王敬紅 ，李靈靈 ，申貴男 ，2，袁媛 ，2，曹迪 ，高亞梅 ，晏磊 ，2，王偉東 ，2

（1.黑龍江省寒區(qū)環(huán)境微生物與農(nóng)業(yè)廢棄物資源利用重點實驗室/黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，大慶 163319；2.糧食副產(chǎn)物加工與利用教育部工程中心）

我國是農(nóng)業(yè)大國，每年產(chǎn)出近9 億t 農(nóng)作物秸稈，這些農(nóng)業(yè)廢棄物一般被用沼氣發(fā)酵、堆肥、造紙等而實現(xiàn)其循環(huán)利用[1-4]。但在秸稈資源化過程中遇到了很多困難，主要原因之一便是木質(zhì)素的存在，在高等植物細(xì)胞壁的維管組織中，木質(zhì)素與半纖維素和纖維素的纖絲通過共價鍵與非共價鍵緊密纏繞相互嵌合，形成秸稈的主要成分木質(zhì)纖維素[5]。木質(zhì)素在外層的保護(hù)，嚴(yán)重阻礙了木質(zhì)纖維素的高值化利用[6]。

處理農(nóng)業(yè)廢棄物中木質(zhì)素的方式有很多，例如物理處理、化學(xué)處理、生物處理等[7-9]。其中，生物處理可以在較為溫和的溫度和壓力下降解木質(zhì)素，其低能量消耗和環(huán)境友好的特點使其成為研究熱點[10-11]。在降解木質(zhì)素的微生物中，真菌能力更強(qiáng)[12]。而在眾多能夠降解木質(zhì)素的真菌中，腐生真菌被認(rèn)為是唯一可以完全礦化木質(zhì)素的真菌，白腐真菌作為腐生真菌的一種，一直是木質(zhì)素降解研究的重點。真菌對木質(zhì)素的降解主要依賴于其產(chǎn)生的木質(zhì)素酶，白腐真菌能夠產(chǎn)生漆酶（Laccase，Lac）和錳過氧化物酶（Manganese perxidases，Mnp），少數(shù)還能產(chǎn)生木質(zhì)素過氧化物酶（Lignin peroxidases，Lip），是最有效的木質(zhì)素降解微生物[13-14]。但單一菌株的產(chǎn)酶能力有限，研究者發(fā)現(xiàn)利用多種微生物共同作用，可以提升產(chǎn)酶能力[15]。Teddy 等[16]對 T.polyzona、A.niger、T.longibrachiatum、M.circinelloides 和 R.microsporus 四種真菌共培養(yǎng)后木質(zhì)素降解酶產(chǎn)量以及相關(guān)物質(zhì)的降解能力進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)漆酶、錳過氧化物酶和木質(zhì)素過氧化物酶的產(chǎn)量都較多。李會宣等[17]研究了白腐真菌 P-6（Pleurotus ostreatus）和 P-9（Lentinus edodes）共培養(yǎng)對玉米秸稈的降解以及木質(zhì)素酶酶活力影響，發(fā)現(xiàn)共培養(yǎng)的降解效果和酶活力顯著高于任意一株純培養(yǎng)菌株。

Lac 是一種存在于植物、真菌、細(xì)菌和昆蟲體內(nèi)的多銅酶，真菌產(chǎn)生的Lac 被認(rèn)為是自然環(huán)境中木質(zhì)素分解的重要一環(huán)，所有漆酶都使用分子氧作為電子受體，氧化多種芳香族化合物，包括木質(zhì)素中常見的酚類部分、芳香胺、苯甲硫醇和羥基吲哚。Mnp最早于30 多年前就已在金黃色葡萄球菌中發(fā)現(xiàn)，它是幾乎所有定植于木材的擔(dān)子菌（包括白腐菌和各種定植于土壤的真菌）產(chǎn)生和分泌的最常見的木質(zhì)素修飾過氧化物酶。Lip 最早在黃孢原毛平革菌中發(fā)現(xiàn)，隨后在變色栓菌等著名白腐真菌中都有發(fā)現(xiàn)，已知LiP 會氧化不同的酚類芳香族化合物，各種非酚類木質(zhì)素模型化合物與許多其他有機(jī)分子一起氧化[18-19]。

