何曉蕾，任春元，王孟雪

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)，大慶 163319）

硒是維持機(jī)體正常生理功能的重要組成元素，目前，多數(shù)研究表明，人體缺乏硒容易引發(fā)如癌癥、克山病、脫發(fā)等疾病，因此，密切關(guān)注體內(nèi)硒的攝入量至關(guān)重要。硒是人體內(nèi)GSH-Px 酶的活性中心，參與細(xì)胞內(nèi)酶促反應(yīng)，催化過(guò)氧化物分解，防止脂質(zhì)過(guò)氧化，提高機(jī)體抗氧化能力[1-2]，與此同時(shí)，其具有增強(qiáng)非特異性免疫、吞噬細(xì)胞的存活率，提高抗體水平和細(xì)胞免疫功能[3-4]。據(jù)報(bào)道，因地域和自然環(huán)境的影響我國(guó)人均硒攝入量不足，部分人群處于硒缺乏的狀態(tài)[5]，開(kāi)發(fā)富硒產(chǎn)品變得尤為迫切。為短時(shí)間內(nèi)解決區(qū)域性硒元素短缺情況，通過(guò)制備富硒強(qiáng)化食品和農(nóng)產(chǎn)品來(lái)提高人均硒攝入量，增強(qiáng)人體免疫，具有廣闊的開(kāi)發(fā)空間。

大豆是世界上重要的經(jīng)濟(jì)作物之一，在我國(guó)北方廣泛種植，是重要的農(nóng)產(chǎn)糧食作物。其含有高達(dá)45%的大豆蛋白質(zhì)，25%的脂肪，只有近5%的淀粉。大豆不只作為油的提取原料，亦可為人類日常所需提供優(yōu)質(zhì)蛋白。大豆肽是以大豆蛋白為原料，當(dāng)大豆中的大分子蛋白質(zhì)經(jīng)酶水解后、純化可得到易被人體消化吸收的大豆蛋白肽。大豆蛋白肽能夠保護(hù)人體健康，預(yù)防某些類型的癌癥、降低膽固醇、降低血脂血壓、清除體內(nèi)自由基，有效地維持機(jī)體機(jī)能，對(duì)人體器官也有保護(hù)的作用，近年來(lái)學(xué)者對(duì)此方面功能性的研究也頗感興趣。

硒主要有兩種形態(tài)，無(wú)機(jī)態(tài)硒和有機(jī)態(tài)硒[6]，但無(wú)機(jī)態(tài)硒不易被人體快速吸收，且就人體而言，無(wú)機(jī)態(tài)硒攝入后對(duì)身體健康有毒害，而有機(jī)態(tài)硒則是提供人體有效硒元素的主要途徑。目前，隨著人們對(duì)健康飲食習(xí)慣理念的執(zhí)著追求，消費(fèi)者更傾向于直接從日常食物中獲取硒元素。王鳳杰等[7]研究表明，富硒大豆蛋白能提高小鼠的抗疲勞能力，增強(qiáng)抗氧化酶的活力[7-8]、促進(jìn)免疫器官的發(fā)育、抑制腫瘤的生長(zhǎng)[9]，且無(wú)毒副作用，是一種優(yōu)質(zhì)的硒補(bǔ)充劑。富硒大豆肽能緩解大鼠氧化應(yīng)激損傷，提高GSH-Px、SOD 活性、降低MDA 含量[10-11]。由此可見(jiàn)，硒的諸多重要生物學(xué)功能都是通過(guò)硒蛋白來(lái)實(shí)現(xiàn)的，也能夠被人體吸收維持生長(zhǎng)代謝。但是，當(dāng)前有關(guān)富硒大豆蛋白以及蛋白肽的研究大都集中在制備、簡(jiǎn)單的理化性質(zhì)測(cè)定、毒理性及抗氧化性等功能性的研究，對(duì)于東北富硒大豆蛋白肽的生理活性研究相對(duì)較少。故而，研究將東北黑土地大豆作為富硒的中間載體，通過(guò)亞硒酸鈉溶液對(duì)大豆浸泡和萌發(fā)的過(guò)程，實(shí)現(xiàn)大豆富集和生物轉(zhuǎn)化，制備得到富硒大豆，用蛋白酶對(duì)富硒大豆蛋白進(jìn)行酶解，制備富硒大豆肽，同時(shí)，將普通市售大豆為參照組，測(cè)定其體內(nèi)的抗氧化活性、免疫功能性的變化，以期為硒元素的富集與轉(zhuǎn)化提供理論支撐，為拓寬品種豐富的富硒大豆食品、農(nóng)作物加工產(chǎn)品和口服液產(chǎn)品新途徑奠定前期研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

