王 森 森， 平 清 偉， 盛 雪 茹， 李 娜， 張 健

( 大連工業(yè)大學(xué) 輕工與化學(xué)工程學(xué)院, 遼寧 大連 116034 )

0 引 言

高效液相色譜法(HPLC)可用于試樣中混合物質(zhì)的分析[1-2]，常用于生物質(zhì)組分的分離和檢測[3]，比如單糖檢測、原料成分和聚糖的降解分析等[4-6]。市場上HPLC法檢測糖類的色譜柱多以進口為主，價格昂貴。國產(chǎn)氨基柱pH耐受范圍更廣，使用和再生條件相對簡單，可做正相也可做反相使用，價格也比較低廉[7]。C-18柱價格相對便宜，應(yīng)用廣泛[8]。進口C-18色譜柱經(jīng)常被用于脂肪酸的檢測[9]，國產(chǎn)C-18色譜柱檢測乙醇水溶液中的乙酸時會受到乙醇的嚴(yán)重干擾[10]。

生物質(zhì)乙醇法精煉具有溶劑可回收、綠色無污染、效益高等優(yōu)點，一直備受矚目[11-12]。我國盛產(chǎn)竹子，撐篙竹在我國廣東、河北、江西都有廣泛分布[13]。撐篙竹乙醇法精煉液中富含甲酸、乙酸和丙酸等小分子脂肪酸和各種降解糖，具有較高經(jīng)濟價值，但其中也含有乙醇，會對HPLC法測量小分子脂肪酸含量帶來干擾。本研究使用國產(chǎn)氨色譜柱和C-18色譜柱分別檢測撐篙竹乙醇法精煉水解液中降解單糖與小分子脂肪酸含量，以期為用HPLC法測試含乙醇的小分子脂肪酸樣品提供借鑒。

1 實 驗

1.1 主要原料與試劑

竹片(韶關(guān)市)，平衡水分密封；磷酸、乙腈、甲醇、乙醇，均為色譜純試劑。

1.2 撐篙竹乙醇法精煉

將竹片和50%(體積比)乙醇水溶液按液比1∶10(g/mL)放入高溫反應(yīng)釜中，在185 ℃保溫240 min后冷卻至40 ℃，放出漿料，用40 ℃左右50%乙醇水溶液洗滌干凈，收集精煉液。所得漿料風(fēng)干后密封。

1.3 水解單糖的制備

參照文獻[8]方法水解原料和漿料，用HPLC法測水解單糖量(mg/L)并按公式(1)計算糖降解率。

(1)

1.4 小分子脂肪酸的提取

精煉液成分十分復(fù)雜[14]，不能直接測量小分子脂肪酸含量。取50 mL精煉液，減壓旋蒸得到餾分，定容至50 mL。該餾分中含乙醇、水和甲酸、乙酸等小分子脂肪酸。

1.5 HPLC法測定單糖和小分子脂肪酸

1.5.1 流動相配制

參照文獻[15]方法和進口色譜柱測試經(jīng)驗，配制不同種類、不同體積比的流動相。

1.5.2 標(biāo)準(zhǔn)糖液、標(biāo)準(zhǔn)酸液配制

分別配制1、2、4、6和8 g/L葡萄糖、木糖、半乳糖和阿拉伯糖的標(biāo)準(zhǔn)單糖溶液各50 mL，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

分別配制5、10、20、40和80 mL/L甲酸、乙酸和丙酸標(biāo)準(zhǔn)溶液50 mL，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.5.3 單糖和小分子脂肪的測定

使用高效液相色譜儀(Waters公司)測定單糖和小分子脂肪酸。單糖用國產(chǎn)氨基柱(填料：Hypersil NH2-S 5 μm；柱長：250 mm；管徑：4.6 mm)測量，小分子脂肪酸用國產(chǎn)C-18柱(填料：Supersil ODS-B 5 μm；柱長：250 mm；管徑：4.6 mm)測量。與進口某品牌糖柱和C-18柱的測試結(jié)果對比，分別計算單糖和酸的相對偏差率。

單糖的相對偏差率=[(a-b)/a]×100%

(2)

酸的相對偏差率=[(c-d)/c]×100%

(3)

