解小鋒，楊緒強(qiáng)，亓玉昆，孟曉曄，韓鳳英，劉文璋，劉 慇，韓傳明，王清海

（1.山東省林業(yè)保護(hù)和發(fā)展服務(wù)中心，山東 濟(jì)南250014； 2.山東省濟(jì)南市長(zhǎng)清區(qū)文昌林業(yè)站，山東 濟(jì)南250300； 3.山東省林業(yè)科學(xué)研究院，山東 濟(jì)南250014； 4.山東農(nóng)業(yè)工程學(xué)院，山東 濟(jì)南250100）

棗（Zizyphus jujuba Mill.），鼠李科、棗屬，果肉甘甜味美，汁多果脆，富含豐富的維生素和礦物質(zhì)元素，被譽(yù)為“天然維生素丸”。棗為中國(guó)特有樹種，在我國(guó)具有悠久的栽培歷史。棗樹適應(yīng)性廣、抗逆性強(qiáng)，在我國(guó)新疆及黃河中下游流域均有分布。 近年來，隨著栽培模式的升級(jí)、品種的更新?lián)Q代，我國(guó)棗栽培面積及產(chǎn)量穩(wěn)步增長(zhǎng)，2019年我國(guó)棗產(chǎn)量達(dá)746.4 萬t。

由炭疽菌屬（Colletotrichum sp.）真菌引起的炭疽病是棗產(chǎn)區(qū)的一種重要植物病害，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[1]。僅2007年，棗炭疽病在山西省柳林、晉中地區(qū)造成了14 億元的損失[2]。 炭疽菌屬真菌全球性分布，危害寄主范圍廣，尤其危害鱷梨、芒果等高檔水果，造成的經(jīng)濟(jì)損失嚴(yán)重。 國(guó)內(nèi)已有的報(bào)道表明棗炭疽病的病原菌為膠孢炭疽菌（C.gloeosporioides）[1,3-8]，在棗炭疽病菌鑒定方面，大多數(shù)文獻(xiàn)依靠形態(tài)學(xué)特征，少量文獻(xiàn)通過形態(tài)學(xué)特征和ITS 序列分析相結(jié)合的方法。目前研究表明，膠孢炭疽菌是一個(gè)復(fù)合種[9]，是否有其他炭疽菌可以引起棗炭疽病，尚不清楚。

2019年8月，作者在山東省濟(jì)南市仲宮鎮(zhèn)小門牙村棗園調(diào)查時(shí)，發(fā)現(xiàn)棗葉（品種：仲秋紅）上出現(xiàn)圓形或不規(guī)則形褐色病斑，病葉率達(dá)30%以上，感病棗樹樹勢(shì)較弱。 因此完全有必要明確其病原種類，為該病的有效防控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

感病棗葉片，2019年8月，從山東省濟(jì)南市仲宮鎮(zhèn)小門牙村棗園采集。

1.2 方法

1.2.1 棗炭疽病菌株分離純化

樣品分離采用常規(guī)的組織分離方法。 采集的棗炭疽病病葉70%乙醇表面處理后，在葉片病健交界處，用無菌的解剖刀切成小組織塊（5 mm×5 mm）。 然后依次1%次氯酸鈉（1 min），70%乙醇溶液（1 min），無菌水沖洗3 次。將處理后的小組織塊置于PDA 平板上（5 塊/皿），28℃，散光條件下培養(yǎng)。5d 后，挑取單個(gè)菌落菌絲，置于新的PDA 平板上，散光條件下28℃培養(yǎng)7 d，在接種點(diǎn)附近產(chǎn)生橘紅色分生孢子團(tuán)，用移菌環(huán)刮取少量孢子置于無菌水中，配成孢子液，在PDA 平板上涂布、培養(yǎng)。2d 后挑取單個(gè)菌落，獲得純化菌株。獲得純化菌株均在山東省林業(yè)科學(xué)研究院森林保護(hù)研究所保存。

