楊雨晴 ，李樹東 ，孫曉瑩 ，陳小燕 ，白永飛 ，李穎 ，蔡昌福 ，余麗蕓 ，侯喜林

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動物科技學(xué)院，大慶 163319；2.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院）

產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌（Enterotoxigenic Escherichia coli，ETEC）是初生仔豬腹瀉和死亡的主要原因，由于發(fā)病早、發(fā)病急，如不及時治療，將會給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失[1-2]。ETEC 的特征是可以產(chǎn)生兩種類型的毒力因子，促進與特定腸上皮細胞受體結(jié)合和定植的菌毛黏附素和負責(zé)液體分泌的腸毒素[3-4]。ETEC 表達的菌毛通過與小腸腸上皮細胞刷狀緣上存在的特定受體的相互作用介導(dǎo)黏附到宿主腸上皮，在細菌大量增殖的過程中產(chǎn)生腸毒素，引起胃腸道分泌大量電解質(zhì)和水，從而導(dǎo)致仔豬腹瀉[5-6]。黏附素的黏附作用是ETEC 感染的第一步，起了關(guān)鍵性作用。引起仔豬腹瀉的ETEC 常攜帶黏附素K88、987P，也是研制基因工程疫苗的首選抗原。

乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）革蘭氏陽性細菌，公認的綠色安全級（generallyregarded as safe，GRAS）益生微生物[7]，被廣泛地應(yīng)用在食品、醫(yī)藥、飼料工業(yè)等方面[8]。乳酸菌具有益生作用和免疫佐劑作用，同時乳酸菌表達系統(tǒng)操作簡便，這些特點使得乳酸菌適合作為外源蛋白的遞呈工具[9]。而且乳酸菌可以通過黏膜途徑進行免疫接種，提高了對以黏膜途徑為主要途徑侵入機體的病原體的保護性[10-11]。因此，乳酸菌在抗原蛋白的呈遞方面比其他基因工程菌株更有優(yōu)勢，可以表達多種病原微生物抗原及生物活性分子來防治動物疾病，是開發(fā)新型活載體疫苗的理想選擇。

研究構(gòu)建共表達ETEC 987P 基因和K88 基因的重組干酪乳桿菌，鑒定了重組干酪乳桿菌的反應(yīng)原性，并通過灌胃的方式免疫BALB/c 小鼠，采用檢測血清中IgG 水平、腸沖洗液sIgA 水平、淋巴細胞增殖試驗和攻毒保護性試驗，評價其免疫效果。

1 材料與方法

1.1 材料

干酪乳桿菌CICC 6105 購自中國工業(yè)微生物菌種保藏中心；5~6 周齡SPF 級BALB/c 小鼠購自長春市寬城區(qū)宏達動物養(yǎng)殖場，許可證編號為SCXK（遼）2020-0001；ETEC C83916（987P）菌株和 C83902（K88）菌株由黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動物傳染病診斷與新型疫苗實驗室保存；穿梭載體pLA、pLA-987P/L.casei、pLA-K88/L.casei 由黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)基因工程實驗室保存；羊抗鼠IgG 抗體購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；DNA 提取液購自Solarbio 公司；限制性核酸內(nèi)切酶、T4 DNA 連接酶購自TaKaRa 公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計與合成

根據(jù)GenBank 公布的ETEC 987P 菌毛基因序列（Access number：M35257.1）及 ETEC K88 菌毛基因序列（Access number：M29375.1）設(shè)計引物，引物由生工生物工程上海（股份）有限公司合成，引物信息見表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.2.2 987P、K88 基因的擴增及克隆質(zhì)粒的構(gòu)建

以 ETEC 987P 和 ETEC K88 基因組 DNA 為模板，20 μL PCR 體系擴增目的基因，PCR 反應(yīng)條件：94 ℃ 變性 5 min；60 ℃ or 56 ℃退火 45 s（987P 60 ℃退火；K88 56 ℃退火），72℃ 延伸 1 min，共 30 個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。將PCR 鑒定正確的目的片段回收后，分別連接至pMD18-T 載體，構(gòu)建質(zhì)粒pMD18-T-987P 和pMD18-T-K88，經(jīng)PCR 及雙酶切鑒定后，送往生工生物工程上海（股份）有限公司進行測序。