研究表明，真菌Lac 既具有聚合作用（黑色素合成和子實體形成），也具有解聚合作用（木質(zhì)素降解），真菌漆酶的這種雙功能可以歸因于同一屬和不同種內(nèi)的多種亞型的存在，而通過調(diào)控培養(yǎng)條件，這些具有不同誘導(dǎo)模式和獨特生化特性的亞型可以被表達(dá)或過度表達(dá)[20]。周玥等[21]通過調(diào)節(jié)基質(zhì)成分，實現(xiàn)了Mnp 的大量表達(dá)；P.Nayana 等[22]通過優(yōu)化培養(yǎng)條件及添加劑等，使Lip 酶活增加40 倍?？梢?，對微生物培養(yǎng)基成分等培養(yǎng)條件的優(yōu)化，將有效提升木質(zhì)素降解酶的活性。

實驗室前期利用 BYL-3 （Trametes hirsuta）、BYL-7 （Trametes versicolor）[23]和 BYL-8（Trametes hirsuta）三株白腐真菌，構(gòu)建了一個木質(zhì)素降解真菌菌群LDFC，實驗在前期基礎(chǔ)上對木質(zhì)素降解真菌菌群LDFC 進(jìn)行了產(chǎn)酶條件的優(yōu)化，主要從碳源種類、氮源種類、Cu2+濃度、Mn2+濃度和誘導(dǎo)劑種類五個方面進(jìn)行，為木質(zhì)素的降解提供更加優(yōu)質(zhì)的微生物資源。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

菌株BYL-3、BYL-7 和BYL-8 由黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院寒區(qū)環(huán)境微生物與農(nóng)業(yè)廢棄物資源化利用重點實驗室提供，NCBI 登錄號分別為 MT360648、MN947224 和 MT360649。

1.1.2 培養(yǎng)基

PDA 培養(yǎng)基（液體培養(yǎng)基不加瓊脂）：去皮馬鈴薯 200.0 g，葡萄糖 20.0 g，KH2PO43.0 g，MgSO4·7H2O 1.5 g，瓊脂 15.0 g，蒸餾水 1000 mL，pH 自然。

初始產(chǎn)酶培養(yǎng)基：KH2PO42.0 g、（NH）42SO42.0 g、MgSO·47H2O 0.3 g、水稻秸稈粉6.0 g，蒸餾水1 000 mL，pH 6.0。

1.1.3 主要試劑、儀器與設(shè)備

葡萄糖、酵母粉、蛋白胨：天津市祥瑞鑫化工科技有限公司；愈創(chuàng)木酚、堿性木質(zhì)素：上海麥克林生化科技有限公司；苯胺藍(lán)：天津市魯鑫化工科技有限公司；木質(zhì)素：BOSF 公司 M0010。

EX224 萬位天平：美國 Ohaus 公司；S010 微型pH 計：日本 Horiba 公司；HPS-280 生化培養(yǎng)箱、HZQ-C 恒溫振蕩器：哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司；TU-1901 紫外分光光度計：中國北京普析通用儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌群LDFC 的活化

將實驗室前期篩選的3 株真菌BYL-3、BYL-7和BYL-8 在PDA 培養(yǎng)基上30 ℃培養(yǎng)5 d，用打孔器取直徑8 mm 的所篩真菌菌落3 塊置于含有PDA 液體培養(yǎng)基的錐形瓶中，各單菌在30 ℃、120 r·min-1條件下培養(yǎng)3 d 后，采用平板計數(shù)法計算菌落數(shù)，當(dāng)菌液濃度達(dá)到106~107CFU·mL-1時，孢子菌懸液配制完成。將三種真菌的孢子菌懸液接種量按照1∶1∶1 進(jìn)行配比制備菌群LDFC 的孢子菌懸液取出。以下試驗不作特殊說明，接種量的孢子菌懸液濃度均為106~107CFU·mL-1，接菌量為 3.0%（v·v-1）。

