胡陽，劉明月，王春仁，常巧呈

（黑龍江八一農(nóng)墾大學動物科技學院，大慶 163319）

馬梨形蟲?。‥quine piroplasmosis，EP）又稱馬焦蟲病、馬血孢子蟲病，是一種寄生在紅細胞或淋巴細胞內(nèi)由蜱為傳播媒介的血液寄生原蟲病，可感染馬、驢、騾等多種馬屬動物[1]。該病成世界性流行，在有大量馬匹和有效傳播蜱媒介的大多數(shù)國家廣泛存在，主要疫源地包括熱帶、亞熱帶及一些溫帶地區(qū)[2]，我國東北、西北地區(qū)也常有報道[3]。本病具有極強的季節(jié)性，在我國，主要流行于每年的 3～5 月，2 月和 6～8月呈散發(fā)，病例一般隨著當?shù)孛浇轵绲南L規(guī)律而變化[4]，梨形蟲的全球分布與蜱蟲的分布相似，在溫帶氣候中，蜱中攜帶駑巴貝斯蟲的情況比攜帶馬泰勒蟲的情況多。普遍來看，馬泰勒蟲病比駑巴貝斯蟲病的患病率要高。

蜱蟲有作為生物媒介傳播該病的能力并且極為有效，在全球幾乎所有的氣候中都能找到有效的蜱蟲媒介?，F(xiàn)有的研究表明，有14 種蜱可以傳播駑巴貝斯蟲，分別為：4 種革蜱，4 種璃眼蜱，5 種扇頭蜱和1 種花蜱；有15 種蜱可以傳播馬泰勒蟲，分別是：7種革蜱，6 種璃眼蜱和1 種扇頭蜱[1]。蜱的生活周期包括四個階段，分別為卵、幼蟲、若蟲、成蟲，根據(jù)這一特性，馬屬動物梨形蟲的經(jīng)蜱傳播有三種方式：直接傳播、期間傳播和經(jīng)卵傳播[9]。盡管馬泰勒蟲的特定傳播是因為不同的蜱種而異，但我們要認識到最重要的一點是，由于馬泰勒蟲是可以通過蜱的卵巢傳播的，因此感染的陽性蜱蟲可以作為群體內(nèi)感染的感染源。但同一地區(qū)存在的蜱媒的傳染能力和馬匹的受感染能力是不同的，不一定會導致嚴重的疾病后果，必須還要考慮到許多因素，包括季節(jié)、天氣、宿主專一性和有效蜱生活周期等細節(jié)問題。

感染該病后，可引起不同程度的溶血性貧血及相關(guān)系統(tǒng)疾病。急性感染初期會出現(xiàn)非特異性的標志，如高燒，昏睡，厭食，水腫和粘膜發(fā)紺。隨著感染的加深，馬會表現(xiàn)出溶血的癥狀，包括黃疸、粘膜蒼白、心動過速、呼吸急促、無力和色素尿。其他系統(tǒng)的并發(fā)癥也可能會對身體造成影響，包括腹瀉、肺水腫、肺炎、色素性腎病、共濟失調(diào)、肌肉疼痛、痙攣等。急性期的主要特征是爆發(fā)性的癥狀和猝死[5]。據(jù)報道，這種情況會在純種馬引入流行性地區(qū)的時候發(fā)生，或可發(fā)生在診斷為子宮內(nèi)感染的新生小馬駒上。這些馬駒在剛出生就可能會有臨床癥狀，或在新生2～3 d 發(fā)病，大多預后不良，導致死亡。臨床癥狀一般為非特異性的，例如虛弱、哺乳量降低，但在成年動物感染中，也會出現(xiàn)相同的情況。慢性馬泰勒蟲病和駑巴貝斯蟲病感染可能導致非特異性慢性炎癥或感染，包括嗜睡、厭食、體重減輕、脫毛、輕度貧血，直腸檢查會發(fā)現(xiàn)脾臟腫大。

