楊碩 ，朱慶賀 ，王笑冉 ，孫東波

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)，大慶 163319；2.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)分院）

牛星狀病毒（Bovine Astrovirus，BAstV）屬于星狀病毒科（Astroviridae，AstV），哺乳動物星狀病毒屬（Mamastrovirus）[1]，是一種小的、無包膜的病毒，粒子直徑約為28~30 nm，具有獨(dú)特的五尖或六尖星狀病毒粒子結(jié)構(gòu)，基因組由6.3~7.9 kb 的正鏈單股RNA組成，包括三個開放閱讀框架（ORFs），即ORF1a、ORF1b、ORF2[2]。BAstV 屬于星狀病毒科，哺乳動物星狀病毒屬。1978 年，首次在英國患有腸炎的犢牛排泄物中發(fā)現(xiàn)該病毒[1]，但用分離的星狀病毒樣本感染無菌犢牛未引起腹瀉，被認(rèn)為是無致病性的病毒[3]。研究顯示，1984 年美國分離的牛星狀病毒US1 和US2毒株感染牛后會引起?；啬c上皮細(xì)胞感染和細(xì)胞病理學(xué)改變，糞便顏色由棕色變成黃色[4]，與英國的分離毒株UK 也存在抗原性關(guān)系。Woode GN 等[3]對UK、US1 和US2 三株星狀病毒分離株的研究表明，它們的血清型不同，這意味著自然界中存在多種牛星狀病毒血清型。BAstV 與輪狀病毒、諾如病毒等病毒共同感染時，能夠加重病牛的臨床癥狀，但這是否具有臨床相關(guān)性，或者該病毒在牛的腹瀉發(fā)展過程中是否起協(xié)同作用，還需要進(jìn)一步證實(shí)。近幾年，一些報道顯示BAstV 可能與牛神經(jīng)系統(tǒng)疾病和腦脊髓炎相關(guān)聯(lián)[5-7]，導(dǎo)致人們對研究BAstV 分子流行病學(xué)和致病性的興趣增加。目前尚不清楚AstV 在呼吸道疾病中的作用，但越來越多的證據(jù)表明在患有急性呼吸道疾病的人和動物呼吸道樣本中檢測到AstV[8-11]。

目前，關(guān)于BAstV 在我國的流行情況和遺傳進(jìn)化等相關(guān)研究正在逐步完善。黑龍江地區(qū)尚沒有關(guān)于牛星狀病毒的病原流行情況的相關(guān)報道，使得黑龍江地區(qū)牛星狀病毒具體感染情況、病毒的分子特征、變異及遺傳進(jìn)化情況不清晰，給犢牛腹瀉的防控造成極大困難。因此，深入分析BAstV 的感染流行情況及遺傳變異情況對星狀病毒防控具有重要意義。研究通過RT-PCR 方法，對黑龍江地區(qū)黑河市某規(guī)?；鰻倥８篂a樣品進(jìn)行BAstV 病原檢測，以及對BAstV ORF1a 基因遺傳變異情況進(jìn)行分析，旨為該病毒的有效防控提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集

采集黑龍江省黑河市某規(guī)?；膛ｐB(yǎng)殖場的腹瀉犢牛糞便樣品，共15 份，放置于-80 ℃冰箱內(nèi)備用。

1.1.2 儀器設(shè)備

主要儀器設(shè)備見表1。

表1 儀器設(shè)備Table 1 The detail information of machines

1.1.3 主要試劑

主要試劑見表2。

表2 主要試劑Table 2 The detail information of reagents

1.1.4 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)師志海等[14]建立的星狀病毒PCR 檢測方法，引用其引物序列，提交至生工生物工程（哈爾濱）股份有限公司成并使用。引物具體信息見表3。

表3 BAstV ORF1a 基因擴(kuò)增引物Table 3 Primers for the amplification of BAstV ORF1a genes

1.2 方法

1.2.1 樣品處理及病毒RNA 的提取

用3 倍體積的無菌PBS（PH=7.4）充分渦旋振蕩5 min 制成勻漿，4 ℃ 8 000×g 離心 15 min，取上清，按照TIANGEN 病毒RNA 提取試劑盒的說明書提取RNA。

1.2.2 cDNA 合成

按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書完成反轉(zhuǎn)錄，具體操作如下：根據(jù)反轉(zhuǎn)錄體系加入相應(yīng)反轉(zhuǎn)錄試劑，其中反轉(zhuǎn)錄體系見表4；輕輕混勻，簡短離心；25 ℃孵育5 min；42 ℃孵育 30 min；70 ℃孵育 5 min 終止。

表4 反轉(zhuǎn)錄體系Table 4 Reverse transcription system

1.2.3 PCR 擴(kuò)增及鑒定

以cDNA 為模板用表3 引物進(jìn)行BAstV ORF1a基因的擴(kuò)增。其中PCR 反應(yīng)體系見表5，反應(yīng)條件見表6。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物通過1.2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定。

