張 晴 晴， 張 艷 榮， 孫 珍

( 大連工業(yè)大學 生物工程學院, 遼寧 大連 116034 )

0 引 言

茶葉具有抗炎、降血脂、抗氧化、調(diào)節(jié)免疫、延緩衰老等功能[1-2]。茶葉的化學成分非常復雜，包含2 000多種成分[3]。其中，蛋白質(zhì)、氨基酸是茶葉中的重要成分。氨基酸是人體必需的有效化學成分，也是茶葉香氣的前體物質(zhì)，能影響茶湯的鮮爽度。茶葉中的某些氨基酸，如茶氨酸，是茶葉中特有的一種游離氨基酸，具有非常強大的生理保健功能，包括緩解人的疲勞感、降低血壓、提高人的記憶能力等[4]。蛋白質(zhì)約占茶葉干重的20%～30%[5]，蛋白質(zhì)在茶鮮葉中含量越高，代謝越旺盛，代謝過程中的中間產(chǎn)物和產(chǎn)物含量也越高，能給茶葉帶來良好的滋味和香氣。

茶樹品種的適制性，是指某一特定茶種適合加工成某種茶類的特性和程度，是形成茶葉優(yōu)良品質(zhì)的前提[6-7]。不同茶樹中成分組成不同，決定了制成不同類別成品茶品質(zhì)的差異[8]。初級代謝產(chǎn)物中的蛋白質(zhì)、糖類、脂肪以及次級代謝產(chǎn)物中的多酚類、色素、茶氨酸、生物堿、芳香物質(zhì)等，都對茶葉的品質(zhì)特性或多或少起著不可替代的作用[9-10]。蛋白質(zhì)參與了這些次級代謝產(chǎn)物的生成過程，推測蛋白質(zhì)與茶葉品種的適制性存在一定的關聯(lián)。

本實驗采用TCA丙酮法提取了19種茶葉中的蛋白質(zhì)進行組學分析，對所得的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)進行GO注釋對19種茶葉得到的蛋白信息進行KEGG代謝通路分析，并對部分代謝通路進行了OPLS-DA分析。以期將研究結(jié)果用于茶葉新品種的適制性的輔助判斷。

1 材料與方法

1.1 主要材料和儀器

茶葉：悅茗香、黃觀音、毛蟹、鐵觀音、茂綠、安吉白茶、中茶102、鄂茶1號、鳧早2號、龍井43、中茶108、錫茶5號、福安大白、福鼎大白、福鼎大毫、政和大白、皖農(nóng)95、尖波黃13號、櫧葉齊12號，中國農(nóng)科院茶葉研究所資源圃。

尿素、鹽酸胍、三羥甲基氨基甲烷(Tris)，生工生物工程有限公司；硫脲，通用技術集團醫(yī)療健康有限公司；二硫蘇糖醇(DTT)、碘乙酰胺(IAA)、兩性表面活性劑(CHAPS)、β-巰基乙醇、胰蛋白酶(來源于牛胰腺，不小于10 000 U/mg)、糜蛋白酶(來源于牛胰腺，不小于40 U/mg)，美國西格瑪奧德里奇公司；丙酮、三氯乙酸(TCA)，分析純，天津市科密歐化學試劑有限公司。

Q ExactiveTM組合型四級桿Orbitrap質(zhì)譜儀，美國賽默飛世爾科技公司；Ultimate 3000 RSLC nano System，美國戴安公司；酶標儀，美谷分子儀器有限公司；化學發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)，通用技術集團醫(yī)療健康有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 茶葉蛋白的提取

取1 g茶葉于研缽中，加液氮研磨成粉狀，轉(zhuǎn)到預冷的6 mL提取液Ⅰ(TCA 5 g，β-巰基乙醇35 μL，丙酮定容至50 mL)中，-20 ℃過夜處理。4 ℃、10 000 r/min離心20 min棄上清，加入6 mL 預冷的提取液Ⅱ(β-巰基乙醇35 μL，丙酮定容至50 mL)后混勻，將溶液于-20 ℃冰箱中靜置2 h，4 ℃、10 000 r/min離心20 min棄上清后加預冷的丙酮重復洗2～3次，將蛋白沉淀風干。

1.2.2 蛋白濃度的測定

配制蛋白工作液。儲液：100 mL 95%乙醇，350 mg考馬斯亮藍G-250，200 mL 85% H3PO4；工作液：425 mL ddH2O，15 mL 95%乙醇，30 mL 85% H3PO4，30 mL儲液。

所有樣品均采用Bradford法測蛋白濃度，以牛血清蛋白(BSA)作為標準蛋白，配制不同質(zhì)量濃度BSA：0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0 mg/mL，以質(zhì)量濃度為橫坐標，595 nm 處測得的吸光度為縱坐標，作標準曲線。