1.2.2 產(chǎn)酶條件優(yōu)化

在初始產(chǎn)酶培養(yǎng)基中分別添加濃度為5.0 g·L-1的麥芽糖（maltose）、葡萄糖（D-glucose）、蔗糖（sucrose）、淀粉 （starch）、乳糖 （lactose）、木質(zhì)素（lignin）以及濃度為0.15 mol·L-1的甘油（按克數(shù)折算成摩爾濃度）。將孢子菌懸液按3.0%（v·v-1）接種量接入已滅菌的裝有產(chǎn)酶培養(yǎng)基的錐形瓶內(nèi)，初始pH調(diào)節(jié)為 6.0，在 30 ℃、120 r·min-1的條件下培養(yǎng)，第 4天測定 Lac 酶活、第 6 天測定 Lip 和 Mnp 酶活。3 次重復(fù)，以原初始產(chǎn)酶培養(yǎng)基作為空白對照，確定最適碳源。同樣的培養(yǎng)條件依次試驗氮源（初始產(chǎn)酶培養(yǎng)基為基礎(chǔ)去除硫酸銨 （Ammonium sulphate，AS），再分別添加濃度為2 g·L-1硝酸銨（Ammonium nitrate，AN）、酒石酸銨 （Ammonium tartrate，AT）、硝酸鈉（Sodium nitrate，SN）、氯化銨 （Ammonium chloride，AC）、酵母粉（Yeast extract，YE）、尿素（Urea）、蛋白胨（Peptone））、金屬離子濃度（以初始產(chǎn)酶培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，再分別添加 Cu2+（CuSO4·5H2O）濃度分別為0、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mmol·L-1和Mn2（+MnSO4·H2O）濃度分別為 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol·L-1）、誘導(dǎo)劑（用滅菌冷卻的蒸餾水分別將誘導(dǎo)劑愈創(chuàng)木酚（guaiacol）、ABTS、藜蘆醇 （veratryl alcohol）、吐溫-80（Tween-80）、苯胺藍(lán)（aniline blue）調(diào)節(jié)最終濃度均為 0.5 mmol·L-1）對菌群 LDFC 產(chǎn)酶的影響。

1.2.3 酶活測定方法

將1.2.2 取得的粗酶液分別吸取1.5 mL 于2 mL無菌 EP 管，12 000 r·min-1離心 10 min 取上清，上清液即酶液，采用2，2'-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（2，2'-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid），ABTS）法[24]測定 Lac 活性；參照池玉杰[25]的方法測定Lip 活性；參照Kuwahara[26]的方法測定Mnp 活性，設(shè)置3 個平行樣品，取平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 碳源對真菌菌群LDFC 木質(zhì)素降解酶活性的影響

由圖 1 可知，Lac、Lip 和 Mnp 在氮源選擇上呈現(xiàn)出的變化是同步的。以蔗糖、淀粉為碳源時，三種酶的酶活性皆比對照出現(xiàn)明顯的下降，Lac 酶活達(dá)不到對照組的1/2；以木質(zhì)素、乳糖、甘油為碳源時，Lac、Lip、Mnp 酶活相對于對照組存在小幅度提高，其中Lac 酶活提高較為明顯；以葡萄糖為碳源時，Lac、Lip、Mnp 酶活均明顯高于對照組，其中Mnp 酶活提高最為明顯；當(dāng)以麥芽糖為碳源時，Lac、Lip、Mnp 酶活均最高，Lac 酶活為 667.9 U·L-1，比對照組（279.4 U·L-1）提高 139.0%；Lip 酶活為 1 213.3 U·L-1，比對照組（981.6 U·L-1）提高 23.6%；Mnp 酶活為 1 967.3 U·L-1，比對照組（1 270.5 U·L-1）提高54.8%。