式中：a、b為國產(chǎn)氨基柱和進口糖柱的糖降解率，按式(1)計算；c、d分別為國產(chǎn)和進口C-18柱測得的酸濃度。

2 結(jié)果與討論

2.1 國產(chǎn)氨基柱糖分離條件的優(yōu)化

表1為國產(chǎn)氨基柱檢測標(biāo)準(zhǔn)單糖的條件和出峰時間。出峰時間差越大，分離效果越好。

2.1.1 流動相種類的影響

表1中編號A、B、C的流動相為甲醇-水和乙醇-水時標(biāo)準(zhǔn)糖出峰效果都不理想。流動相為乙腈-水可以使葡萄糖和木糖分開，但阿拉伯糖和半乳糖沒有分開。乙腈-水的效果相對較好，用乙腈-水為流動相。

2.1.2 流動相比例的影響

表1中編號D、E流動相乙腈和水體積比為80∶20時標(biāo)準(zhǔn)糖出峰不好，體積比為77∶23時，葡萄糖、木糖、阿拉伯糖可以分開，與75∶25(編號C)相比，雖然Δt1(t2-t1)、Δt2(t3-t2)更大一些，但此時木糖與阿拉伯糖峰有拖尾現(xiàn)象，因此流動相體積比固定為75∶25。

2.1.3 測試溫度的影響

表1中編號F、C、G、H的測試溫度分別為20、25、30和35 ℃?？梢钥闯觯瑴囟葘Τ龇鍟r間影響較大，溫度越高出峰時間越早，且溫度高分離效果會變好一些。35與30 ℃相比，雖然出峰略好，但溫度越高柱壓越高，不利于色譜柱的使用與再生，因此選擇30 ℃測試溫度進行研究。

2.1.4 體積流量的影響

表1中編號I、J、H、K的體積流量由0.8 mL/min 升至1.2 mL/min。體積流量越大，出峰越早，但阿拉伯糖與半乳糖峰都有重疊，考慮到體積流量越低測試時間越長，測試效率越低，因此固定體積流量為1.0 mL/min。

表1 國產(chǎn)氨基柱單糖檢測條件Tab.1 Detection conditions of monosaccharides by domestic amino column

2.1.5 進樣體積的影響

表1中編號G、L1、L2研究了進樣體積對糖分離效果的影響(流動相為乙腈-水，體積比75∶25，體積流量1.0 mL/min，時間15 min，溫度30 ℃)。從表1中可以看出，進樣體積從20 μL 減少至10和1 μL后，4種糖分離效果變好，進樣體積10和1 μL出峰時間相同。從圖1中也可以看出，進樣10 μL的基線不如進樣1 μL平穩(wěn)，進樣1 μL效果最佳。

G，進樣20 μL；L2，進樣1 μL圖1 進樣體積對單糖的分離效果Fig.1 The effect of injection volume on the separationof monosaccharides

國產(chǎn)氨基柱HPLC法測量單糖的較優(yōu)條件為：乙腈-水為流動相，體積比75∶25，進樣體積1 μL，體積流量1.01 mL/min，時間15 min，溫度30 ℃。用加標(biāo)法得到定量計算單糖的線性回歸方程。由表2可知，葡萄糖、木糖、阿拉伯糖和半乳糖對應(yīng)的線性方程都有較好相關(guān)系數(shù)，R2≥0.998。

表2 4種標(biāo)準(zhǔn)單糖定量計算的線性回歸方程Tab.2 Linear regression equation for quantitative calculationof four standard monosaccharides

2.2 國產(chǎn)C-18柱測定小分子脂肪酸

國產(chǎn)C-18柱檢測小分子脂肪酸的條件見表3。表3中，編號M～Q檢測條件參照進口C-18柱色譜柱測定小分子脂肪酸常用條件制定[9]。

國產(chǎn)C-18柱在編號M～Q條件下，甲酸出峰效果都很差，基線不穩(wěn)且有拖尾現(xiàn)象。降低流動相中乙腈的比例至70%(編號R)，出峰效果未見好轉(zhuǎn)(圖2)。

表3中編號S～W為國內(nèi)釀酒行業(yè)檢測乙醇中甲酸、乙酸含量所用條件[10]。編號S、U的甲酸出峰效果雖然有所好轉(zhuǎn)，但基線仍然不穩(wěn)定，且有拖尾現(xiàn)象(圖3)。