1.2.3 重組質(zhì)粒pLA-987P-K88 的構(gòu)建及鑒定

將 pMD18-T-987P 及 pLA 空載體用 BamH I、Sal I 雙酶切后回收目的片段。首先將膠回收的987P片段和pLA 載體片段連接并轉(zhuǎn)化至DH5α 感受態(tài)細胞，對鑒定陽性的重組質(zhì)粒pLA-987P 和pMD18-TK88 進行Sal I、Hind III 雙酶切處理，將酶切回收的pLA-987P 和 K88 片段連接并轉(zhuǎn)化至 DH5α 感受態(tài)細胞，經(jīng)PCR、雙酶切正確的重組質(zhì)粒命名為pLA-987P-K88。

1.2.4 干酪乳桿菌感受態(tài)細胞的制備

干酪乳桿菌感受態(tài)細胞的制備方法參考李超等[12]。將干酪乳桿菌6105 接種于無抗性MRS 液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)至OD600 約為0.5，冰浴30 min 后離心，用EPWB 溶液洗滌菌體3 次，離心后用EPB 重懸菌體。

1.2.5 重組質(zhì)粒的電轉(zhuǎn)化

pLA-987P-K88 陽性質(zhì)粒加入冰冷的感受態(tài)細胞中，冰浴10 min，將含有質(zhì)粒的感受態(tài)細胞吸入冰冷的1 mm 電擊杯中，將電擊杯放入電轉(zhuǎn)儀中（2.2 kV，脈沖時間4 ms）電擊，加入800 μL 無抗MRS（含10%蔗糖），全部吸入1.5 mL 離心管中，37 ℃厭氧靜置培養(yǎng)3 h，離心后收集菌體混勻后涂布于氯霉素抗性（34 μg·mL-1）的 MRS 平板上，37 ℃厭氧培養(yǎng)至長出單菌落。

1.2.6 重組干酪乳桿菌pLA-987P-K88/L.casei 的鑒定

乳酸菌質(zhì)粒提取方法參考張波等[13]。以提取的重組質(zhì)粒pLA-987P-K88 為模板分別對987P 基因、K88 基因及987P-K88 進行PCR 擴增，對PCR 產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠分析。

1.2.7 重組干酪乳桿菌的Western blot 鑒定

將培養(yǎng)10 h 的陽性重組菌用溶菌酶處理（37 ℃、30 min）后離心，用 1×Loading Buffer 上樣緩沖液重懸菌體，沸水煮10 min 后離心。將蛋白樣品電泳后轉(zhuǎn)膜以抗987P、K88 陽性血清為一抗，羊抗鼠IgG-HRP為二抗，Western blot 檢測987P-K88 的表達。

1.2.8 重組干酪乳桿菌pLA-987P-K88/L.casei 表面展示的檢測

將重組菌pLA-987P-K88/L.casei 和pLA/L.casei培養(yǎng) 10 h 后各取 1 mL，4 000 r·min-1離心 5 min，用無菌PBS 洗滌菌體3 次，離心后用含5% BSA 的PBS 4 ℃封閉過夜，離心后用PBS 洗滌菌體3 次，離心后以抗 987P、K88 陽性血清（1∶50 稀釋）作為一抗，37 ℃孵育 2 h，用 FITC 標(biāo)記的羊抗鼠 IgG（1∶100 稀釋）37 ℃避光孵育1 h，每次換液前用PBS 洗滌菌體3 次，檢測前dd H2O 洗滌菌體1 次，調(diào)整菌體數(shù)目到5×106CFU·mL-1，300 目過濾網(wǎng)過濾除去雜質(zhì)，流式細胞儀檢測菌體發(fā)光情況。

將上述處理好的菌液吸取適量涂布于干燥載玻片上（75%乙醇浸泡過夜）并晾干，熒光顯微鏡下觀察菌體熒光情況。

1.2.9 動物免疫實驗及抗體檢測

為比較免疫效果設(shè)立pLA-987P/L.casei 組和pLA-K88/L.casei 組，重組菌 pLA-987P/L.casei 和pLA-K88/L.casei 為實驗室構(gòu)建保存，重新活化后經(jīng)質(zhì)粒PCR 和Western blot 鑒定為陽性的菌株用于免疫小鼠。