圖1 碳源對LDFC 木質(zhì)素降解酶活性的影響Fig.1 Effect of carbon sources on lignin degradation enzyme activity of LDFC

2.2 氮源對菌群LDFC 木質(zhì)素降解酶活性的影響

由圖2 可知，氮源種類對Lac、Lip 和Mnp 活性的影響趨勢相似。當(dāng)以硝酸鈉為氮源時，Lac、Lip、Mnp 酶活均最高，Lac 酶活為 634.5U·L-1，比對照組（279.4 U·L-1）提高 127.1%；Lip 酶活為 1 421.3 U·L-1，比對照組（981.6 U·L-1） 提高 44.8%；Mnp 酶活為2 585.6 U·L-1，比對照組 （1 270.5 U·L-1） 提高103.5%。當(dāng)?shù)礊榫剖徜@時，Lac、Lip、Mnp 酶活僅次于硝酸鈉為氮源所對應(yīng)的酶活。當(dāng)以硝酸銨、尿素和蛋白胨為氮源時，Lac、Lip、Mnp 酶活相對于對照組均有所提高，但提高幅度不大。當(dāng)以酵母粉和氯化銨為氮源時，Lac、Lip、Mnp 酶活相對于對照組均有所降低。

圖2 氮源對LDFC 木質(zhì)素降解酶活性的影響Fig.2 Effect of nitrogen sources on lignin degradation enzyme activity of LDFC

2.3 Cu2+和M2+濃度對真菌菌群LDFC 木質(zhì)素降解酶活性的影響

菌群Lac 酶活相比Lip 和Mnp 酶活較低，由于Lac 是銅類氧化酶，適宜濃度的Cu2+能夠最大程度提高Lac 的產(chǎn)生。由圖3（A）可知，當(dāng)添加Cu2+濃度為1.5 mmol·L-1時，Lac、Lip 和 Mnp 酶活均最高，Lac 酶活為 327.6 U·L-1，比未添加（160.4 U·L-1）提高 104.2%；Lip 酶活為 1 012.9 U·L-1，比未添加（831.6 U·L-1）提高 21.8%；Mnp 酶活為 1 310.4 U·L-1，比未添加（1 035.5 U·L-1）提高26.5%，當(dāng)添加Cu2+濃度超過1.5 mmol·L-1，Lac、Lip 和 Mnp 酶活均呈現(xiàn)出明顯下降趨勢。

菌群木質(zhì)素降解酶中由于Mn2+位于Mnp 蛋白的活性位點上，會影響酶基因的表達(dá)轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而影響Mnp 的生成。由圖3（B）可知，當(dāng)添加Mn2+濃度為0.2 mmol·L-1時，Lac、Lip 和 Mnp 酶活均最高，Lac 酶活為 273.9 U·L-1，比未添加（243.5 U·L-1）提高 12.5%；Lip 酶活為 1 011.4 U·L-1，比未添加（882.4 U·L-1）提高 14.6%；Mnp 酶活為 1 414.8 U·L-1，比未添加（670.6 U·L-1） 提高 111.0%，當(dāng) Mn2+濃度超過0.2 mmol·L-1時，3 種酶酶活均開始下降，但 Mnp 活性在Mn2+濃度為 0.2~0.6 mmol·L-1呈現(xiàn)顯著下降，相較而言，Lac 和Lip 則呈現(xiàn)小幅度下降。

圖3 Cu2+（A）和Mn2+（B）濃度對LDFC 木質(zhì)素降解酶活性的影響Fig.3 Effect of Cu2+（A）and Mn2+（B）concentration on lignin degradation enzyme

