鐵煒煒，葛芬芬

宮頸癌的臨床治療以手術(shù)為主，但是腫瘤的復(fù)發(fā)率及轉(zhuǎn)移率一直居高不下，難以防范[1]。因此，如何快速尋找到該疾病治療與轉(zhuǎn)移的分子標(biāo)記和靶點(diǎn)至關(guān)重要，為其早期診斷及治療提供相應(yīng)的參考依據(jù)。miRNA是一類長(zhǎng)度為單鏈的非編碼微小RNA，其穩(wěn)定性高度遺

傳，主要通過(guò)其下游靶基因調(diào)控腫瘤的發(fā)生及發(fā)展[2]。有研究發(fā)現(xiàn)miR-485-5p的表達(dá)與多種惡性腫瘤有關(guān)，其可以作為抑癌基因參與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程中[3-5]，但其在宮頸癌組織中的表達(dá)情況目前研究報(bào)道較少。本研究主要探討宮頸癌組織中miR-485-5p的表達(dá)情況，從miRNAs的角度研究氧化苦參堿對(duì)宮頸癌細(xì)胞增殖的影響及其作用，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 材料 實(shí)驗(yàn)儀器：熒光定量PCR儀（Roche480，羅氏診斷有限公司，德國(guó)）；多功能酶標(biāo)儀（美國(guó)BIO-RAD公司）；CO2培養(yǎng)箱（英國(guó)RS Biotech公司）；光學(xué)顯微鏡（德國(guó)Leica公司）；恒溫水浴箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；超凈工作臺(tái)（天津凈化儀器廠）。實(shí)驗(yàn)試劑：氧化苦參堿（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)120609-202114）；DMEM培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco公司，批號(hào)21225155）；MTT（美國(guó)Solarbio公司，批號(hào)M8219）；雙熒光素酶檢測(cè)試劑盒（美國(guó)Promega公司，批號(hào)9FB325）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國(guó)Thermo公司，批號(hào)K1654）；Cyclin D1多克隆抗體（武漢博士德）。胎牛血清培養(yǎng)基（美國(guó)Sciencell公司，批號(hào)0507）。實(shí)驗(yàn)菌株：實(shí)驗(yàn)組為人宮頸鱗癌細(xì)胞株Siha（HPV 16+）（武漢博士德生物工程有限公司）；對(duì)照組為正常宮頸上皮組織細(xì)胞，收集于2021年1—5月寧波市醫(yī)療中心李惠利醫(yī)院子宮肌瘤摘除的新鮮子宮組織常規(guī)培養(yǎng)后所得。

1.2 方法

1.2.1 最適藥物濃度檢測(cè) 將Siha（HPV16+）細(xì)胞以5×103/ml接種到96孔板中，每孔加入100 l含有10%胎牛血清的培養(yǎng)基，24 h后觀察細(xì)胞狀態(tài)，同時(shí)加入不同濃度的氧化苦參堿（5、25、50、100、200 mol/L），同時(shí)設(shè)立空白對(duì)照。反應(yīng)24 h后，每孔加入50 l MTT液繼續(xù)反應(yīng)2 h，酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm處每孔的吸光度，每孔重復(fù)測(cè)3次。

1.2.2 miRNAs表達(dá)量的檢測(cè) 培養(yǎng)Siha（HPV16+）細(xì)胞系，提取各細(xì)胞的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄后應(yīng)用Real-Time PCR分別檢測(cè)各細(xì)胞內(nèi)mi R-126、mi R-485-5p及miR-30a的表達(dá)量，每孔重復(fù)測(cè)3次。

1.2.3 宮頸癌細(xì)胞株及宮頸上皮組織中Cyclin D1的表達(dá)檢測(cè) 培養(yǎng)Siha（HPV 16+）細(xì)胞，收集細(xì)胞后，提取總蛋白，等量上樣，SDS-PAGE電泳分離后轉(zhuǎn)膜，封閉后分別孵育一抗、二抗，ECL發(fā)光檢測(cè)，分析Cyclin D1的相對(duì)表達(dá)量，同時(shí)檢測(cè)蛋白的灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法 采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用 檢驗(yàn)。＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 最適藥物濃度檢測(cè)結(jié)果 通過(guò)MTT的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在100 mol/L濃度時(shí)，其吸光度值最小，此濃度下對(duì)細(xì)胞的抑制效果最佳，故將此濃度設(shè)為最佳濃度，供后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。見(jiàn)封四彩圖2。

2.2 兩組miRNAs表達(dá)情況比較 實(shí)驗(yàn)組miR-485-5p表達(dá)水平明顯下調(diào)，而兩組miR-126及miR-30a表達(dá)水平差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均＞0.05），見(jiàn)表1。

表1 兩組miRNAs表達(dá)情況比較

2.3 miR-485-5p的表達(dá)水平 與對(duì)照組相比，氧化苦參堿刺激細(xì)胞后，miR-485-5p的表達(dá)水平上調(diào)，miR-485-5p mimics轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，miR-485-5p明顯升高，且升高幅度大于氧化苦參堿刺激后的水平；用miR-485-5p inhibitor轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，miR-485-5p表達(dá)量下調(diào)。見(jiàn)封四彩圖3。