具體實(shí)驗(yàn)材料試劑見(jiàn)表1。

表1 實(shí)驗(yàn)用試劑Table 1 Reagents for experiments

1.2 儀器與設(shè)備

實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備見(jiàn)表2。

表2 實(shí)驗(yàn)用儀器設(shè)備Table 2 Instruments used in this study

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 富硒大豆肽的制備

經(jīng)過(guò)前期單因素及正交預(yù)實(shí)驗(yàn)獲得制備富硒大豆的最優(yōu)工藝。內(nèi)容如下：稱取顆粒飽滿、無(wú)蟲(chóng)蛀、無(wú)霉?fàn)€的富硒大豆樣品200 g，采用濃度為50 μg·L-1亞硒酸鈉溶液30 ℃浸泡48 h，得到芽長(zhǎng)為2 mm 的富硒大豆。對(duì)照組為市售大豆樣品200 g，處理方式同實(shí)驗(yàn)組樣品一樣。將上述樣品烘干、粉碎、過(guò)100 目篩備用。

采用堿提酸沉法制[12]備富硒大豆蛋白，分別稱取上述富硒大豆粉和普通大豆粉各 10 g，按 1∶10（m·v-1）加入去離子水混合攪拌，用1 mol·L-1的NaOH 溶液調(diào) pH 至 10，料液比為 1∶9 攪拌 20 min，4 500 r·min-1離心 8 min，上清液 pH 調(diào)至 4.6，4 500 r·min-1離心8 min，蒸餾水溶解沉淀透析24 h 后冷凍干燥備用。

富硒大豆蛋白肽的制備，石油醚脫脂烘干，中性蛋白酶水解后，15 min 沸水域滅酶，透析24 h 即制得富硒大豆蛋白肽，純度88.45%。

1.3.2 大豆肽硒含量的檢測(cè)

取樣品0.2 g 置于錐形瓶中，加10 mL 硝酸和高氯酸的混合液消化24 h 后，用電熱板加熱并補(bǔ)加硝酸直到剩余體積為2 mL 左右，加5 mL 6 mol·L-1鹽酸溶液后加入 2.5 mL 鐵氰化鉀溶液（100 g·mL-1）定容混勻待測(cè)。樣品測(cè)定條件為硒空心陰極燈，進(jìn)樣條件，樣品體積：2 mL，95 mA 電流，載氣流量 500 mL·min-1，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算硒含量。

1.3.3 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)分組及給藥

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)分為3 組，每組10 只小鼠，根據(jù)《保健食品功能學(xué)評(píng)價(jià)程序和檢驗(yàn)方法-2003》擬定給藥劑量[12]將制得的富硒大豆肽進(jìn)行小鼠實(shí)驗(yàn)，基礎(chǔ)飼喂7 d 后連續(xù)灌胃給藥30 d。

表3 功能實(shí)驗(yàn)分組Table 3 Groups of function test

1.3.4 生長(zhǎng)指標(biāo)的測(cè)定

小鼠停藥后隔天致死，準(zhǔn)確稱取以下各項(xiàng)指標(biāo)，按公式1 和公式2 分別計(jì)算脾臟和胸腺指數(shù)。

1.3.5 抗氧化酶活性的測(cè)定

按照SOD 和GSH-Px 試劑盒說(shuō)明書(shū)的操作規(guī)定，檢測(cè)小鼠肝臟組織和血清勻漿中超氧化物歧化酶（SOD）活性和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）活性。

1.3.6 小鼠體液免疫能力的測(cè)定

（1）小鼠巨噬細(xì)胞增殖能力的測(cè)定

采用WST-1 法檢測(cè)細(xì)胞增殖：無(wú)菌環(huán)境中取出末次給藥1 h 后處死的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞懸液，離心后于37 ℃ DMEM 培養(yǎng)基中培養(yǎng)2 h，450 nm 處測(cè)定吸光值[13]。

（2）吞噬能力的測(cè)定

靜脈注射印度墨汁于小鼠尾（10 mg·kg-1），在2 min 和 10 min 時(shí)取 20 μL 的眼血于 3 mL 0.1%的Na2CO3溶液中，600 nm 處測(cè)定吸光值（OD）。分別取肝臟及脾臟稱重，計(jì)算小鼠吞噬指數(shù)A[12]。