1.2.3 質(zhì)譜樣品的制備

取蛋白樣品20 mg，按質(zhì)量體積比1∶30加入緩沖液(6 mol/L鹽酸胍，50 mmol/L Tris)，反應10 min，14 000 r/min離心20 min，取上清測蛋白濃度。取1 mg蛋白液于超濾管中，加入100 mmol/L DTT (終濃度20 mmol/L)，于37 ℃ 恒溫箱反應2 h，14 000 r/min離心20 min，加入100 mmol/L IAA (終濃度20 mmol/L)避光反應40 min，離心后加入胰蛋白酶和糜蛋白酶的混合酶液溫育12 h。

1.2.4 實驗條件1.2.4.1 色譜條件

預柱，C18 PepMap100(5 μm，10-8m)；分析柱，Acclaim PepMapTMRSLC(75 μm×15 cm，3 μm)；流動相A，0.1%甲酸溶液；流動相B，80%乙腈和0.1%甲酸溶液；預柱溫度，45 ℃；進樣量，2 μL；體積流量，0.2 μL/min。

流動相線性洗脫程序：0～10 min，4% B；10～13 min，4%～10% B；13～35 min ，10%～35% B；35～41 min，35%～55% B；41～42 min，55%～95% B；42～ 52 min，95% B；52～53 min，95%～4% B；53～70 min，4% B。

1.2.4.2 質(zhì)譜條件

離子源模式，納升級電噴霧(Nano ESI)；噴霧電壓，2.5 kV；質(zhì)譜掃描方式：正離子模式，F(xiàn)ull MS/dd-MS2模式；一級質(zhì)譜掃描范圍，350～1 800m/z；Orbitrap檢測完整肽段的分辨率為70 000，檢測離子碎片的分辨率17 500。使用Proteome Discoverer 2.2.0.388處理得到MS/MS數(shù)據(jù)，肽段的假陽性鑒定率設為小于1%。根據(jù)實際使用的酶設定切割位點，允許2個漏切位點。前體離子的質(zhì)量誤差設定為10-5，碎片離子的質(zhì)量誤差設定為0.02 u。動態(tài)修飾設為甲硫氨酸上+15.995 u的氧化修飾，靜態(tài)修飾設為半胱氨酸上+57.021 u的酰胺甲基化修飾。使用Proteome Discoverer 2.2.038軟件進行數(shù)據(jù)比對，已測物種包含的蛋白數(shù)據(jù)庫在Uniprot官網(wǎng)(http：//www.uniprot.org/)下載。

2 結(jié)果與討論

2.1 蛋白質(zhì)鑒定結(jié)果

本實驗共檢測了19種茶葉樣品中的蛋白數(shù)量，如表1所示。每個樣品檢測3次，將所得的3次RAW文件合在一起對比Viridiplantae庫得到相應的蛋白總數(shù)。

表1 各茶葉中的蛋白總數(shù)Tab.1 Total proteins in each kind of tea

2.2 四大類茶的GO注釋

圖1為福安大白、福鼎大白、福鼎大毫、政和大白(均適制白茶)4個品種所檢測到的蛋白個數(shù)，福安大白、福鼎大白、福鼎大毫、政和大白分別檢測到8 371、8 335、8 126、8 217種蛋白質(zhì)，因后續(xù)比較的是四大類茶之間的差別，故選擇了一大類茶里至少有兩種茶葉里共有的蛋白數(shù)據(jù)進行GO注釋分析(以白茶為例6 326)。同理得到烏龍茶(悅茗香、黃觀音、毛蟹、鐵觀音)、紅茶(皖農(nóng)95、櫧葉齊12、尖波黃13)、綠茶(鄂茶1號、鳧早2號、龍井43、中茶108)的蛋白個數(shù)為5 947、3 919、5 578。

圖1 4種白茶品種的蛋白韋恩圖Fig.1 Protein Venndiagrams of four kinds of whitetea varieties

白茶中6 326個蛋白有2 492個蛋白被注釋到生物過程條目；2 639個蛋白被注釋到細胞組分條目；2 115個蛋白被注釋到分子功能條目。烏龍茶中5 947個蛋白有2 373個蛋白被注釋到生物過程條目；2 509個蛋白被注釋到細胞組分條目；2 036個蛋白被注釋到分子功能條目。紅茶中3 919個蛋白有1 601個蛋白被注釋到生物過程條目；1 699個蛋白被注釋到細胞組分條目；1 897個蛋白被注釋到分子功能條目。綠茶中5 578 個蛋白有2 152個蛋白被注釋到生物過程條目；2 311個蛋白被注釋到細胞組分條目；1 842個蛋白被注釋到分子功能條目。