1.2.2 致病性測(cè)定

獲得單孢菌株致病性通過離體接種的方法進(jìn)行測(cè)定。 選取成熟、新鮮、健康的棗葉（品種：‘仲秋紅’），自來水沖洗30 秒，自然晾干，75%的酒精消毒處理，備用。 隨機(jī)選取JNZG11、JNZG311、JNZG313 菌株在PDA平板上培養(yǎng)7d，制成孢子懸浮液（×106孢子/mL），備用。 用無菌針（φ = 0.5 mm）輕微刺傷葉片，在傷口處接種200 μL 孢子懸浮液，以無菌水為對(duì)照。 將處理后的棗葉置于含有少量無菌水的無菌燒杯中，用保鮮膜封閉，28℃，培養(yǎng)7 d，觀察葉片的發(fā)病情況，并與田間癥狀進(jìn)行比較。

1.2.3 病原鑒定

1.2.3.1 形態(tài)學(xué)鑒定

選取JNZG11、JNZG311、JNZG313 菌株作為代表性菌株， 置于PDA 平板培養(yǎng)（28 ℃、12 h 光照/12 h 黑暗）培養(yǎng)5 d，觀察記錄菌株的培養(yǎng)特征。5d 后挑取菌落產(chǎn)生的子實(shí)體（黑色小粒點(diǎn)），制作玻片，通過尼康50i顯微鏡（Nikon Eclipse 50i，日本）、QImaging 照相系統(tǒng)（QImaging 加拿大）、cellSens 軟件，觀察分生孢子及附著胞形態(tài)并測(cè)量其大小。

1.2.3.2 分子鑒定

采用改進(jìn)的CTAB 法提取供試菌株的DNA[10]。 選取以下6 種保守基因進(jìn)行擴(kuò)增與測(cè)序，分別為：核糖體轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列（ITS）、幾丁質(zhì)合成酶A 基因（CHS-1）、肌動(dòng)蛋白基因（ACT）、β-微管蛋白基因（TUB2）、3 -磷酸甘油醛脫氫酶基因（GAPDH）和鈣調(diào)蛋白基因（CAL）為目的基因。 以ITS1/ITS4、CHSⅠ-79F/CHSⅠ-354R、ACT-512F/ ACT-783R、βt2a/βt2b、GDF-1/ GDR1、CL1/ CL2 分別為ITS、CHS-1、ACT、TUB2、GAPDH和CAL 基因的引物進(jìn)行擴(kuò)增測(cè)序。 擴(kuò)增反應(yīng)體系25 μL（Taq 酶mix 12.5 μL，上游引物下游引物各1 μL，ddH2O 8.5 μL，DNA 模板2 μL）。 PCR 參數(shù)：預(yù)變性（95°C，5 min）、變性（94°C，30 s）、退火（ITS:58°C，30 s；CHS-1、GAPDH: 56°C，30 s；ACT、TUB2、CAL: 59°C，30 s；）。 PCR 產(chǎn)物送往上海派森諾生物科技有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序。

將各個(gè)菌株 （JNZG11*、JNZG12*、JNZG14*、JNZG15*、JNZG311*、JNZG313*） 的ITS、ACT、CHS-1、GAPDH、CAL 和TUB2 基因序列提交到GenBank數(shù)據(jù)庫中 （基因編號(hào)：ITS: MT570098、MT570094、MT570096、MT570095、MT570093、MT570097；ACT: MT894282、MT894284、MT894293、MT894288、MT894289、MT894292；CHS -1: MT894270、MT894271、MT894272、MT894273、MT894274、MT894275；TUB2: MT894280、MT894276、MT894278、MT894277、MT894281、MT894279；GAPDH：MT894283、MT894287、MT894285、MT894286、MT894290、MT894291；CAL:MT894268、MT894264、MT894266、MT894265、MT894269、MT894267）。選取Colletotrichum gloeosporioides 復(fù)合種內(nèi)的43 株菌株作為參考菌株[11]，以C.boninense 模式菌株MAFF 305972 為外圍菌株。 通過MEGA 7.0 軟件中的最大似然法（Maximum Likelihood，ML）構(gòu)建多基因（ACT-CHS-1-GAPDHITS-CAL-TUB2）系統(tǒng)發(fā)育樹，以自展法（Bootstrap）進(jìn)行檢測(cè)（循環(huán)1000 次）。