取 250 只 BALB/c 雌鼠分成 6 組，pLA-987PK88/L.casei 組、pLA/L.casei 對照組、生理鹽水對照組（NS）和空白對照組（Untreated）每組45 只。因pLA-987P/L.casei 組和pLA-K88/L.casei 組攻毒試驗只攻一種ETEC 菌株，所以這兩組每組35 只。

其中 pLA-987P-K88/L.casei 組、pLA-987P/L.casei 組、pLA-K88/L.casei 組和 pLA/L.casei 對照組小鼠均以 5×109CFU·mL-1灌胃 200 μL，NS 組灌胃相同體積的生理鹽水，Untreated 組不做處理。每次連續(xù)灌胃5 d，間隔10 d 加強免疫，共免疫3 次。首免7 d 后隨機選取小鼠眼球采血，采血后處死小鼠，取攜帶內(nèi)容物的小腸，每間隔7 d 采集一次血和小腸，利用間接ELISA 方法檢測血清中特異性IgG 抗體水平和腸道沖洗液的特異性sIgA 抗體水平。

檢測結(jié)果用Graphpad prism 6 軟件進行顯著性分析，ns：P＞0.05；*：0.01＜P＜0.05；**：0.001＜P＜0.01；***：0.000 1＜P＜0.001；#：P＜0.000 1。

1.2.10 脾臟T 淋巴細胞檢測

末免后每組隨機選取3 只小鼠斷頸迫殺，參照達科為生物技術(shù)有限公司小鼠淋巴細胞分離液的說明書制備小鼠淋巴細胞懸液，用1640 培養(yǎng)基（含10%胎牛血清）稀釋細胞后，于96 孔板中進行培養(yǎng)，每孔大約6 000 個細胞，每組樣品設(shè)3 個重復(fù)。各試驗組用 987P-K88 蛋白（0.5 mg·mL-1）刺激，陰性對照組用1640 培養(yǎng)基（含10%胎牛血清）刺激，陽性對照組用ConA 刺激，為消除系統(tǒng)誤差同時設(shè)立A 組（無細胞，刺激物和1640 培養(yǎng)液）和B 組（無細胞，僅含1640 培養(yǎng)液）。37 ℃ CO2培養(yǎng)箱中持續(xù)刺激24 h后，各孔加入10 μL CCK-8，作用1 h，用酶標(biāo)儀檢測OD450，計算刺激指數(shù)（stimulative index，S.I.）。

刺激指數(shù)=（試驗組OD450-A 組OD450）（/陰性對照組 OD450-B 組 OD450）

1.2.11 攻毒保護性試驗

（1）半數(shù)致死量的測定

5～6 周齡小鼠 72 只，隨機分成組 A、B 兩組，每組36 只，分別用來測定C83916（987P）和C83902（K88）的半數(shù)致死量（LD50），A、B 組又各分為 6 組，每組6 只，1～5 組為實驗組，6 組為對照組。將大腸桿菌接種于LB 培養(yǎng)基，37 ℃震蕩培養(yǎng)18 h，離心收集菌體，用滅菌蒸餾水稀釋至 109CFU·mL-1，以 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL 的劑量分別灌胃攻毒 1～5 組。觀察并記錄死亡數(shù)，應(yīng)用Reed-Muench 法計算半數(shù)致死量。

（2）攻毒試驗

末免14 d 后，每組各分為兩部分，分別用3×103LD50的 C83916（987P）和 C83902（K88）對小鼠進行攻毒，空白對照組不做處理，攻毒方式為灌胃，攻毒后連續(xù)觀察20 d，記錄小鼠的發(fā)病和死亡情況，計算保護率。

免疫保護率（%）=（1-免疫組死亡率或發(fā)病率/對照組死亡率或發(fā)病率）×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組大腸桿菌 pMD18-T-987P/E.coli 和pMD18-T-K88/E.coli 構(gòu)建