繼續(xù)降低乙腈比例，減至60%(編號X)時，甲酸出峰效果明顯變好(圖4)。

表3 國產(chǎn)C-18柱小分子脂肪酸檢測條件Tab.3 Detection conditions and preliminary results ofsmall fatty acidby domestic C-18 column

圖2 編號R的甲酸出峰效果Fig.2 The peak of No.R formic acid

圖3 編號S、U的甲酸出峰效果Fig.3 The peaks of No.S and No.U formic acids

將配制的甲酸、乙酸、丙酸和乙醇混合溶液繼續(xù)降低流動相乙腈的比例至50%，進樣量也減小到1 μL(編號Z)，甲酸、乙酸和丙酸的分離效果好且無乙醇干擾峰(圖5)。

圖4 編號X的甲酸出峰效果Fig.4 The peak of No.X formic acid

圖5 編號Z 3種酸的分離效果Fig.5 The peaks of three types of No.Z acids

國產(chǎn)C-18柱LPLC法測量含乙醇的小分子脂肪酸混合液較優(yōu)測量條件：流動相乙腈與水體積比50∶50，進樣體積1 μL，時間15 min，體積流量0.6 mL/min，溫度25 ℃。用加標(biāo)法得到脂肪酸定量計算線性回歸方程見表4。

表4 甲酸、乙酸和丙酸的定量計算Tab.4 Quantitative calculations of formic， aceticand propionic acids

2.3 與進口色譜柱實際測試對比分析

2.3.1 精煉液中糖降解情況

國產(chǎn)氨基柱按優(yōu)化好的條件測量原料、漿料水解液中的單糖，進口糖柱按表2中編號A條件測量。糖的降解率和相對偏差如表5所示。兩種色譜柱都只檢測到了葡萄糖和木糖。國產(chǎn)色譜柱與進口色譜柱相比，兩者木糖的相對偏差率較小，葡萄糖的相對偏差率略大，但偏差率絕對值都在5%以內(nèi)。國產(chǎn)氨基柱用于HLPC法檢測生物質(zhì)水解液中混合單糖含量比較可靠。

表5 降解糖的檢測結(jié)果Tab.5 The detecting results of degraded sugars

2.3.2 精煉液中小分子脂肪酸含量

按優(yōu)化好的小分子脂肪酸檢測方案，用國產(chǎn)C-18柱檢測撐篙竹乙醇法精煉液中小分子脂肪酸含量。與用進口C-18柱(表4中編號M方案)的檢測結(jié)果對比，兩種色譜柱都檢測到了乙酸、甲酸和丙酸，酸的相對偏差如表6所示。國產(chǎn)C-18柱與進口C-18柱相比，兩者乙酸和甲酸的相對偏差率較小，絕對值都在5%以內(nèi)。丙酸的相對偏差率較大，絕對值在5%以上，原因是樣品中丙酸濃度很低，極小的絕對誤差就可能造成相對偏差率增大。初步研究結(jié)果表明，國產(chǎn)C-18柱可用于HLPC法檢測生物質(zhì)水解液中甲酸、乙酸和丙酸等小分子脂肪酸的含量。

表6 甲酸、乙酸和丙酸的檢測結(jié)果Tab.6 The detecting results of formic， acetic andpropionic acids

3 結(jié) 論

國產(chǎn)氨基色譜柱、國產(chǎn)C-18色譜柱可用于檢測撐篙竹乙醇法蒸煮過程中糖的降解情況、小分子脂肪酸的生成情況，與進口色譜柱相比，檢測結(jié)果可靠，相對偏差率較小。

國產(chǎn)氨基色譜柱，以乙腈-水為流動相，在體積比75∶25、進樣體積1 μL、體積流量1.01 mL/min、時間15 min和檢測溫度30 ℃的條件下，可以實現(xiàn)對生物質(zhì)水解液中葡萄糖、木糖、阿拉伯糖和半乳糖的定性、定量檢測。

國產(chǎn)C-18色譜柱，以乙腈-水為流動相，在體積比50∶50、進樣體積1 μL、體積流量0.6 mL/min、時間15 min和檢測溫度25 ℃的條件下，可以在含乙醇生物質(zhì)水解液中實現(xiàn)對甲酸、乙酸和丙酸等小分子脂肪酸的定性、定量檢測。