式中：A 為吞噬指數(shù)；m 為小鼠體重（g）；m0為小鼠肝重（g）；m1為小鼠脾重（g）；OD1為 2 min 時(shí)吸光值；OD2為 10 min 時(shí)吸光值。

（3）小鼠免疫球蛋白水平的測(cè)定

按照IgA、IgG 試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)小鼠血清及肝臟中免疫球蛋白含量。

1.3.7 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 20 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 大豆肽硒含量的檢測(cè)

利用亞硒酸鈉溶液浸泡大豆制備富硒大豆，操作簡(jiǎn)便，簡(jiǎn)化繁瑣種植程序，并可節(jié)約成本，提高大豆中硒的富集率。東北大豆肽中硒的含量由表4 可知，普通大豆總硒含量為 16.53 μg·g-1，而經(jīng)過(guò)亞硒酸鈉浸泡后的富硒大豆總硒含量為26.25 μg·g-1；普通大豆蛋白總硒含量40.25 μg·g-1，富硒大豆是42.28 μg·g-1；普通大豆肽總硒含量 5.67 μg·g-1，富硒大豆肽總硒含量14.37 μg·g-1。由此可見(jiàn)亞硒酸鈉可實(shí)現(xiàn)大豆硒含量的有效富集，提高大豆?fàn)I養(yǎng)成分。但是，通過(guò)硒含量的變化數(shù)據(jù)可以看出，在提取大豆肽時(shí)，硒含量也會(huì)隨著純化過(guò)程而隨之減少了12 μg·g-1，為緩解大豆肽中硒含量的減少應(yīng)在后續(xù)的研究中不斷優(yōu)化提取工藝。

表4 大豆肽硒含量Table 4 Selenium content

2.2 富硒大豆肽對(duì)小鼠生長(zhǎng)性能的影響

2.2.1 富硒大豆肽對(duì)體重指數(shù)的影響

利用實(shí)驗(yàn)室制備的富硒大豆蛋白肽飼養(yǎng)小鼠，研究富硒大豆蛋白肽對(duì)小鼠生長(zhǎng)性能的影響。結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)期間小鼠精神狀態(tài)良好，未表現(xiàn)神經(jīng)及其他系統(tǒng)的中毒現(xiàn)象，說(shuō)明不同劑量組富硒大豆肽對(duì)小鼠無(wú)毒副作用。圖1 為灌胃富硒大豆肽的小鼠體重的變化數(shù)值，與普通小鼠相比，隨著富硒大豆蛋白肽含量的增加，SH 和SM、SL 三組的小鼠體重?cái)?shù)值也隨之增加，其中SH 組小鼠體重增長(zhǎng)最為顯著，體重?cái)?shù)值為32.22 g。通過(guò)小鼠體重的變化，不難發(fā)現(xiàn)，富硒大豆肽可以提高小鼠的代謝能力，滿足其生長(zhǎng)必須的微量元素，促進(jìn)其健康生長(zhǎng)。

圖1 富硒大豆肽對(duì)小鼠體重的影響Fig.1 Effect of selenium-enriched soybean peptide on mice's weight

2.2.2 富硒大豆肽對(duì)免疫器官指數(shù)的影響

胸腺和脾臟作為重要的免疫器官之一，參與機(jī)體免疫調(diào)節(jié)，其中胸腺作為一級(jí)免疫器官，其不僅促進(jìn)T 淋巴細(xì)胞的分化與成熟，同時(shí)也分泌胸腺素，參與機(jī)體的細(xì)胞免疫；脾臟是一種含有大量淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的外周免疫器官[13-14]，二者可反映機(jī)體免疫功能的強(qiáng)弱。圖2 為富硒大豆蛋白肽對(duì)小鼠免疫器官指數(shù)的影響，由圖可知，與對(duì)照組相比，不同劑量組的大豆富硒肽樣品對(duì)小鼠免疫器官指數(shù)存在明顯差異，中、高劑量組可顯著提高小鼠（P＜0.05）免疫器官指數(shù)，其中高劑量組胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)分別為0.51%和0.31%。這表明東北大豆肽中硒含量愈高，愈可被小鼠吸收，其免疫能力就有所提高，這可能與小分子肽易于小鼠對(duì)硒元素的吸收有關(guān)。