成功擴增出987P 基因和K88 基因，結(jié)果見圖1A，1B；重組質(zhì)粒 pMD18-T-987P 用 BamH I 和 Sal I雙酶切后可看到513 bp 的987P 基因和2 692 bp 的pMD18-T 載體條帶；用Sal Ⅰ和Hind Ⅲ 雙酶切處理重組質(zhì)粒pMD18-T-K88，可見789 bp 的K88 基因和2 692 bp 的pMD18-T 載體條帶，結(jié)果如圖1C，1D所示。

圖1 重組大腸桿菌pMD18-T-987P/E.coli 和pMD18-T-K88/E.coli 構(gòu)建Fig.1 Construction of recombinant Escherichia coli pMD18-T-987P/E.coli and pMD18-T-K88/E.coli

2.2 重組pLA-987P-K88/E.coli 的酶切鑒定

分別用 BamH I 和 Sal I、Sal I 和 Hind III、BamH I和Hind III 對PCR 鑒定為陽性的重組質(zhì)粒 pLA-987P-K88 進行酶切處理，結(jié)果分別切出513、789 bp和1 302 bp 片段，與預(yù)期一致，結(jié)果見圖2。

圖2 重組質(zhì)粒pLA-987P-K88 的鑒定Fig.2 Identification of recombinant plasmid pLA-987P-K88

2.3 重組pLA-987P-K88/L.casei 的鑒定結(jié)果

從pLA-987P-K88/L.casei 提取重組質(zhì)粒pLA-987P-K88，以其為模板進行PCR 擴增，結(jié)果顯示大小約為513、789 bp 和1 302 bp 的片段，與預(yù)期一致，結(jié)果如圖3A。用溶菌酶處理pLA-987P-K88/L.casei和 pLA/L.casei 后，進行 Western blot 鑒定，經(jīng) DAB 顯色后，pLA-987P-K88/L.casei 在約 85 kDa 處出現(xiàn)條帶，對照組未出現(xiàn)此現(xiàn)象，見圖3B。間接免疫熒光鑒定結(jié)果顯示，pLA-987P-K88/L.casei 與對照組在明視野下均能見到相應(yīng)菌體，pLA-987P-K88/L.casei 熒光顯微鏡下可觀察到明顯的綠色熒光反應(yīng)，而對照組未見到綠色熒光，見圖3C。流式細胞儀檢測結(jié)果表明，重組干酪乳桿菌的熒光強度明顯高于對照組，表達量約為92.81%，結(jié)果如圖3D。上述結(jié)果證明外源蛋白成功表達在干酪乳桿菌表面。

圖3 pLA-987P-K88/L.casei 鑒定結(jié)果Fig.3 Identification results of pLA-987P-K88/L.casei

2.4 小鼠血清中IgG 抗體水平檢測結(jié)果

應(yīng)用間接ELISA 方法檢測不同時間段的血清中IgG 抗體水平，試驗結(jié)果如圖4，首次免疫7 d 后pLA-987P-K88/L.casei 組 、pLA-987P/L.casei 組 和pLA-K88/L.casei 組抗體水平顯著高于pLA/L.casei組、NS 組和 Untreated 組（P＜0.0001），pLA-987P/L.casei 組和pLA-K88/L.casei 組抗體水平略高于pLA-987P-K88/L.casei 組但沒有顯著差異（P＞0.05），抗987P IgG 抗體在49 d 達到峰值，抗K88 IgG 抗體在56 d 達到峰值。

圖4 免疫小鼠血清抗體水平變化Fig.4 Changes of serum antibody levels in immunized mice

2.5 小鼠腸沖洗液中sIgA 抗體水平檢測結(jié)果

應(yīng)用間接ELISA 方法檢測不同時間段的腸沖洗液中sIgA 抗體水平，試驗結(jié)果如圖5，首次免疫7 d后即可檢測出抗體，重組干酪乳桿組菌與NS 組和Untreated 組相比呈明顯的上升趨勢，且抗體水平一直在上升，pLA-987P-K88/L.casei 組抗體水平略低于pLA-987P/L.casei 組和pLA-K88/L.casei 組但沒有顯著差異（P＞0.05）。

圖5 免疫小鼠腸沖洗液抗體水平變化Fig.5 Changes of antibody levels in intestinal rinse solution of immunized mice