表5 PCR 反應(yīng)體系Table 5 PCR reaction system

表6 PCR 反應(yīng)條件Table 6 PCR reaction condition

1.2.4 ORF1a 基因克隆與測序

參照膠回收純化試劑盒說明書，回收并純化鑒定為陽性的PCR 產(chǎn)物，將回收產(chǎn)物連接到pGM-T 載體上，然后進(jìn)行轉(zhuǎn)化。步驟如下：

（1）按照連接體系中的順序?qū)⒃噭┘尤氲?.5 mL離心管中（連接體系見表7）；

表7 連接反應(yīng)體系Table 7 Connection reaction system

（2）輕彈離心管，混勻內(nèi)容物，并短暫離心，放入16 ℃金屬浴中連接16 h；

（3）將50 μL DH-5α 感受態(tài)細(xì)胞加入到上面步驟獲得的連接產(chǎn)物中，輕輕混合，冰浴30 min；

（4）將離心管置于42 ℃水浴90 s，取出離心管立即冰浴2~3 min；

（5）向離心管中加入500 μL 預(yù)熱的SOB 培養(yǎng)基，置于 37 ℃搖床，以 150×g 培養(yǎng) 45 min；

（6）將菌液在離心管中混合后，將100 μL 菌液接種到氨芐青霉素抗性的LB 固體培養(yǎng)基，用無菌的玻璃涂布器涂開細(xì)胞，在培養(yǎng)箱中孵育12~16 h；

（7）從每個平板上挑取單個菌落放入含有50 μL SOB 液體培養(yǎng)基的離心管中，將其作為模板進(jìn)行菌落PCR（PCR 體系見表5，反應(yīng)條件見表6），并用1.2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定，送由哈爾濱擎科生物技術(shù)有限公司測序。

1.2.5 同源性及系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建分析

對測序所得毒株與參考毒株用Lasergene DNASTARTM5.06 進(jìn)行序列比對以及同源性分析。采用NJ 法分析遺傳演化結(jié)構(gòu)，利用MEGA 6.06 軟件中p-distance 模型構(gòu)建進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 BAstV ORF1a 基因擴(kuò)增結(jié)果

為調(diào)查黑河市某規(guī)?；膛ｐB(yǎng)殖場中BAstV 的感染情況，通過RT-PCR 對采集的15 份樣品進(jìn)行BAstV 檢測，結(jié)果顯示，檢測出BAstV 陽性樣本3 份，陽性率為20%。擴(kuò)增得到大小約376 bp 的片段，與預(yù)期大小相符（圖1）。以上數(shù)據(jù)說明，該場的15 份糞便樣品中確定有3 份樣本為牛星狀病毒陽性感染。

圖1 ORF1a 基因擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 The amplification of the BAstV ORF1a genes

2.2 菌落PCR 擴(kuò)增結(jié)果

將挑選出的單個菌群進(jìn)行PCR 鑒定，需要保證該菌落中含有ORF1a 基因的陽性質(zhì)粒瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，擴(kuò)增片段與目的片段大小相符，成功獲得陽性菌落（圖2）。

圖2 菌落PCR 結(jié)果Fig.2 The result of individual bacterial colonies PCR

2.3 BAstV ORF1a 基因序列同源性分析

對成功獲得的2 株BAstV ORF1a 基因序列進(jìn)行ORF1a 基因序列比對和同源性分析，結(jié)果顯示，鑒定毒株ORF1a 基因與我國BAstV 四川流行毒株（登錄號NC_037655.1）核苷酸與氨基酸同源性較高，核苷酸同源性分別為96.6 和97.3 %，推導(dǎo)的氨基酸同源性分別為99.4%和100%；而其與嗜神經(jīng)型BAstV 歐洲毒株（KX266908.1）相比核苷酸同源性較低，為36.7%和 37.4%（圖 3，圖 4）。

圖3 ORF1a 基因核苷酸同源性分析Fig.3 Nucleotide homology analysis of ORF1a genes

2.4 BAstV ORF1a 基因系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

通過MEGA 6.0 軟件對本試驗(yàn)鑒定的BAstV 毒株和GenBank 數(shù)據(jù)庫中選擇的38 個毒株進(jìn)行對比，利用NJ 法建立系統(tǒng)進(jìn)化樹進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析，結(jié)果顯示，試驗(yàn)鑒定的兩株BAstV 在進(jìn)化樹上單獨(dú)聚于一支，與中國四川、廣西、香港BAstV 毒株遺傳距離較近，與日本、烏拉圭、歐洲BAstV 毒株遺傳距離較遠(yuǎn)（圖 5）。