感染后成功治愈的馬屬動物在臨床上有著非常明顯的帶蟲免疫特征，有研究表明，馬匹在患馬梨形蟲病后，會帶蟲免疫長達7 年之久[6]，這些隱性帶蟲宿主不顯示發(fā)病，但容易經(jīng)過媒介蜱使馬梨形蟲陰性蜱感染該病，或直接通過蜱蟲將帶蟲血傳播給陰性馬屬動物。因此，帶蟲宿主的活動會直接影響本病的傳播流行。值得注意的是，這兩種寄生蟲都可以進行有效的醫(yī)源性傳播，最典型的例子就發(fā)生在美國佛羅里達。一些賽馬在參加未經(jīng)批準的馬賽前，會被注射一定劑量的興奮劑，針頭便可以傳播陽性血液，導致了大量的馬出現(xiàn)了明顯的臨床癥狀，同樣，當使用了未經(jīng)檢測的或隱性攜帶者捐獻的血也會發(fā)生感染。因此，在國際馬匹交易的過程中規(guī)定，必須要進行馬梨形蟲病的檢測[7]。

病原有兩種，分別為駑巴貝斯蟲和馬泰勒蟲，目前梨形蟲的鑒別主要基于傳統(tǒng)的形態(tài)學，是馬梨形蟲病最簡捷的標準診斷技術(shù)[8]。方法需采集少量血液制作血涂片，染色后油鏡觀察紅細胞中有無典型的蟲體即可判定動物是否感染梨形蟲，因而得到廣泛應用。有研究表明，兩種蟲體的典型形態(tài)十分不同，駑巴貝斯蟲大于紅細胞半徑，約為2～5 μm，呈成對的梨子形，馬泰勒蟲小于紅細胞半徑，約為2～3 μm，呈馬耳他十字形[9]。然而，不同種株間或在不同發(fā)育時期的蟲體形態(tài)相似，很難準確區(qū)分是駑巴貝斯蟲感染、馬泰勒蟲感染亦或是二者混合感染。并且在通常情況下，被感染動物的染蟲率達不到血涂片鏡檢的量，在染蟲率過低的血液樣本中，油鏡下很難找到蟲體，無法獲得蟲體的形態(tài)特征。除此之外，血涂片鏡檢的技術(shù)要求很高，染料濃度、血涂片的質(zhì)量、染色時間等因素都可能會影響檢測的結(jié)果，同時，檢測人員要對梨形蟲的背景知識有較多的了解，對在該病的疫情進行調(diào)查時費時費力。綜上，對于該病病原的鑒別，還需要依托其他的技術(shù)方法。

隨著分子生物學的發(fā)展，PCR 技術(shù)在病原鑒定中占有重要的地位，它相比于傳統(tǒng)的形態(tài)學方法來說具有較高的敏感性，也廣泛地應用于各種疾病的檢測中[10]。目前已建立的檢測馬梨形蟲PCR 方法較多，不同的方法引物可能不同，其目的基因分別有p82，rap-1，ema-1，ema-2，Bc48，Bc134 和 18S rRNA等。PCR 方法可檢測多種來源的DNA 樣品，如動物血液、動物骨髓、蜱等。其中，18S rRNA 基因被廣泛的應用于馬梨形蟲的檢測與分類研究中，PCR 技術(shù)在鑒定目標病原體方面也有著獨特的優(yōu)勢，但想要鑒別感染馬梨形蟲的種類，仍需要通過特異性引物擴增，測序后進行序列比對才能確定。該方法檢測時間長，測序費用高，給臨床鑒別診斷帶來不便。因此，需要一種實驗流程簡單，節(jié)約實驗成本，可以快速并準確的區(qū)分馬梨形蟲種類的鑒別方法。

1 材料和方法

1.1 蟲體來源

駑巴貝斯蟲、馬泰勒蟲以及兩者混合感染陽性樣品均來自黑龍江八一農(nóng)墾大學寄生蟲實驗室，于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?016-2020 年間，對黑龍江省不同地點的馬屬動物無菌采集了抗凝血，共45 份。

1.2 實驗試劑

QIAamp Blood Mini Kit 試劑盒 （QIAGEN），2×Taq Mix 酶（南京諾唯贊公司），限制性內(nèi)切酶Dra Ⅰ（大連寶生物公司）。