2 結(jié)果與分析

2.1 棗炭疽病癥狀

2019年8月， 作者在山東省濟(jì)南市仲宮鎮(zhèn)小門牙村棗園調(diào)查時(shí)發(fā)現(xiàn)棗樹葉片受害嚴(yán)重， 病葉率達(dá)到30%以上。 危害棗樹葉片， 在葉片形成圓形或近圓形斑點(diǎn)，病斑中央褐色，凹陷，輪紋狀排列小黑點(diǎn)，四周黑褐色，病斑外圍有淡黃色暈圈。 葉脈對(duì)病斑擴(kuò)展限制作用隨著病斑擴(kuò)大， 幾個(gè)病斑擴(kuò)展成不規(guī)則形壞死斑，部分壞死斑脫落，中央形成穿孔（圖1），嚴(yán)重影響葉片光合作用，后期造成葉片早落。

圖1 棗炭疽病田間癥狀Figure 1 Disease symptom on leaves of jujube in field

2.2 離菌株致病性

棗葉片接種孢子液5 d 后， 在葉片接種部位均表現(xiàn)出癥狀，發(fā)病率為100%（圖2a），而接種無菌水的葉片未表現(xiàn)出癥狀（圖2b）。葉片病斑圓形或近圓形， 中央稍微凹陷，黑褐色。 病斑擴(kuò)大成近圓形或不規(guī)則形的壞死斑，壞死斑有黑色小粒點(diǎn)（子實(shí)體）產(chǎn)生，少量橘紅色粘質(zhì)（分生孢子）（圖2a）。接種后產(chǎn)生的癥狀與田間觀察的癥狀一致。 通過同樣的分離方法，從接種產(chǎn)生的壞死斑上可以分離到與接種菌株形態(tài)特征一致的菌株。 由此可見，本試驗(yàn)分離獲得的菌株可以引起棗炭疽病，是其病原菌。

圖2 致病性試驗(yàn)(a)果實(shí)接種后病斑；(b) 對(duì)照Figure 2 Pathogenicity test (a) necrotic lesions on leaves inoculated with isolate JNZG313; (b) control with sterile water

2.3 棗炭疽病菌形態(tài)學(xué)鑒定

在PDA 培養(yǎng)基上，菌絲初期白色，菌絲致密，菌落平整，邊緣整齊。 后期逐漸形成淡黃色，背面色素黑褐色（圖3a）。分生孢子單胞無色，內(nèi)含油滴、紡錘形至橢圓形（圖3b），大小為(11.1-) 12.7-13.3 (-17.8) ×(-4.4)5.2-5.5 (-6.3) μm (13.0 ±1.2 × 5.3 ± 0.5 μm, n = 50)，長(zhǎng)寬比為2.5。 附著胞卵圓形、不規(guī)則形，深褐色（圖3c），大小為(7.3-) 8.6-9.2 (-9.8) ×(-5.1) 5.8-6.9 (-7.0) μm (= 8.9±0.7×6.3±0.7 μm, n=50)，長(zhǎng)寬比為1.4。 通過觀察發(fā)現(xiàn)JNZG311 JNZG313 產(chǎn)孢較多，JNZG11 產(chǎn)孢較少。 其分生孢子附著孢大小、菌落形態(tài)與膠孢炭疽菌復(fù)合種(Colletotrichum gloeosporioides complex)形態(tài)學(xué)特征一致。

圖3 Colletotrichum siamense 形態(tài)特征（a）菌落形態(tài)；（b）分生孢子；（c）附著胞Figure 3 Colletotrichum siamense (a) cultural character； (b) conidia； (c) appressoria

2.4 棗炭疽病病菌多基因序列分析

將獲得的6 株菌株的6 個(gè)基因序列串聯(lián)后， 與暹羅炭疽菌模式菌株ICMP 18578 相似度為99.6%。 在采用最大似然法構(gòu)建的多基因（ACT、CHS-1、GAPDH、ITS、CAL、TUB2）系 統(tǒng)發(fā)育樹（圖4）中，以粗體表示的為模式菌株， 在分支節(jié)點(diǎn)處標(biāo)注自展率， 標(biāo)尺指示為0.02 步變化。 系統(tǒng)發(fā)育樹最高對(duì)數(shù)似然值為-8965.61。 本試驗(yàn)獲得的6 株菌株（JNZG11*、JNZG12*、JNZG14*、JNZG15*、JNZG311*、JNZG313*）聚在暹羅炭疽菌（Colletotrichum siamense）進(jìn)化分支上（自展率94%）。

圖4 利用最大似然法基于棗炭疽病菌ACT、CHS-1、GAPDH、ITS、CAL和TUB2 的基因數(shù)據(jù)構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹。 （自展率標(biāo)于節(jié)點(diǎn)處，所用模式菌株由粗體表示，以Colletotrichum boninense MAFF305972 為外圍菌株，標(biāo)尺指示0.02 步變化。 ）Figure 4 Phylogenetic tree of isolates of red-fleshed apple anthracnose with allied taxa calculated with sequence data of concatenated ACT,CHS-1, GAPDH, ITS, CAL, and TUB2 using maximum likelihood method (1,000 bootstrap replicates; bootstrap values indicated at nodes, the highest log likelihood =-8965.61).

