王新惠，劉力嘉，丁悅，孫勁松，潘攀，張雅琳，龐紫琳，劉洋,

(1.成都大學 食品與生物工程學院，成都 610106；2.宜賓學院 固態(tài)發(fā)酵資源利用四川省重點實驗室，四川 宜賓 644000)

芽菜是在我國四川南部較為盛行的一道傳統(tǒng)醬腌菜，由新鮮的芥菜莖部通過清洗、劃絲、晾曬、腌制、發(fā)酵等工藝制作而成[1]。芽菜發(fā)酵是芽菜制作過程中重要的環(huán)節(jié)，因為芽菜的風味主要來源于發(fā)酵環(huán)境中微生物代謝活動[2-3]。

芽菜自然發(fā)酵過程中會有微生物群落結構變化，這也是影響芽菜風味和食用安全性的關鍵點。但是，目前對于芽菜中的微生物菌群結構和多樣性分析并未完全了解。在過去的研究中，主要有依賴微生物的培養(yǎng)特點和形態(tài)學的傳統(tǒng)培養(yǎng)分離方法來探索發(fā)酵食品中菌群。馬長路等[4]通過傳統(tǒng)培養(yǎng)分離的方法從東北酸菜中分離出植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)；尹曦等[5]用傳統(tǒng)培養(yǎng)分離方法發(fā)現(xiàn)宜賓芽菜中主要有戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)、植物乳桿菌。但依靠形態(tài)學來鑒定微生物常常不夠全面，因為能通過培養(yǎng)基進行培養(yǎng)的菌群很少，所以傳統(tǒng)的方式不能全面地認識發(fā)酵環(huán)境中的菌群結構。隨后基于PCR的檢測手段出現(xiàn)，主要有PCR-DGGE技術、EIRC-PCR技術和RFLP技術等。張先琴[6]通過PCR-DGGE技術分析了芽菜中的微生物群落結構，但無法有一個準確的定量；荊雪嬌[7]通過PCR-DGGE技術發(fā)現(xiàn)短乳桿菌為泡菜和酸菜的優(yōu)勢菌群，彎曲乳桿菌在泡菜和浙江榨菜中為優(yōu)勢菌群，消化乳桿菌和食用糖乳桿菌分別為酸菜和醬菜的優(yōu)勢菌群，但基于PCR的技術手段往往因為要凝膠電泳，圖譜復雜且存在工作量大、靈敏度有限等缺點。近幾年，高通量測序技術的誕生為了解微生物菌群結構提供了新的解決方案，因其具有無需克隆、測序量大、速度快等特點[8-10]而廣泛應用于檢測植物病毒、畜禽、食源性病原體[11]等。楊柳等[12]利用高通量測序發(fā)現(xiàn)在辣白菜中Weissella菌屬與菌落計數(shù)相距最近，同時也與總酸含量的呈味物質呈正相關，其貢獻率最好，其他菌屬呈負相關，說明Weissella菌屬對主要呈味物質有重要作用。賈晶晶等[13]利用高通量測序技術對12%食鹽濃度發(fā)酵的腌漬白菜液分析得出共有6個菌門。最優(yōu)勢菌門為變形菌門，其相對含量高達67.01%，丙型變形菌綱相對含量為99.17%，為其主要優(yōu)勢菌綱，其中普羅威登斯菌屬為最優(yōu)勢菌屬。由此可以看出高通量測序技術對微生物群落多樣分析是較準確且完備的。

本研究重點在于利用高通量測序技術從門、種水平上研究市場上不同品牌的宜賓芽菜之間微生物群落結構差異性及是否存在有害菌，在檢測市場產品的安全性的同時也為廠家在發(fā)酵過程中規(guī)避一些不必要的有害微生物繁殖起到提醒作用。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

宜賓芽菜：購于宜賓敘州區(qū)當?shù)刭Q易市場，購買3種不同廠家的袋裝芽菜，分別編號C1、C2、C3。所有樣品均為無菌采樣，使用無菌塑封袋包裝后置于-80 ℃冰箱中保存待測。