3 討論

自1978 年首次在英國患有腸炎的犢牛排泄物中發(fā)現(xiàn)BAstV 以來，BAstV 頻繁在腹瀉及健康犢牛中被檢測到，牛腸道型星狀病毒經(jīng)常與牛輪狀病毒、牛諾如病毒合并感染并促進(jìn)腹瀉加重[18]。當(dāng)前，世界范圍內(nèi)BAstV 流行情況復(fù)雜。多個國家和地區(qū)相繼檢測出 BAstV。Oem J K 等[19]研究表明，2014 年韓國

腹瀉牛糞便樣品中BAstV 陽性率為7.82%（9/115）。Marcelo C[20]研究表明，2015 年巴西牛糞便樣本中檢測到 14.3%（39/272）的 BAstV。Nagai M 等[21]研究表明，2015 年日本牛糞便樣品中 BAstV 陽性率為10.27%（15/146）。Sharp CP 等[22]研究表明，2015 年蘇格蘭AstV 在犢牛中的陽性率高達(dá)74%（85/115），成年牛陽性率為 15%（3/20）。Mohamed FF 等[23]研究表明，2016 年埃及BAstV 糞便樣本中檢測出陽性率為 32%（8/25）。Turan T 等[24]研究表明，2018 年土耳其 BAstV 的陽性率為 3.15%（4/127）。Matías C 等[25]研究表明，2019 年烏拉圭BAstV 的陽性率為26%（128/500）。在我國，廣西、四川、青海、重慶、河南、川西北等地區(qū)BAstV 感染率從2.7%到60.3%不等[14-17]。研究對黑龍江省黑河市某規(guī)?；膛ｐB(yǎng)殖場15 份犢牛腹瀉樣本進(jìn)行BAstV 檢測，結(jié)果表明，15 份腹瀉樣本中BAstV 陽性率為20%（3/15），研究首次在黑龍江地區(qū)檢測到BAstV。這些數(shù)據(jù)表明，在不同的國家和地區(qū)，BAstV 的流行情況存在差異。另外，除在腸道中檢測BAstV 外，歐洲學(xué)者在出現(xiàn)神經(jīng)癥狀的腦組織也檢測到嗜神經(jīng)型BAstV，BAstV 可能嚴(yán)重侵害了牛的中樞神經(jīng)系統(tǒng)，導(dǎo)致?；撔阅X炎的爆發(fā)，家畜的中樞神經(jīng)系統(tǒng)傳染病具有重要的經(jīng)濟(jì)和公共衛(wèi)生意義[26]。因此，建議在商業(yè)養(yǎng)殖牛場中開展大規(guī)模BAstV 監(jiān)測研究，以準(zhǔn)確評估該病毒在牛中傳播的多樣性和流行病學(xué)[27-28]。

BAstV ORF1a 在BAstV 復(fù)制過程中編碼與病毒復(fù)制和轉(zhuǎn)錄相關(guān)的非結(jié)構(gòu)蛋白，同時也是BAstV 的進(jìn)化分析的主要目的基因[29-30]。研究也利用ORF1a 的部分序列進(jìn)行了序列分析，結(jié)果表明，研究鑒定的2株BAstV 毒株ORF1a 基因核苷酸與氨基酸同源性為99.3%和99.4%，2 株毒株與我國BAstV 四川流行毒株、香港經(jīng)典毒株核苷酸與氨基酸高度同源，而其與嗜神經(jīng)型BAstV 歐洲毒株相比，核苷酸與氨基酸同源性較低，表明是腸道毒株與嗜神經(jīng)毒株序列可能存在巨大差異；通過系統(tǒng)進(jìn)化樹分析也揭示了相同的結(jié)果，試驗(yàn)鑒定的BAstV 毒株與國內(nèi)的流行毒株親緣關(guān)系較近，與國外嗜神經(jīng)型毒株親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。研究結(jié)果顯示黑龍江省黑河市某規(guī)?；膛ｐB(yǎng)殖場BAstV 的感染率為20%，這也是首次驗(yàn)證了BAstV 在黑龍江省的存在，為進(jìn)一步全面了解該病毒的流行病學(xué)和生物學(xué)特征提供一定的參考依據(jù)。

4 結(jié)論

研究在黑龍江黑河市某規(guī)模化養(yǎng)牛場15 份犢牛腹瀉糞便樣本中檢測到BAstV，其檢出率為20%。證實(shí)了BAstV 在我國黑龍江地區(qū)的傳播。另外，研究測序的2 株毒株與香港經(jīng)典腸道毒株和國內(nèi)近幾年流行的腸道毒株具有高度同源性，但與歐洲嗜神經(jīng)型毒株同源性較低，進(jìn)一步證實(shí)腸道毒株與嗜神經(jīng)毒株序列之間可能存在顯著差異。研究為我國BAstV的進(jìn)一步研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，豐富了我們對中國BAstV 基因進(jìn)化的理解。