2.4 誘導(dǎo)劑對真菌菌群LDFC 木質(zhì)素降解酶活性的影響

研究發(fā)現(xiàn)，添加與木質(zhì)素結(jié)構(gòu)相似的酚類和芳香族化合物作為誘導(dǎo)劑可以提高木質(zhì)素降解酶的活性。由圖4 可知，添加適宜濃度的誘導(dǎo)劑均能提高木質(zhì)素降解酶活性。當(dāng)加入ABTS 和愈創(chuàng)木酚為誘導(dǎo)劑時，Lac 酶活提 升 較 大 ，Lac 酶 活 分別 為 609.2、476.1U·L-1，比對照組（279.4 U·L-1）分別提高118.0%、70.4%。當(dāng)加入愈創(chuàng)木酚和白藜蘆醇為誘導(dǎo)劑時，Lip酶活提升最大，Lip 酶活分別為 1 178.9、1 345.8 U·L-1，比對照組（981.6 U·L-1）分別提高 20.1%、37.1%。當(dāng)加ABTS 為誘導(dǎo)劑時，Mnp 酶活提升最大，Mnp 酶活為1 814.3 U·L-1，比對照組（1 270.5 U·L-1）提高 42.8%；當(dāng)加入愈創(chuàng)木酚、白藜蘆醇和苯胺藍(lán)為誘導(dǎo)劑時，對Mnp 酶活影響差別不大，Mnp 酶活分別為1 412.6、1 397.6、1 386.7 U·L-1，比對照組（1 270.5 U·L-1）分別提高11.2%、10.0%、9.1%。當(dāng)以苯胺藍(lán)和吐溫-80 為誘導(dǎo)劑時，Lac、Lip、Mnp 酶活相對于對照組均呈現(xiàn)較小幅度提升。

圖4 誘導(dǎo)劑對LDFC 木質(zhì)素降解酶活性的影響Fig.4 Effect of inducer on lignin degradation enzyme activity of LDFC

2.5 最優(yōu)條件酶活性

通過對影響菌群LDFC 木質(zhì)素降解酶酶活因素的研究，初步確定了菌群LDFC 最佳產(chǎn)酶條件為：添加麥芽糖為復(fù)合碳源，硝酸鈉為氮源，Cu2+濃度為1.5 mmol·L-1，Mn2+濃度為 0.2 mmol·L-1，ABTS 為誘導(dǎo)劑。由圖5 可知，在上述條件下測定菌群Lac、Lip、Mnp 酶活，分別為 678.3、1 463.6、2 667.8 U·L-1，優(yōu)化前 3 種酶酶活分別為 279.4、981.5、1 270.5 U·L-1。相比于優(yōu)化前，Lac、Lip、Mnp 酶活分別提高 142.8%、49.0%、110.0%。

圖5 優(yōu)化前后木質(zhì)素降解酶活性變化Fig.5 Changes of lignin degrading enzyme activity before and after optimization

3 討論

木質(zhì)素降解酶對農(nóng)業(yè)廢棄物具有重要的分解作用，通過對菌群培養(yǎng)條件的優(yōu)化可以有效提升其木質(zhì)素降解酶活性[27]，菌群中各個菌株在降解初期因生長較慢，往往需要補(bǔ)加一些碳源促進(jìn)菌株的繁殖，通過增大微生物生物量來提高木質(zhì)素降解酶活力，但同樣的，有時也會存在碳源抑制的情況。Wang 等[28]發(fā)現(xiàn)，添加葡萄糖會抑制木聚糖酶的表達(dá)。而在實驗中，當(dāng)以蔗糖、淀粉可能出現(xiàn)了酶活性下降的情況，可能同樣存在抑制。Mariane 等[29]研究發(fā)現(xiàn)，在真菌培養(yǎng)時添加麥芽糖或葡萄糖可有效提升其生長速度。在研究中，當(dāng)以麥芽糖和葡萄糖為碳源時，三種酶的酶活都出現(xiàn)上調(diào)，這可能是其促進(jìn)了真菌的生長。