2.6 脾臟T 淋巴細胞增殖檢測結(jié)果

末免后采集各試驗組小鼠脾臟，分離淋巴細胞，試驗組用987P-K88 蛋白刺激，結(jié)果顯示，pLA-987PK88/L.casei 試驗組刺激指數(shù)顯著高于pLA/L.casei組、NS 組和Untreated 組，但987P-K88 蛋白的刺激指數(shù)整體低于ConA，如圖6。

圖6 脾臟T 淋巴細胞增殖結(jié)果Fig.6 Results of splenic T lymphocyte proliferation

2.7 攻毒保護性試驗

末免14 d 后，對小鼠進行攻毒保護性試驗，用C83916（987P）和 C83902（K88）（3×103LD50） 的對小鼠進行攻毒，攻毒后觀察小鼠發(fā)病和死亡情況。pLA/L.casei 組和生理鹽水組在攻毒之后出現(xiàn)精神萎靡不振、毛皮褶皺、食欲下降、活動呆滯、嗜睡最終死亡；未攻毒的Untreated 組小鼠健康狀態(tài)良好；pLA-987P-K88/L.casei 組的保護率均在80%以上，說明口服重組菌有很好的保護效果。

表2 試驗小鼠對C83916（987P）攻毒保護效果Table 2 Protective effect of test mice against C83916（987P）

表3 試驗小鼠對C83902（K88）株攻毒保護效果Table 3 Protective effect of test mice against C83902（K88）strain

3 討論

ETEC 的傳播是由帶菌母豬排泄物沾染到皮膚和乳頭上，仔豬吃奶或者舔舐母豬皮膚，使ETEC 經(jīng)口腔從胃腸道入侵機體。胃腸道分布有大量的淋巴細胞，尤其是胃腸道相關(guān)淋巴組織含有全身總淋巴細胞的70%，因此胃腸道成為體內(nèi)最大的免疫器官[14]。黏膜在ETEC 傳播和感染中的突出作用表明，直接黏膜免疫（例如口服）可能是一種通過誘導(dǎo)全身和黏膜免疫反應(yīng)來預(yù)防ETEC 的有效策略。因此，開發(fā)能引起腸道的黏膜免疫的口服疫苗對防治ETEC 有著重要意義。

近年來隨著黏膜免疫成為免疫學(xué)的研究熱點，可引起黏膜免疫的活載體疫苗的興起，乳酸菌以其益生作用、安全性且能在腸道定植等諸多優(yōu)點走進了研究者的視野。實驗室在利用乳酸菌表達抗原蛋白方面也做了很多嘗試，證明了以乳酸菌制備ETEC活載體疫苗具備可行性。齊浩[15]制備的ETEC 987P基因工程乳酸菌口服免疫小鼠后，結(jié)果證明免疫效果良好；魏春華等[16]構(gòu)建的K99 重組乳酸菌能夠抵抗ETEC K99 對小鼠的感染；劉建奎等[17]采用了滴鼻和口服兩種方式給小鼠表達ETEC F41 的重組乳酸菌，均為小鼠提供了良好的保護力。雖然實驗室研究制備的單價乳酸菌疫苗免疫效果很好，但是防治范圍有限，因此制備多價乳酸菌疫苗對ETEC 的防治更有利。多價疫苗能夠克服ETEC 血清型多、毒力因子復(fù)雜的問題，防治范圍更為廣泛，在生產(chǎn)上減少了生產(chǎn)工序，也降低了生產(chǎn)成本，是ETEC 疫苗的重要發(fā)展方向[18]。

研究利用穿梭載體構(gòu)建pLA-987P-K88 質(zhì)粒，將陽性質(zhì)粒電轉(zhuǎn)進干酪乳桿菌，成功表達了大小為85 kDa 的融合蛋白，以小鼠為動物模型探討重組干酪乳桿菌作為新型疫苗的潛在價值。IgG 是血清中免疫球蛋白的主成分，也是體液免疫應(yīng)答產(chǎn)生的主要抗體，在抗感染、中和細菌毒素等方面發(fā)揮重要作用，是反映免疫功能的重要指標(biāo)[19]。因此，實驗將重組菌口服免疫小鼠后，檢測不同時間血清中特異性IgG抗體水平，結(jié)果顯示，首次免疫7 d 后即可檢測到相應(yīng)抗體，隨著免疫次數(shù)和時間的推移，特異性IgG 抗體的水平也逐漸增高，末免結(jié)束一個月后抗體水平略微下降，pLA-987P-K88/L.casei 組的抗體水平始終顯著高于對照組（P＜0.05），表明重組菌誘導(dǎo)機體產(chǎn)生體液免疫應(yīng)答。

