10、15、20、40 μmol·L-1不同濃度及 6、12、18、24 h 不同時(shí)間的 AFB1 作用于細(xì)胞,通過測(cè)定各組吸光度值,來計(jì)算AML12 細(xì)胞活力。結(jié)果如圖1 所示:隨著各組用藥濃度的增加,各處理時(shí)間下的細(xì)胞活性呈現(xiàn)出下降趨勢(shì)。AFB1 濃度為 10、15、20、40 μmol·L-1作用 6、12、18 h 后,細(xì)胞數(shù)量呈劑量依賴性下降趨勢(shì)(P<0.05)。在藥物作用24 h 后,5、10、15、20、40 μmol·L-1濃度下對(duì)細(xì)胞都有明顯的抑制作用(P<0.05),這種趨勢(shì)在 20 μmol·L-1作用24 h 后逐漸趨于平緩。在經(jīng)過CCK-8 檢測(cè)得到OD 值后,經(jīng)過換算得到AFB1 對(duì)細(xì)胞的半數(shù)致死量濃度為 20 μmol·L-1。因此確定 24 h、濃度為 20 μmol·L-1的AFB1 作為實(shí)驗(yàn)的最佳條件。

        圖1 不同濃度時(shí)間AFB1 對(duì)AML12 細(xì)胞影響Fig.1 The effect of AFB1 at different concentration and time on AML12

        2.2 不同濃度蝦青素對(duì)AML12 細(xì)胞影響

        為了篩選出蝦青素對(duì)AML12 細(xì)胞的安全濃度范圍,用不同濃度梯度的蝦青素對(duì)AML12 細(xì)胞進(jìn)行刺激,濃度分別為:0、20、50、100、150、200 μmol·L-1的蝦青素,作用于細(xì)胞24 h。通過CCK-8 法測(cè)定AML12 細(xì)胞活力變化。從結(jié)果可以看出,與未加入蝦青素的對(duì)照組比較,蝦青素的劑量在20、50、100、150 μmol·L-1時(shí),細(xì)胞活性未見明顯的變化,這說明在150 μmol·L-1范圍前濃度梯度的蝦青素對(duì)細(xì)胞沒有明顯的損傷。而在200 μmol·L-1的濃度作用時(shí),細(xì)胞數(shù)量有所降低,這說明200 μmol·L-1的蝦青素對(duì)AML12 細(xì)胞的生長(zhǎng)有一定的抑制作用,為了排除藥物對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生損傷,最終將藥物篩選的劑量范圍控制在 150 μmol·L-1以內(nèi)較為安全。

        2.3 蝦青素、AFB1 最適濃度時(shí)間范圍

        前期實(shí)驗(yàn)確定了建立細(xì)胞模型中AFB1 最佳刺激濃度及時(shí)間,以及相對(duì)安全的蝦青素濃度范圍,為了進(jìn)一步確定蝦青素對(duì)AFB1 誘導(dǎo)的AML12 細(xì)胞的劑量,進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。為了篩選蝦青素保護(hù)AFB1 誘導(dǎo)AML12 細(xì)胞損傷的劑量梯度及保護(hù)時(shí)間,在用0、20、50、100、150 μmol·L-1的蝦青素刺激細(xì)胞 3、6、9、12 h 后,加入 20 μmol·L-1的 AFB1 培養(yǎng) 24 h。通過CCK-8 法測(cè)定細(xì)胞活力變化。從結(jié)果可以看出,在蝦青素預(yù)保護(hù)的細(xì)胞中,AFB1 對(duì)于AML12 細(xì)胞的抑制作用得到了明顯的改善。蝦青素預(yù)保護(hù)3、6 h 時(shí),細(xì)胞活性呈劑量依賴性的增長(zhǎng)(P<0.05);蝦青素預(yù)保護(hù) 9、12 h 后,這種增長(zhǎng)在蝦青素濃度為 150 μmol·L-1時(shí)有降低,且在蝦青素預(yù)保護(hù)9 h 后組間差異明顯增加。綜合以上考慮,最終確定蝦青素預(yù)保護(hù)AFB1 誘導(dǎo)的AML12 細(xì)胞的時(shí)間為3 h,劑量梯度為20、50、100 μmol·L-1。

        圖2 不同濃度蝦青素對(duì)AML12 細(xì)胞影響Fig.2 The effect of AST at different concentration on AML12