菌群生長需要氮源，氮是合成氨基酸和核酸所必須的，適宜的氮源同樣能有效提高酶活[30]。研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)以硝酸鈉為氮源時，三種酶的酶活上調(diào)最為明顯；Kannaiyan 等[31]在對白腐真菌Dichomitus squalens和Ceriporiopsis subvermispora 共培養(yǎng)，進(jìn)行培養(yǎng)基優(yōu)化時發(fā)現(xiàn)，以硝酸鈉為氮源可以提升產(chǎn)酶，這與實驗結(jié)果一致。菌群Lac 酶活相比Lip 和Mnp 酶活相對較低，由于Lac 是銅類氧化酶，適宜濃度的Cu2+能夠促進(jìn)Lac 的產(chǎn)生。孫榮等[32]通過研究添加Cu2+濃度對菌株產(chǎn)漆酶能力影響時發(fā)現(xiàn)，當(dāng)Cu2+濃度為1.5 mmol·L-1時，產(chǎn)漆酶能力最強(qiáng)，這與實驗研究結(jié)果一致。菌群木質(zhì)素降解酶中由于Mn2+位于Mnp 蛋白的活性位點上，會影響酶基因的表達(dá)轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而影響Mnp 的生成，研究結(jié)果表明，當(dāng)添加Mn2+濃度為0.2 mmol·L-1時，對菌群酶的表達(dá)最有利，繼續(xù)增高離子濃度反而會抑制酶活性。

添加與木質(zhì)素結(jié)構(gòu)相似的酚類和芳香族化合物作為誘導(dǎo)劑可以提高木質(zhì)素降解酶的活性。ABTS 是漆酶的重要底物，研究發(fā)現(xiàn)ABTS 可以促進(jìn)木質(zhì)素的降解[33]。在研究中，添加ABTS 作為誘導(dǎo)劑，三種酶酶活性得到顯著提高。Lac、Lip 和Mnp 分別在造紙、化妝品、褐煤生物降解等方面具有較好的應(yīng)用前景，菌群產(chǎn)酶活性的提升可提高菌群的可利用性。Vibha[34]將Trametes hirsuta 和Phanerochaete sp.混合培養(yǎng)，通過優(yōu)化溫度、pH、碳源等，優(yōu)化后第7 d，共培養(yǎng)菌群Lac 酶活最大為250.0 U·L-1，比優(yōu)化前提高220.5%。研究對菌群LDFC 產(chǎn)酶培養(yǎng)基中碳源、氮源、誘導(dǎo)劑等成分進(jìn)行優(yōu)化。優(yōu)化后Lac 活性在第4 d 達(dá)到峰值為 678.3 U·L-1，Lip 和 Mnp 酶活均在第 6 d 達(dá)到峰值，分別為 1 463.6 U·L-1和 2 667.8 U·L-1，相比于優(yōu)化前，Lac、Lip、Mnp 酶活分別提高 142.8%、49.0%、110.0%。與Vibha 的研究結(jié)果相比，雖其優(yōu)化成果顯著，但研究產(chǎn)酶活性始終較高；較兩菌群優(yōu)化后Lac活性，菌群LDFC 是其菌群2.7 倍，到達(dá)酶活峰值時間比其縮短3 d。

4 結(jié)論

研究探究了碳源、氮源、Cu2+濃度、Mn2+濃度以及誘導(dǎo)劑對菌群產(chǎn)木質(zhì)素降解酶的影響，結(jié)果表明：當(dāng)添加麥芽糖為復(fù)合碳源，硝酸鈉（SN）為氮源，Cu2+濃度為 1.5 mmol·L-1，Mn2+濃度為 0.2 mmol·L-1，ABTS為誘導(dǎo)劑時，菌群 LDFC 的 Lac、Lip、Mnp 酶活，分別為 678.3、1 463.6、2 667.8 U·L-1，相比于優(yōu)化前，三者酶活分別提高142.8%、49.0%、110.0%。研究表明，對菌群產(chǎn)酶條件的優(yōu)化可以有效提高其酶產(chǎn)量，有利于菌群后續(xù)的規(guī)?；褂谩?/p>