圖1 3種芽菜樣品Fig.1 Three kinds of sprout samples

1.2 試驗試劑與儀器

E.Z.N.ATMMag-Bind Soil DNA提取試劑盒 美國Omega公司；通用型恒壓恒流電泳儀；Applied Biosystems?Gene Amp?PCR System 9700 PCR儀；QIAquick Gel Extraction Kit凝膠回收試劑盒 Qiagen公司；Qubit 2.0微量熒光核酸定量儀 ThermoFisher公司；X1R高速冷凍離心機 美國Thermo公司；HiSeq測序儀、HiSeq Rapid SBS Kit v2 (FC-402-4023 500 Cycle)測序試劑盒 美國Illumina公司；其他所需試劑均購自成都市科隆化學品有限公司。

1.3 DNA提取和PCR測序、擴增

使用特定的DNA提取試劑盒進行基因組DNA提取后，使用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA。引物引用：515F(5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′)和 806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)，以稀釋后的基因組DNA為模板，根據(jù)測序區(qū)域的選擇，使用帶Barcode的特異引物進行PCR。每一個25 μL的體系包括1×PCR buffer、1.5 mmol/L MgCl2、0.4 μmol/L dNTPs、正向和反向引物各1.0 μmol/L、0.5 U KOD-Plus-Neo酶(Toyobo公司)和10 ng模板。PCR程序包括起始94 ℃ 1 min，然后30次循環(huán)(變性94 ℃ 20 s，退火54 ℃ 30 s和延伸72 ℃ 30 s)，最后72 ℃ 5 min。 每個樣本進行3個PCR技術重復。PCR與1/6體積的6 loading buffer混合，使用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。取目的條帶用來回收，回收使用 QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen公司)。使用Qubit@2.0 Fluorometer (Thermo Scientific公司)定量。最后等摩爾量混合。建庫使用 TruSeq DNA PCR-Free Sample Prep Kit，構建好的文庫經過定量和文庫檢測合格后，使用HiSeq 2500平臺PE250模式測序。

1.4 數(shù)據(jù)分析

首先使用FLASH[14]拼接雙端序列，截去Barcode序列得到原始數(shù)據(jù)，然后使用Trimmomatic進行質控。在Usearch軟件[15]基礎上，使用UPARSE算法在97%水平上進行OTU聚類，再用R語言進行各種數(shù)據(jù)轉換，最后用ggplot2包作圖。對于Alpha多樣性分析，PD指數(shù)的計算使用Picante包，其他指數(shù)使用Vegan包。對于Beta多樣性分析，使用GUniFrac包計算UniFrac距離。

2 結果與分析

2.1 芽菜中細菌群落Alpha多樣性分析

Alpha多樣性指數(shù)主要有細菌菌群豐度指數(shù)Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)，細菌菌群多樣性指數(shù)Simpson指數(shù)和Shannon指數(shù)。3種不同品牌的宜賓芽菜中細菌菌群多樣性結果見表1。

表1 3種宜賓芽菜中細菌群落豐度和多樣性Table 1 The abundance and diversity of bacterial community in the three kinds of sprout samples

由表1可知，C3樣本中細菌菌群豐度最高，而C2樣本中細菌菌群的豐度最低。從芽菜中細菌菌群多樣性指數(shù)的結果發(fā)現(xiàn)，C1樣本中的細菌菌群多樣性最高，C2樣本中的細菌菌群多樣性最低。3種芽菜在細菌菌群多樣性和豐度上具有一定的差異，這可能是由于原料的選擇、制作工藝以及滅菌條件的不同造成的。

2.2 細菌群落韋恩圖分析

將細菌序列在97%相似水平上定義為一個OTU，對3種宜賓芽菜中細菌的OTU進行分析得到OTU韋恩圖，見圖2。

圖2 3種包裝宜賓芽菜的OTU韋恩圖分析Fig.2 OTU Venn diagram analysis of three kinds of packaged Yibin sprouts

由圖2可知，3個樣品共測得1948個OTUs。C1中測得1351個OTUs，C2中測得1315個OTUs，C3中測得1444個OTUs，3種宜賓芽菜中共有727個OTUs，結果表明，3種芽菜細菌群落結構之間存在一定差異，但相比3種芽菜共有菌落，每種芽菜獨有菌落占比更小。