        3 討論與結(jié)論

        AFB1 在動(dòng)物飼料中存在十分廣泛,對(duì)畜牧業(yè)生產(chǎn)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。日常生活中,也經(jīng)常能看到在玉米、花生等農(nóng)作物中檢測(cè)出黃曲霉毒素的新聞,這一切對(duì)人類和動(dòng)物健康都有著非常大的威脅。通過整理對(duì)AFB1 的理化性質(zhì)發(fā)現(xiàn),其在污染的食物和飼料中性質(zhì)十分穩(wěn)定,耐高溫、耐酸且不溶于水,存放20 年之久依舊可以檢出[13]。不難看出,想要徹底清除AFB1 是一項(xiàng)困難艱巨的任務(wù)。在通過對(duì)流行病學(xué)進(jìn)行研究整理后發(fā)現(xiàn),AFB1 是造成肝癌發(fā)生的一大罪魁禍?zhǔn)譡14-15],因?yàn)楦闻K是AFB1 進(jìn)入人體后最主要的靶器官,長(zhǎng)期低劑量的暴露在AFB1 中會(huì)引起肝臟膽小管增生、脂肪變性等病癥,甚至發(fā)生癌變[16]。機(jī)體在攝入AFB1 后,進(jìn)行第一關(guān)卡效應(yīng),經(jīng)由消化道的十二指腸進(jìn)行吸收,進(jìn)入肝臟后,再由肝細(xì)胞相關(guān)代謝酶將其轉(zhuǎn)化為AFB1-8,9 環(huán)氧化物,即AFBO,是AFB1 造成機(jī)體紊亂甚至致癌作用中最主要的原因[17]。為了盡可能的模擬AFB1 在體外吸收代謝的環(huán)境,實(shí)驗(yàn)中選擇AML12 小鼠肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞系作為實(shí)驗(yàn)體,利用藥物對(duì)AML12 小鼠肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行刺激,研究結(jié)果與預(yù)期一致,AFB1 對(duì)細(xì)胞造成了損傷,在5、10、15、20、40 μmol·L-1的 AFB1 作用不同時(shí)間時(shí)對(duì)AML12 細(xì)胞都有不同程度的抑制作用,并在20 μmol·L-1作用 24 h 時(shí)達(dá)到半數(shù)致死量,從而證實(shí)了后續(xù)實(shí)驗(yàn)的可行性。

        圖3 蝦青素、AFB1 最適濃度時(shí)間范圍Fig.3 Optimal concentration time range of AST and AFB1

        有研究證實(shí),AFB1 會(huì)參與機(jī)體內(nèi)部的代謝過程,并在此過程中通過引發(fā)肝細(xì)胞的氧化應(yīng)激[18],使機(jī)體受到氧化應(yīng)激產(chǎn)生的大量ROS 的刺激,引起機(jī)體損傷。根據(jù)Chen 等[19]的研究發(fā)現(xiàn),在AFB1 誘導(dǎo)的毒性中,氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡可能是發(fā)揮關(guān)鍵性作用的原因,AFB1 的促氧化能力在一定程度上加強(qiáng)了其毒性能力。由此做出推斷,抗氧化物的應(yīng)用可以緩解甚至抑制AFB1 誘發(fā)的肝毒性,尤其是自然界中的天然抗氧化產(chǎn)物。

        在20 世紀(jì)80 年代,科學(xué)家們對(duì)蝦青素生理功能的研究逐漸深入,從此蝦青素作為自然界中最強(qiáng)的抗氧化物出現(xiàn)在大眾面前。石麗麗等[20]對(duì)蝦青素進(jìn)行了毒理學(xué)安全性評(píng)價(jià),從一系列的毒理學(xué)評(píng)價(jià)試驗(yàn)結(jié)果來看,蝦青素對(duì)于機(jī)體無明顯的毒副作用。在通過利用不同濃度蝦青素對(duì)AML12 細(xì)胞進(jìn)行刺激后,蝦青素對(duì)于細(xì)胞的影響的雙向的,適當(dāng)?shù)乃幬餄舛群吞幚頃r(shí)間,會(huì)促進(jìn)AML12 細(xì)胞增殖,濃度不超過150 μmol·L-1的蝦青素對(duì)細(xì)胞無明顯毒副作用;而在蝦青素濃度為 200 μmol·L-1時(shí),對(duì) AML12 細(xì)胞增殖有一定的抑制作用,藥物濃度過大對(duì)細(xì)胞仍會(huì)造成部分損傷。但 150 μmol·L-1到 200 μmol·L-1濃度之間的蝦青素是否有影響尚未可知,還需要進(jìn)一步的探究。對(duì)比來看,體外實(shí)驗(yàn)只能作為體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的前期基礎(chǔ),更精準(zhǔn)的結(jié)果必須進(jìn)行一定量的體內(nèi)實(shí)驗(yàn),才能更為準(zhǔn)確。

        蝦青素作為天然的抗氧化劑,安全綠色無公害,比目前絕大多數(shù)抗氧化劑都有優(yōu)勢(shì)[21]。通過利用蝦青素對(duì)細(xì)胞進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)蝦青素的抗氧化作用增強(qiáng)了細(xì)胞整體的抗氧化能力,對(duì)氧化應(yīng)激生成的大量ROS 有一定的抑制作用,以此來減輕自由基所造成的損傷[22-23]。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出結(jié)論,蝦青素能夠細(xì)胞以減輕AFB1 造成的損傷。在不同濃度及時(shí)間的蝦青素預(yù)處理AML12 細(xì)胞后,再利用20 μmol·L-1的AFB1 刺激24 h,可以看出細(xì)胞存活率有了明顯的上升,因此將最適藥物濃度篩選實(shí)驗(yàn)中蝦青素濃度設(shè)置為 20、50、100 μmol·L-1。CCK-8 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,AFB1 組的細(xì)胞OD 值低于AST+AFB1 處理組,證明了蝦青素可以保護(hù)細(xì)胞因AFB1 造成的損傷,為今后研究提供了理論支持。

        綜上所述,AFB1 的半數(shù)致死量為 20 μmol·L-1,作用時(shí)間 24 h;20、50、100 μmol·L-1的蝦青素預(yù)處理細(xì)胞3 h 后,可以較好的保護(hù)AFB1 誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷,這為今后進(jìn)一步研究蝦青素用于預(yù)防AFB1 所致的肝損傷打下了基礎(chǔ)。

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