1.3 總 DNA 提取

取50 μL 血液樣本分別置于1.5 mL 離心管中，用 QIAamp Blood Mini Kit（QIAGEN）試劑盒進行血液DNA 提取，步驟如下：取 20 μL QIAGEN protease于1.5 mL 離心管中，添加200 μL 血液樣本，不足200 μL 加入 PBS 補足；加入 200 μL Buffer AL，漩渦震蕩混勻后瞬離；在56 ℃條件下孵育10 min，瞬離；加入200 μL 無水乙醇，漩渦震蕩混勻，瞬離；將以上得到的液體加入吸附柱中，8 000 r·min-1離心1 min，棄掉2 mL 的收集管；將吸附柱放于新的2 mL 收集管中，加入500 μL Buffer AW1（用之前要加入定量的無水乙醇），8 000 r·min-1離心 1 min，棄掉 2 mL的收集管；將吸附柱放于新的2 mL 收集管中，加入500 μL Buffer AW2，14 000 r·min-1離心 3 min，棄掉2 mL 的收集管；將吸附柱放于新的2 mL 收集管中，空離1 min；將吸附柱放于新的1.5 mL 收集管中，加入 200 μL Buffer AE 或 ddH2O，室溫靜置 1 min，8 000 r·min-1離心 1 min，收集 DNA。將提取后 DNA 標號并分裝，置于-20 ℃冰箱中保存，用于接下來的實驗。

1.4 目的基因的擴增

根據(jù)GenBank 數(shù)據(jù)庫中不同國家的駑巴貝斯蟲和馬泰勒蟲的18S rRNA 全長序列，用primer premier 5.0 軟件設計馬梨形蟲通用引物，上游引物EP18SF：5′- TGGCTCATTACAACAGT -3′，下游引物EP18SR：5′- GAATAATTCACCGGATC -3′，由哈爾濱擎科生物有限公司合成。以駑巴貝斯蟲陽性，馬泰勒蟲陽性，混合感染陽性血液樣本DNA 為模板，擴增18S rRNA 基因序列，PCR 反應體系為 25 μL，10 μL ddH2O，12.5 μL 2×Taq Mix，1 μL DNA 模板和上下游引物各0.5 μL。具體的擴增條件為：95 ℃預變性5 min；進入循環(huán)：95 ℃變性1 min，退火溫度55 ℃ 1 min，72 ℃延伸 1 min 30 s，共 37 個循環(huán)；最后 72 ℃延伸7 min。擴增出的產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠電泳后，置于凝膠成像系統(tǒng)中拍照。

1.5 PCR-RFLP 方法的建立

使用DNAStar 中的MapDraw 軟件對不同國家駑巴貝斯蟲和馬泰勒蟲的序列進行分析，找出兩者之間的非保守區(qū)以及差異位點，根據(jù)分析結(jié)果，選擇限制性內(nèi)切酶Dra Ⅰ。將產(chǎn)物與Dra Ⅰ酶混合，體系為2 μL Buffer，17 μL PCR 產(chǎn)物和 1 μL 酶，在 37 ℃條件下以不同時間進行酶切反應，篩選出最佳反應時間。最后根據(jù)確定好的反應條件，對采自黑龍江省不同地點的馬血液樣進行檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 目的基因擴增結(jié)果

用合成的引物EP18SF 和EP18SR 擴增駑巴貝斯蟲、馬泰勒蟲和混合感染樣本18S rRNA 基因，PCR 擴增結(jié)果顯示，駑巴貝斯蟲陽性樣本、馬泰勒蟲陽性樣本，混合感染樣本均在1 500 bp 處出現(xiàn)明亮的條帶（圖1），說明該對引物可以很好的檢測出血液樣本中馬梨形蟲的感染。

圖1 馬梨形蟲18S rRNA 基因PCR 擴增結(jié)果Fig.1 PCR amplification results for 18S rRNA gene of equine piroplasm