結(jié)合分離菌株的形態(tài)特征、培養(yǎng)性狀、多基因系統(tǒng)發(fā)育分析以及致病性測(cè)定，明確了暹羅炭疽菌可以引起棗炭疽病。

3 結(jié)論與討論

炭疽菌屬植物真菌1790年首次發(fā)現(xiàn)，1831年建立炭疽菌屬，距今已有230 余年的歷史，其分類一直比較混亂。依靠形態(tài)特征、寄主范圍為主的分類系統(tǒng)，以及ITS 序列對(duì)復(fù)合種內(nèi)的近源種不能有效區(qū)分。 直到2009年Cai et al 提出了利用多基因系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)合形態(tài)學(xué)并輔助其它鑒別手段的綜合方法，逐漸被接受，成為目前比較權(quán)威規(guī)范的炭疽菌分類方法。 棗炭疽病是棗樹生產(chǎn)中常見的一類重要的植物真菌病害， 國(guó)內(nèi)已有的報(bào)道認(rèn)為其病原為膠孢炭疽菌（C.gloeosporioides），其分類依據(jù)主要依靠形態(tài)學(xué)特征或輔以ITS 序列分析。 本實(shí)驗(yàn)通過感病棗葉樣本組織分離、 單孢純化、致病性測(cè)定，表明分離獲得單孢菌株均可以引起棗炭疽病。 通過對(duì)分離菌株ITS、CAL、TUB2、GAPDH、ACT、CHS-1 等多基因系統(tǒng)發(fā)育分析， 結(jié)合形態(tài)特征、 培養(yǎng)形狀， 確定分離獲得菌株為暹羅炭疽菌（C.siamense）。 本次研究結(jié)果首次明確了暹羅炭疽菌可以危害棗（Z.jujuba），引起炭疽病，這與已有的棗炭疽病原種類報(bào)道不同。

近年來，國(guó)內(nèi)外學(xué)者在蘋果、核桃、芒果、草莓、辣椒[12]等寄主上發(fā)現(xiàn)多種炭疽菌侵染危害。隨著炭疽菌屬真菌研究的深入，越來越多的研究證明確實(shí)存在多種炭疽菌侵染同一寄主的現(xiàn)象。 臺(tái)灣青棗（Z.mauritiana）炭疽病病原已被證實(shí)存在果生炭疽菌 （C.fructicola） 和暹羅炭疽菌（C.siamense）等2 種病原菌[13]。 臺(tái)灣青棗又稱印度棗、毛葉棗，為鼠李科棗屬植物，與Z.jujube 均為棗屬，是否存在果生炭疽菌侵染危害Z.jujube，還有待進(jìn)一步研究。 本次實(shí)驗(yàn)受采樣地點(diǎn)和采樣數(shù)量的限制，僅分離獲得暹羅炭疽菌一個(gè)種，隨著今后采樣量的增加，是否會(huì)有其它炭疽菌或炭疽菌新種還有待進(jìn)一步研究。

暹羅炭疽菌是Prihastuti et al （2009年）在泰國(guó)咖啡上首次發(fā)現(xiàn)，引起咖啡炭疽病[14]。 暹羅炭疽菌分布范圍廣，已在非洲、美洲、大洋洲、亞洲均有發(fā)現(xiàn)[15-18]。 隨著對(duì)暹羅炭疽菌的關(guān)注，危害寄主的種類范圍越來越廣，本研究首次發(fā)現(xiàn)暹羅炭疽菌侵染棗引起炭疽病，棗是其新寄主。 因此，在棗炭疽病研究及制定防控方案時(shí)，暹羅炭疽菌同樣是不可忽視的。 目前，有關(guān)暹羅炭疽菌引起的棗炭疽病的發(fā)生流行、種群結(jié)構(gòu)以及有效的防治措施還有待進(jìn)一步研究。