四類茶中蛋白的GO功能注釋如圖2所示。生物過程中的前15個條目(圖2(a))中，四類茶蛋白涉及的生物過程之間差異不大，核酸代謝過程占比較大，其他過程依次遞減。細胞組分的前15個條目(圖2(b))中，四類茶蛋白涉及的細胞組分差異并不大，其中核和質(zhì)體的占比較大，其他組分略低。分子功能的前10個條目(圖2(c))中，四類茶中紅茶蛋白涉及的分子功能略低于其他三類。

2.3 KEGG通路分析

對19種茶葉進行KEGG代謝通路分析，對部分代謝通路進行OPLS-DA分析，如圖3(a)所示。19種茶葉被劃分成四大類，這些通路中起主要貢獻值的前十條通路包括00941類黃酮生物合成，00620丙酮酸代謝，04626植物與病原體的相互作用，00260甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝，00410 β-丙氨酸代謝，00270半胱氨酸和蛋氨酸代謝，00071脂肪酸降解，00280纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的降解，00195光合作用，00900萜類骨架的生物合成。對10條通路中檢測到的蛋白進行統(tǒng)計，通過無標記定量方法得到每種蛋白在19種茶葉里的含量，對蛋白含量進行OPLS-DA分析，結(jié)果如圖3(b)所示。根據(jù)通路里涉及的蛋白含量，可將19種茶葉區(qū)分開，這些蛋白中起主要貢獻作用的前15個蛋白如表2所示。

1，核酸代謝過程；2，細胞蛋白質(zhì)代謝過程；3，細胞大分子生物合成過程；4，含核堿基的化合物的生物合成過程；5，基因表達調(diào)控；6，細胞生物合成過程的調(diào)控；7，蛋白質(zhì)修飾過程；8，高分子生物合成過程的調(diào)控；9，含核堿基的化合物代謝過程的調(diào)控；10，對其他生物的防御反應；11，羧酸代謝過程；12，磷酸化；13，對鎘離子的反應；14，對脫落酸的反應；15，大分子代謝過程的負調(diào)控(a) 生物過程

1，核；2，質(zhì)體；3，核腔；4，液泡；5，胞間連絲；6，線粒體；7，葉綠體包膜；8，液泡膜；9，核仁；10，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)；11，核糖體；12，質(zhì)體類囊體膜；13，高爾基體；14，染色體；15，細胞骨架

1，焦磷酸酶活性；2，蛋白激酶活性；3，mRNA結(jié)合；4，過渡金屬離子結(jié)合；5，核酸內(nèi)切酶活性；6，序列特異性DNA結(jié)合；7，核糖核苷酸結(jié)合；8，無機陽離子跨膜轉(zhuǎn)運蛋白活性、嘌呤核苷酸結(jié)合、ATP酶偶聯(lián)的跨膜轉(zhuǎn)運蛋白活性

(a) 茶葉分類

(b) 茶葉蛋白

3 結(jié) 論

提取了19種不同茶葉樣品中的蛋白進行組學分析，研究表明，19種茶葉中有4種(福安大白、福鼎大白、福鼎大毫、政和大白)適制白茶，4種(悅茗香、黃觀音、毛蟹、鐵觀音)適制烏龍茶，3種(皖農(nóng)95、櫧葉齊12、尖波黃13)適制紅茶，4種(鄂茶1號、鳧早2號、龍井43、中茶108)適制綠茶。提取蛋白經(jīng)質(zhì)譜檢測表明，19種茶葉中蛋白總數(shù)相差不大。白茶、烏龍茶、紅茶、綠茶這4類得到的數(shù)據(jù)進行GO注釋結(jié)果表明，生物過程中主要包括核酸代謝過程、細胞蛋白質(zhì)代謝過程、細胞大分子生物合成過程、含核堿基的化合物的生物合成過程、基因表達調(diào)控等；細胞組分中主要包括核、質(zhì)體、核腔、液泡、胞間連絲等；分子功能主要包括焦磷酸酶活性、蛋白激酶活性、mRNA結(jié)合、過渡金屬離子活性和核酸內(nèi)切酶活性等。對19種茶葉得到的蛋白信息進行KEGG代謝通路分析，對感興趣的部分代謝通路進行了OPLS-DA分析，將19種茶葉劃分為四大類，與之前的研究相符，其中起主要貢獻作用的通路有類黃酮生物合成、丙酮酸代謝、植物與病原體相互作用、甘氨酸，絲氨酸和蘇氨酸代謝、β-丙氨酸代謝、半胱氨酸和蛋氨酸代謝、脂肪酸降解、纈氨酸，亮氨酸和異亮氨酸的降解、光合作用和萜類骨架的生物合成。

表2 19種茶葉中貢獻值較大的前15個蛋白Tab.2 The top 15 proteins with larger contributions in 19 kinds of teas