圖2 大豆富硒肽對(duì)小鼠免疫器官指數(shù)的影響Fig.2 Effect of selenium-enriched soybean peptide on immune organ index in mice

2.3 富硒大豆肽對(duì)小鼠生體內(nèi)抗氧化活性的影響

2.3.1 血清、肝臟中SOD 活性

機(jī)體代謝過(guò)程中隨時(shí)都在發(fā)生氧化反應(yīng)，產(chǎn)生的自由基需要及時(shí)清除，在體內(nèi)積聚過(guò)多便會(huì)損傷機(jī)體。SOD 是人體內(nèi)抗氧化酶防御體系中最重要的酶之一，能較好的清除O2-，降低或阻止O2-對(duì)機(jī)體細(xì)胞和組織的損害[15-16]，保護(hù)細(xì)胞不受自由基的破壞。大豆富硒肽對(duì)小鼠血清、肝臟中SOD 活性的影響如圖3 所示。與參照組相比，低、中、高劑量組均顯著提高（P＜0.05）肝臟中的 SOD 值，最高值可達(dá) 223.5 U·g-1；而SM、SH 組血清的SOD 值升高較顯著，SOD 活性明顯提高，數(shù)值在 147.6 U·g-1到 152.3 U·g-1之間。肝臟和血清中SOD 值的增加說(shuō)明富硒大豆肽能夠清除體內(nèi)的自由基，具有較好的抗氧化、清除自由基的能力；蛋白肽中的硒含量越多，抗氧化能力越強(qiáng)。

圖3 富硒大豆肽對(duì)小鼠血清、肝臟中SOD 活性的影響Fig.3 Effect of selenium-enriched soybean peptide on activity of SOD in serum and liver of mice

2.3.2 血清、肝臟中GSH-Px 活性

血清和肝臟中GSH-Px 含量是衡量機(jī)體抗氧化應(yīng)激能力的關(guān)鍵指標(biāo)之一[17]，與SOD 相同都是機(jī)體中重要的抗氧化活性組分，既能保護(hù)許多蛋白和酶等分子中的巰基，并能保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能完整，防止免疫細(xì)胞或組織的損傷[18]，能有效保持細(xì)胞的穩(wěn)定性，從而保護(hù)細(xì)胞結(jié)構(gòu)，其含量的升高表明機(jī)體清除氧自由基的能力增強(qiáng)[19]。由圖4 GSH-Px 活性的數(shù)值變化可以看出，富硒大豆肽低、中、高劑量組較參照組血清中的GSH-Px 活性均明顯增強(qiáng)，數(shù)值分布在896.4～986.3 U·g-1之間；肝臟中的 GSH-Px 活性在中、高劑量組增加的較明顯，最高可達(dá)1 100.7 U·g-1。這表明富硒大豆肽含量的多少對(duì)血清的抗氧化性影響較大，在肝臟中則需要相對(duì)較高濃度的富硒大豆蛋白肽方能提高其抗氧化性能。

圖4 富硒大豆肽對(duì)小鼠血清、肝臟中GSH-Px 活性的影響Fig.4 Effect of selenium-enriched soybean peptide on activity of GSH-Px in serum and liver of mice

2.4 富硒大豆肽對(duì)小鼠體液免疫的影響

2.4.1 富硒大豆富硒肽對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞增殖能力的影響

RAW264.7 細(xì)胞屬于巨噬細(xì)胞的一種，參與體液免疫，其吞噬能力是衡量機(jī)體非特異性免疫功能的重要指標(biāo)之一，當(dāng)病原體入侵或自身組織出現(xiàn)病理性改變時(shí)，它能激活機(jī)體的免疫系統(tǒng)，通過(guò)細(xì)胞內(nèi)殺傷作用消滅抗原[12]。富硒大豆肽對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞增殖能力的影響如圖5 所示，隨著富硒大豆蛋白肽含量的增加，小鼠的巨噬細(xì)胞增值能力持續(xù)增強(qiáng)，當(dāng)富硒蛋白肽含量最高時(shí)，小鼠體內(nèi)最大A490 值為0.61，表明小鼠免疫力作用有所提高，體液免疫能力增強(qiáng)。

圖5 富硒大豆肽對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞增殖能力的影響Fig.5 Effect of selenium-enriched soybean peptide on macrophage proliferation in mice