2.4 宮頸癌細(xì)胞株及宮頸上皮組織中Cyclin D1的表達(dá)結(jié)果 Western blot結(jié)果顯示氧化苦參堿或miR-485-5p mimics處理人宮頸鱗癌細(xì)胞株Siha（HPV 16+）細(xì)胞后，Cyclin D1蛋白的條帶變淡；mi R-485-5p inhibitor轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，Cyclin D1蛋白條帶加深。

3 討論

臨床研究發(fā)現(xiàn)宮頸癌病變可能與患者的HPV感染、多孕及多產(chǎn)等多種因素密切相關(guān)[6]，且研究發(fā)現(xiàn)宮頸癌組織中多存在多種基因的過(guò)表達(dá)情況[7]。相關(guān)研究在宮頸癌細(xì)胞株Siha上檢測(cè)miRNA221的表達(dá)，研究其與腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移行為間的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miRNA221在宮頸癌細(xì)胞株Siha中扮演促癌因子的作用。因此本研究先將不同濃度的氧化苦參堿作用于宮頸鱗癌細(xì)胞株Siha（HPV16+），應(yīng)用MTT檢測(cè)細(xì)胞的增殖情況，篩選最佳藥物濃度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在100 mol/L濃度時(shí)吸光度最低，說(shuō)明氧化苦參堿對(duì)Siha（HPV16+）細(xì)胞株增值具有明顯的抑制作用，而且在100 mol/L濃度時(shí)細(xì)胞被抑制的程度接近最大值，因此將100 mol/L設(shè)為最適濃度，作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的處理濃度。

有研究發(fā)現(xiàn)Cyclin D1蛋白對(duì)患者體內(nèi)的細(xì)胞周期具有一定的調(diào)節(jié)作用，其可以對(duì)腫瘤細(xì)胞的分化、增殖產(chǎn)生促進(jìn)作用，延緩患者腫瘤細(xì)胞凋亡進(jìn)程[8]，進(jìn)而對(duì)患者體內(nèi)癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移起到促進(jìn)作用，導(dǎo)致患者的病情快速發(fā)展。宮頸癌患者腫瘤組織內(nèi)多存在Pin1和Cyclin D1過(guò)表達(dá)現(xiàn)象，對(duì)腫瘤細(xì)胞的分化增殖具有重要作用[9]。有研究結(jié)果顯示苦參堿對(duì)腫瘤的抵抗效果較為明顯[10]，苦參堿由中藥苦參中提取的一種具有抗炎及抗病毒作用的生物堿。而大量研究顯示，苦參堿具有良好的抗腫瘤作用[11]；還有研究發(fā)現(xiàn)其除了上述作用外還具有抑制腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，并加速腫瘤細(xì)胞凋亡的作用[12]?？鄥A對(duì)腫瘤的臨床治療效果較為顯著，但關(guān)于其作用機(jī)制研究較少。因此本研究觀察了苦參堿對(duì)宮頸癌細(xì)胞株和宮頸上皮組織中Cyclin D1表達(dá)的影響，以期對(duì)宮頸癌的臨床治療起到幫助。

本研究結(jié)果顯示氧化苦參堿或miR-485-5p mimics處理人宮頸鱗癌細(xì)胞株Siha（HPV 16+）細(xì)胞后，Cyclin D1蛋白的條帶變淡；miR-485-5p inhibitor轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，Cyclin D1蛋白條帶加深。這說(shuō)明氧化苦參堿處理宮頸癌菌株后可以抑制Cyclin D1表達(dá)，進(jìn)而可以抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖。臨床研究發(fā)現(xiàn)miRNAs對(duì)基因的轉(zhuǎn)錄后表達(dá)調(diào)控具有極其重要的作用。目前隨著研究的進(jìn)一步深入，已經(jīng)在人體中發(fā)現(xiàn)了接近700多種miRNAs，miRNAs主要是參與人體內(nèi)的基因表達(dá)過(guò)程，但是關(guān)于其作用的機(jī)制目前尚不明確。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)在人體惡性腫瘤的發(fā)生及發(fā)展與miRNAs的異常調(diào)控具有一定的關(guān)聯(lián)性[13-14]，已經(jīng)在乳腺癌、前列腺癌及肝癌等多種腫瘤中發(fā)現(xiàn)了miRNAs的異常表達(dá)[15-16]。本研究結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組中miR-485-5p在Siha（HPV16+）細(xì)胞中呈明顯下調(diào)，而miR-126及miR-30a的表達(dá)無(wú)明顯差異。這說(shuō)明miR-485-5p的表達(dá)下降跟宮頸癌細(xì)胞的增值有關(guān)，使用氧化苦參堿處理后miR-485-5p的表達(dá)有所上升，說(shuō)明氧化苦參堿可以通過(guò)上調(diào)miR-485-5p表達(dá)進(jìn)而抑制宮頸癌細(xì)胞的增值。