2.3 微生物相對豐度曲線

根據(jù)OTU豐度，使用Rank-Abundance曲線對樣本多樣性進行評估，得到相對豐度曲線，見圖3。

圖3 3組樣品的相對豐度曲線Fig.3 The relative abundance curves of three groups of samples

曲線的平滑程度反映了樣本中物種的均勻度，可以看出隨著測序加深，序列增加，各個樣品的曲線斜率逐漸減小，呈現(xiàn)一個趨于平緩的態(tài)勢，說明物種分布較均勻。而曲線在水平橫軸上的范圍越大，說明物種豐度越高，由圖3可知C3樣品的物種豐度最高，C1次之，C2最低。

2.4 細菌群落在門水平上的結構差異分析

在門的水平上對3種宜賓芽菜中細菌菌群結構進行分析，結果見圖4。

圖4 門水平上不同芽菜樣品的細菌豐度Fig.4 The bacterial abundance of different sprout samples at phylum level

由圖4可知，3種芽菜中優(yōu)勢菌門均是厚壁菌門(Firmicutes)，C1樣本中厚壁菌門占比為43.77%，在C2樣本中占比為50.73%，在C3樣本中占比為45.59%。厚壁菌門會參與膳食植物多糖代謝[16]；其次是擬桿菌門(Bacteroidetes)，擬桿菌門在C1、C2和C3樣本中占比分別是22.53%、21.98%和23.77%。Ley等[17]發(fā)現(xiàn)厚壁菌門與擬桿菌門的比例降低對減輕體重有直接的影響，在肥胖受試者中通常厚壁菌門含量較高，擬桿菌門含量較低,因此在樣本中若擬桿菌門比例較高，可能起到抑制人體脂肪沉積的積極作用。在樣本中還檢測出變形菌門(Proteobacteria)，少數(shù)的奇古菌門(Thaumarchaeota)、綠彎菌門(Chloroflexi)、 廣古菌門(Euryarchaeota)、放線菌門(Actinobacteria)、醋桿菌門(Acidobacteria)、螺旋體門(Spirochaetes)等。其中，變形菌門屬于革蘭氏陰性細菌，它們具有分泌脂多糖的能力，而脂多糖可以作為內毒素，容易引起腸道炎癥[18]。對此，我們日常飲食可以注意多食用高纖維或碳水化合物改善腸道菌群來降低炎癥發(fā)生的概率。

2.5 細菌群落在種水平上的結構差異分析

在種的水平上對3種宜賓芽菜中細菌結構進行分析，結果見圖5。

圖5 種水平上不同芽菜樣品的細菌豐度熱圖Fig.5 The heat map of bacterial abundance of different sprout samples at genus level

由圖5可知，在3組樣品中豐度前三的優(yōu)勢菌種一致，分別為鼠乳桿菌(Lactobacillusmurinus)、禽乳桿菌(Lactobacillusaviariu)、格氏乳桿菌(Lactobacillusgasseri)，共屬于乳酸桿菌屬(Lactobacillusspp.)，乳酸桿菌具有嗜酸的特點，因此廣泛分布于傳統(tǒng)醬腌菜中。優(yōu)勢菌種鼠乳桿菌在3組樣品中占比分別為10.51%、9.87%、11.92%。鼠乳桿菌在腸道中起著調節(jié)腸道菌群，增強腸道屏障的功能[19-20]，Huang等[21]研究發(fā)現(xiàn)，鼠乳桿菌可以作為一種功能性的益生菌來對抗食物過敏。禽乳桿菌屬于革蘭氏陽性菌，具有產生細菌素和有機酸的能力，可以抑制病原體和炎癥反應[22]，它在3種芽菜樣品中占比分別為4.70%、9.82%、5.05%，其中禽乳桿菌在C2中占比最大，而在C1中占比最小。格氏乳桿菌在3組樣品中占比分別為2.56%、2.94%、2.42%，Kyoung等[23]研究發(fā)現(xiàn)格氏乳桿菌會影響體內代謝因子，與Cudraniatricuspidata協(xié)同作用調節(jié)代謝功能，發(fā)現(xiàn)了一種新的作為肥胖與消瘦的生物標志物。此外，還發(fā)現(xiàn)了彎曲乳桿菌(Lactobacilluscurvatus)，有研究表明彎曲乳桿菌具有較高的穩(wěn)定性，對單核增生細菌有顯著的抑制作用，從而起到改善發(fā)酵香腸安全的作用[24-25]。同時，3個樣品中均含有羅伊乳桿菌(Lactobacillusreuteri)，它常用于嬰幼兒保健食品益生菌使用，可以促進腸道蠕動，增加人體免疫力[26]。特別注意的是有腐敗致病菌被檢測出，其中一個是腦膜炎嗜冷桿菌(Psychrobactermeningitidis)，它可以產生褐藻酸降解菌快速吸收水分從而導致紫菜出現(xiàn)病斑進而腐敗[27]，因此在芽菜中可能存在加速腐敗的效果；此外還檢測出熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)，有研究表明熒光假單胞菌常附著于醬腌菜表面，存在還原硝酸鹽生成亞硝酸鹽的情況，因此可能對食品安全有不良影響[28]。另外，我們還檢測到了產酸擬桿菌(Bacteroidesacidifaciens)，Marques F Z等[29]發(fā)現(xiàn)Bacteroidesacidifaciens等腸道菌群數(shù)量會增加高血壓小鼠發(fā)生心力衰竭概率， Kang Chil-sung等[30]發(fā)現(xiàn)Akkermansiamuciniphila、Bacteroidesacidifaciens的減少與DSS誘導的結腸炎相關。