2.4.2 富硒大豆富硒肽對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞吞噬能力的影響

巨噬細(xì)胞通過(guò)吞噬侵入的病原體及體內(nèi)衰老、畸變的細(xì)胞進(jìn)而提高機(jī)體的免疫能力，其吞噬能力的大小可以間接反映機(jī)體巨噬細(xì)胞的吞噬能力和機(jī)體的非特異性體液免疫水平[21]。小鼠巨噬細(xì)胞吞噬能力的影響與富硒大豆肽之間的關(guān)系如圖6 所示，對(duì)照組的吞噬指數(shù)是16.5%，富硒大豆肽含量的增加使得SL、SM、SH 三組小鼠吞噬細(xì)胞的吞噬指數(shù)較普通對(duì)照組明顯增加，高劑量組小鼠的吞噬指數(shù)為19.8%。這表明富硒大豆肽可以通過(guò)提高小鼠巨噬可促進(jìn)巨噬細(xì)胞吞噬能力和增殖能力，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞對(duì)機(jī)體的體液免疫能力水平。

圖6 富硒大豆肽對(duì)小鼠吞噬指數(shù)的影響Fig.6 Effect of selenium-enriched soybean peptide on mice's phagocytic index

2.4.3 富硒大豆富硒肽對(duì)小鼠免疫球蛋白水平的影響

免疫球蛋白是存在于動(dòng)物血液及某些細(xì)胞的表面上，具有抗體活性[22]，在測(cè)定體液免疫活性時(shí)，常用血清免疫球蛋白來(lái)證明體液免疫功能的強(qiáng)弱。IgG 代表著血清主要的抗體成分、IgA 可通過(guò)抑制微生物在呼吸道上皮附著，阻礙病毒繁殖，防止病原體入侵對(duì)機(jī)體造成傷害，二者作為衡量小鼠體液免疫功能情況的指標(biāo)。富硒大豆肽對(duì)小鼠免疫球蛋白水平的影響如圖7 所示，SL、SM 組的免疫蛋白活性IgA 值與參照組相比，變化不顯著，SH 組變化相較于其他組變化明顯，為278 mg·L-1，這可以看出是與富硒大豆蛋白肽中的硒含量有關(guān)，可提高小鼠免疫能力。與此同時(shí)，隨著富硒大豆肽劑量的增多，免疫球蛋白IgG 數(shù)值變化平穩(wěn)增加，高劑量組IgA 值為490 mg·L-1。綜合兩種數(shù)值，不難看出富硒大豆肽對(duì)小鼠免疫蛋白有一定的影響，隨著其增加，免疫活性增加，抵抗能力增強(qiáng)。

圖7 大豆富硒肽對(duì)小鼠體液免疫功能的影響Fig.7 Effect of selenium-enriched soybean peptide on mice's humoral immunity

3 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)通過(guò)堿提酸沉法制備富硒大豆蛋白，經(jīng)過(guò)蛋白酶水解和純化得到富硒大豆蛋白肽，測(cè)定了東北富硒大豆蛋白肽中總硒的含量為14.37 μg·g-1。隨著富硒大豆肽含量增加，小鼠抗氧化活性指標(biāo)SOD和GSH-Px 值也在不斷增加，最高值血清SOD 為152.3 U·g-1，GSH-Px 為 986.3 U·g-1；肝臟 SOD 為223.5 U·g-1，GSH-Px 為 1 100.7 U·g-1。結(jié)果表明，富硒大豆肽可提高小鼠清除自由基提高抗氧化的能力。通過(guò)對(duì)小鼠體液免疫指標(biāo)如巨噬細(xì)胞增殖能力、巨噬細(xì)胞吞噬能力、免疫球蛋白IgA，IgG 的測(cè)定，可以看出富硒大豆蛋白肽能夠提高體液免疫系統(tǒng)的防御能力，維持機(jī)體的健康環(huán)境。研究對(duì)比不同灌胃劑量富硒大豆蛋白肽的小鼠生長(zhǎng)性能，如體重指數(shù)、免疫器官指數(shù)的測(cè)定，及對(duì)小鼠體液免疫的研究證實(shí)，硒依托大豆肽為載體，易于被小鼠吸收，促進(jìn)生長(zhǎng)代謝，顯著提高抗氧化能力和體液免疫水平，后續(xù)研究中可以考慮探究滿足其生長(zhǎng)所需的富硒大豆蛋白肽最佳含量，為人體科學(xué)合理補(bǔ)硒奠定理論基礎(chǔ)。