ETEC 從胃腸道入侵機體，因此腸道的黏膜免疫對防治ETEC 有著重要意義。黏膜系統(tǒng)是免疫防御的第一道防線，而sIgA 是黏膜免疫的第一道防線[20-21]。sIgA 可以阻止微生物黏附素與上皮細胞的相互作用，還可以通過直接識別受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域來特異性地抑制病原體，這使得sIgA 在病原體誘導(dǎo)的特異性免疫中有著不可或缺的作用[22]。實驗在不同時間取口服免疫重組菌小鼠的腸道沖洗液，檢測腸沖洗液中特異性sIgA 抗體水平，結(jié)果顯示，重組菌組的抗體水平顯著高于對照組，且抗體水平一直在升高，在首次免疫56 d 后增長的趨勢才逐漸平緩，這表明該重組菌誘導(dǎo)機體產(chǎn)生腸道黏膜免疫應(yīng)答。

為了進一步比較構(gòu)建的二價重組干酪乳桿菌與單價重組菌的免疫效果，試驗添加了pLA-987P/L.casei 免疫組和pLA-K88/L.casei 免疫組，免疫程序和劑量與pLA-987P-K88/L.casei 免疫組一致，結(jié)果顯示pLA-987P/L.casei 組和 pLA-K88/L.casei 組的 IgG 抗體的水平和sIgA 抗體水平均比pLA-987P-K88/L.casei 組高。這與Wen L J 等[23]制備的重組乳酸菌疫苗相關(guān)實驗結(jié)果相一致，劉歡歡[24]在NDV F、IBV S1 二聯(lián)乳酸菌疫苗的相關(guān)研究中也得到了相似的結(jié)果。其原因可能是融合表達兩種抗原蛋白分子量變大了，表達量有所下降，在免疫相同劑量時所含抗原量減少，所以刺激機體產(chǎn)生的免疫應(yīng)答不如單個抗原蛋白強烈；也可能是蛋白在折疊過程中，部分抗原表位被空間結(jié)構(gòu)遮擋住了，導(dǎo)致其免疫原性降低。雖然重組干酪乳桿菌pLA-987P-K88/L.casei 組與pLA-987P/L.casei 和 pLA-K88/L.casei 相比 IgG 和 sIgA 的水平略低，但是攻毒保護性試驗結(jié)果表明重組干酪乳桿菌足以抵抗ETEC C83916（987P）株和C83902（K88）株的攻擊，且保護率均在80%以上。

T 淋巴細胞增殖試驗又稱T 淋巴細胞轉(zhuǎn)化試驗。T 淋巴細胞在體外經(jīng)某種物質(zhì)刺激，細胞代謝和形態(tài)相繼變化，產(chǎn)生一系列增殖的變化，由淋巴細胞轉(zhuǎn)變?yōu)榱馨湍讣毎鸞25-26]。淋巴細胞的增殖能力反映了機體免疫水平的強弱，據(jù)此可判斷出淋巴細胞對有關(guān)刺激的反應(yīng)性與功能狀態(tài)，是測定機體免疫功能的指標(biāo)之一[27]。研究T 淋巴細胞增殖試驗結(jié)果顯示重組菌pLA-987P-K88/L.casei 組刺激指數(shù)顯著高于對照組，表明該重組菌能夠誘導(dǎo)細胞免疫應(yīng)答，同時，pLA/L.casei組刺激指數(shù)略高于生理鹽水對照組（NS）和空白對照組（Untreated），該結(jié)果符合與乳酸菌的相關(guān)研究結(jié)論[28-30]。

4 結(jié)論

成功構(gòu)建了表達ETEC 987P 和K88 蛋白的重組干酪乳桿菌，重組干酪乳桿菌不僅能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生體液免疫應(yīng)答和細胞免疫應(yīng)答，還能產(chǎn)生局部黏膜免疫應(yīng)答，能夠有效的抵抗ETEC 987P 和ETEC K88 的感染。