總體上，在種水平上的有益功能菌主要有鼠乳桿菌(Lactobacillusmurinus)、禽乳桿菌(Lactobacillusaviariu)、格氏乳桿菌(Lactobacillusgasseri)、羅伊乳桿菌(Lactobacillusreuteri)，腐敗致病菌主要有腦膜炎嗜冷桿菌(Psychrobactermeningitidis)、熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)、產酸擬桿菌(Bacteroidesacidifaciens)。在傳統(tǒng)工藝下生產的芽菜，發(fā)酵菌群主要來源于原輔料和生產環(huán)境中，如何減少腐敗致病菌和擴大優(yōu)勢菌種是提高芽菜食用安全性和風味的關鍵點。

2.6 Beta多樣性分析

對3種芽菜中細菌菌群結構進行主成分分析，結果見圖6。

圖6 不同芽菜樣品的PCA分析Fig.6 PCA analysis of different sprout samples

橫坐標PC1為第一主成分，它對3種樣品差異的貢獻值為56.5%，縱坐標PC2為第二主成分，它對3種樣品差異的貢獻值為43.5%。3個不同芽菜樣本之間的距離較遠，結果表明3個芽菜中細菌菌群結構相差較大。

3 結論

本文采用高通量測序技術對3種不同宜賓芽菜中的細菌菌群結構進行分析，結果表明，3種宜賓芽菜中，C3樣本中細菌菌群豐度最高，而在C1樣本中，細菌菌群多樣性最高。此外，共檢測到3種宜賓芽菜中共有727個OTUs，3種芽菜具有一定相似性。在門的水平上，對3種宜賓芽菜中細菌菌群結構分析，發(fā)現(xiàn)厚壁菌門是優(yōu)勢菌門，在C1、C2和C3中占比分別為43.77%、50.73%和45.59%。在種的水平上對3種宜賓芽菜中細菌菌群結構進行分析，發(fā)現(xiàn)鼠乳桿菌是3種宜賓芽菜中的優(yōu)勢菌種，它在C1、C2、C3中占比分別為10.51%、9.87%、11.92%。其次分別是禽乳桿菌(Lactobacillusaviariu)、格氏乳桿菌(Lactobacillusgasseri)。禽乳桿菌在C1、C2、C3中占比分別為4.70%、9.82%、5.05%，格氏乳桿菌在C1、C2、C3中占比分別為2.56%、2.94%、2.42%。

通過高通量測序技術，能快速、準確地分析芽菜發(fā)酵環(huán)境中的細菌菌群結構，本研究發(fā)現(xiàn)市面售賣的宜賓芽菜中主要功能菌是鼠乳桿菌(Lactobacillusmurinus)、禽乳桿菌(Lactobacillusaviariu)、格氏乳桿菌(Lactobacillusgasseri)、羅伊乳桿菌(Lactobacillusreuteri)，但也存在部分腐敗致病菌，如腦膜炎嗜冷桿菌(Psychrobactermeningitidis)、熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)、產酸擬桿菌(Bacteroidesacidifaciens)。本研究為芽菜的生產、包裝、運輸?shù)冗^程中的微生物控制提供了參考，同時也為后期對芽菜的深入研究提供了理論基礎。