2.2 PCR 產(chǎn)物的RFLP 鑒定結(jié)果

根據(jù)駑巴貝斯蟲和馬泰勒蟲18S rRNA 基因序列的軟件分析結(jié)果，選取限制性內(nèi)切酶Dra Ⅰ進行酶切鑒定，如圖2 顯示，該酶的酶切位點為5′ …TTT↓AAA…3′，駑巴貝斯蟲18S rRNA 基因上沒有該酶的酶切位點，馬泰勒蟲18S rRNA 基因可被該酶切開，產(chǎn)生兩條大小約為350 bp 和1 100 bp 的片段。酶切反應后凝膠電泳顯示，駑巴貝斯蟲樣本未被切開，馬泰勒蟲樣本被切成兩條帶，與上述大小一致，混合感染樣本形成350 bp，1 100 bp 和1 500 bp 的三條帶。分別用 15、30、45 min、1 h、1 h 15 min 和 1 h 30 min 對上述馬梨形蟲18S rRNA 基因的PCR 產(chǎn)物進行酶切反應，由圖3 可見，1 h 可達到最佳酶切效果，因此選取1 h 作為酶切反應的時間。

圖2 駑巴貝斯蟲和馬泰勒蟲18S rRNA 基因的限制性酶切位點Fig.2 Restriction sites of 18S rRNA gene in Babesia caballi and Theileria equi

圖3 不同酶切時間對馬梨形蟲18S rRNA 基因PCR 鑒別結(jié)果的影響Fig.3 Effect of different enzyme digestion time on PCR identification results of equine piroplasma

2.3 臨床樣本的鑒別結(jié)果

對2016-2020 年采自黑龍江省不同地點的45份馬梨形蟲陽性樣本進行PCR-RFLP 鑒定，電泳后成像結(jié)果如圖4 顯示，在45 份樣本中，駑巴貝斯蟲陽性為15 份，均未被切開；馬泰勒蟲陽性為36 份，切成大小為350 bp 和1 100 bp 的兩條帶，其中混合感染為6 份，酶切后均呈350、1 100 bp 和1 500 bp的三條帶。結(jié)果表明，實驗建立的PCR-RFLP 鑒別馬梨形蟲的方法可以對駑巴貝斯蟲、馬泰勒蟲以及混合感染進行鑒別，并且有較好的適用性。

圖4 臨床樣本PCR-RFLP 鑒別結(jié)果Fig.4 Results of PCR-RFLP identification of clinical samples

3 討論

根據(jù)OIE 的統(tǒng)計，馬梨形蟲病是全球范圍內(nèi)流行的蜱傳原蟲病[11]，從美國中部、南美、古巴、歐洲南部、亞洲到非洲，經(jīng)常有馬泰勒蟲和駑巴貝斯蟲的報道，加勒比海地區(qū)，其中包括特立尼達島在內(nèi)的幾個島嶼的馬梨形蟲感染病例也已經(jīng)被確認[12-13]。該病的傳播方式除了經(jīng)蜱叮咬傳播和馬泰勒蟲的垂直傳播外，醫(yī)源性血液傳播也不容忽視，最典型的例子就是美國佛羅里達州，一批賽馬在參加未經(jīng)批準的馬賽前，注射興奮劑時，針頭傳染了馬梨形蟲的陽性血液，導致大量的馬出現(xiàn)了明顯的臨床癥狀[14]。在我國，一部分養(yǎng)馬戶對該病的傳播方式了解不多，還有針頭共用、濫用抗生素的情況存在，不規(guī)范的養(yǎng)殖方式會導致疾病的快速傳播。而該病臨床癥狀特異性不強，難以與其他疾病區(qū)分，對疾病的及時發(fā)現(xiàn)和治療帶來不便，給養(yǎng)馬業(yè)帶來了嚴重的經(jīng)濟損失。因此，增加對該病原體的認識，了解疾病的預防措施與治療手段是十分重要的。

目前，還沒研制出能有效預防感染的疫苗[15]，各地區(qū)皆以預防為主。在流行性區(qū)域，由于蜱蟲的分布活動特性，主要的預防措施便是減少蜱蟲與馬接觸，加強檢測，及時診斷治療病馬，實行隔離政策。在非流行性國家，主要以加強監(jiān)控，控制從疫區(qū)進口外來馬為主。對于已經(jīng)感染的馬，治療的原則是早發(fā)現(xiàn)，早確診，早治療。咪唑苯脲被認為是減輕癥狀和消除寄生蟲最有效的藥物[9]，可以治療駑巴貝斯蟲感染，但個別馬泰勒蟲病例會對其有抗藥性[16]。使用時要注意劑量，連續(xù)注射或高劑量使用會對動物產(chǎn)生嚴重損害。驢和騾對三氮脒極其敏感，因此不推薦用此藥治療驢和騾[17]。用三氮脒治療馬梨形蟲在臨床上也很常見，但該藥會對注射部位的肌肉造成嚴重的損傷，且有些動物會產(chǎn)生呼吸困難和昏睡的不良反應。也有報道說三氮脒只對駑巴貝斯蟲有效，無法清除馬泰勒蟲[18]。土霉素只對馬泰勒蟲起作用，不能清除駑巴貝斯蟲，且目前已不在實踐中應用[19]。綜上，感染不同種梨形蟲，需要用相應的藥物根據(jù)不同劑量和用法來進行治療，快速有效鑒別馬梨形蟲的種類，可以指導臨床用藥，為馬梨形蟲病的防治提供基礎。

馬梨形蟲病的診斷方法有很多，包括形態(tài)學方法、免疫學方法和分子生物學方法。其中，形態(tài)學方法包括血涂片染色鏡檢法和淋巴結(jié)穿刺檢測法，但由于形態(tài)學方法敏感性低、準確性低，并不能適用于蟲種的鑒別檢測。血清學中，補體結(jié)合試驗是傳統(tǒng)血清學檢驗方法，但方法的操作過程復雜，熒光抗體的成本較高，目前應用極少。ELISA 方法是世界動物衛(wèi)生組織推薦的檢測馬梨形蟲的參考方法[11]，有較好的靈敏性與準確性，在生命科學各領域得到廣泛應用。但方法對實驗操作要求高，并且隨著蟲種不同基因亞型的發(fā)現(xiàn)，該方法也不完全適用。PCR 作為分子生物學的常規(guī)診斷方法，現(xiàn)在已成為檢測馬梨形蟲病比較常規(guī)的方法，目前已建立的檢測馬梨形蟲PCR方法較多，不同的方法引物可能不同，其目的基因分別 有 p82、RAP1、EMA1、EMA2、Bc48、Bc134 和 18S rRNA 等。但對于鑒別蟲種，還需要用不同的特異性引物擴增，經(jīng)過測序、序列比對后方能確定，這種方法檢測時間長，測序費用高，不適用于田間檢測[20]。

PCR-RFLP 是對等位特異性基因位點進行PCR擴增后，通過酶切PCR 產(chǎn)物電泳后獲得限制性片段的一種方法，目前已經(jīng)的應用于寄生蟲蟲種的分類鑒定上。對于原蟲的鑒別，張龍現(xiàn)等已經(jīng)成功建立了鑒別人畜隱孢子蟲種類的PCR-RFLP 方法[21]；賈西帥等建立的PCR-RFLP 方法可以直接鑒別出惡性瘧、三日瘧、間日瘧和卵形瘧血樣（包括curtisi 亞種和wallikeri 亞種）[22]；徐宗可等建立的PCR-RFLP 方法可鑒定莫氏巴貝斯蟲、呂氏巴貝斯蟲、尤氏巴貝斯蟲、綿羊巴貝斯蟲和巴貝斯蟲未定種這幾種感染羊的梨形蟲[23]。綜上，馬梨形蟲不同蟲種的鑒別，也可通過這種方式實現(xiàn)。實驗的結(jié)果表明，PCR-RFLP 鑒別駑巴貝斯蟲和馬泰勒蟲的方法簡單、快速、節(jié)約成本，可以進行準確鑒別。

4 結(jié)論

在研究中，建立的PCR-RFLP 方法可以很容易根據(jù)酶切后條帶的大小以及數(shù)量，將不同種類的馬梨形蟲進行鑒別。鑒別方法操作簡單，快速鑒別僅需0.5 個工作日，在保證高效率的同時還省去了測序費用，保證了低成本。進行臨床樣本檢測后可以發(fā)現(xiàn)，不同個體之間，保持著很高的穩(wěn)定性。方法可為鑒別馬梨形蟲蟲種，防控馬梨形蟲病提供有效的技術(shù)支持。