戰(zhàn) 鴻 彬， 李 文 志， 王 禹 茜， 王 一

( 大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院, 遼寧 大連 116034 )

0 引 言

咖啡因(1，3，7-三甲基黃嘌呤)及其相關(guān)的甲基黃嘌呤廣泛存在于多種植物中。咖啡、茶和巧克力等都含有咖啡因成分。在藥品中，咖啡因通常被用作心臟、神經(jīng)和呼吸興奮劑[1]。相關(guān)的甲基黃嘌呤的其他醫(yī)藥應(yīng)用包括利尿劑和支氣管擴(kuò)張劑，以及用于緩解支氣管痙攣和控制哮喘[2]。由于它們在食品和制藥工業(yè)中的廣泛應(yīng)用，很容易通過加工設(shè)施的液體廢水和固體廢物、咖啡和茶田植物物質(zhì)的分解以及生活垃圾進(jìn)入環(huán)境。研究表明，土壤中的甲基黃嘌呤能夠通過種子萌發(fā)，且咖啡因被認(rèn)為是飲用水廢水污染的人為標(biāo)記物[3]。

咖啡因在生活中幾乎無所不在，因此可以從各種自然環(huán)境中分離出能夠降解咖啡因的微生物[4-6]。微生物通常使用氧化和N-脫甲基化途徑來分解咖啡因[7]。Summer等[8-9]首次提出了從惡臭假單胞菌CBB5中純化的N-脫甲基酶的詳細(xì)特征。N-脫甲基酶由具有細(xì)胞色素C還原酶活性的還原酶組分(Ccr)和兩個(gè)亞基的N-脫甲基酶組分(Ndm)組成，其中Ndm是由NdmA和NdmB兩個(gè)亞基組成的可溶性加氧酶，可以通過去甲基化生產(chǎn)黃嘌呤，但是NdmA和NdmB都不能將7-甲基黃嘌呤的N-脫甲基化為黃嘌呤。Summer等[10]于2013年證明了N7去甲基化反應(yīng)需要一個(gè)由NdmC、NdmD和NdmE組成的獨(dú)特的、緊密結(jié)合的蛋白復(fù)合物。緊密的NdmCDE絡(luò)合物作為高度特異的7-甲基黃嘌呤N7-脫甲基酶，一個(gè)O2分子消耗的每一個(gè)N7-甲基以甲醛的形式被去除。

大量研究結(jié)果表明，惡臭假單胞菌CBB5可以利用咖啡因作為唯一碳源和氮源，通過5種酶(NdmA、NdmB、NdmC、NdmD和NdmE)依次催化N-脫甲基化來降解咖啡因。但細(xì)菌N-脫甲基酶的結(jié)構(gòu)和生化性質(zhì)在很大程度上仍不清楚。2019年，Kim等[11]成功得到了NdmA(6ICK)和NdmB(6ICL)及其相關(guān)復(fù)合物的結(jié)構(gòu)。通過酶分析、熒光標(biāo)記和小角X射線散射得到了證實(shí)：這些酶形成了一個(gè)摩爾比為3∶3的獨(dú)特雜化絡(luò)合物，以有效地連續(xù)降解咖啡因。這些發(fā)現(xiàn)雖然拓寬了對細(xì)菌降解咖啡因的了解，但是具體的反應(yīng)機(jī)理仍未得到合理的解釋。

本研究通過理論計(jì)算方法得到N-脫甲基酶與咖啡因的準(zhǔn)確作用位點(diǎn)和優(yōu)勢結(jié)合方式，以期為研究N-脫甲基酶催化氧化咖啡因機(jī)理提供的理論基礎(chǔ)。

1 計(jì)算方法

使用AutoDock[12]和AutoDock Vina[13]軟件，通過分子對接方法進(jìn)行研究。分子對接是通過蛋白質(zhì)受體的特征和受體與藥物進(jìn)行相互作用來研究藥物設(shè)計(jì)的方法，是一種簡單快捷的理論模擬方法，其中大部分用來檢查分子之間的協(xié)同作用，然后來提前判斷結(jié)合方法和關(guān)聯(lián)。最近幾年，分子對接逐漸成為新藥研發(fā)的首要技術(shù)[14]。

1.1 軟件及構(gòu)型獲取

由官網(wǎng)下載AutoDock 4.0和AutoDock Tools1.5.6(http：//autodock.scripps.edu/downloads)。由官網(wǎng)(http：//vina.scripps.edu/)下載AutoDock Vina。從官網(wǎng)(https：//pymol.org/2/)下載PyMOL軟件。從PDB蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(https：//www.rcsb.org/)下載N-脫甲基酶相關(guān)蛋白質(zhì)：6ICN、6ICK、6ICO、6ICQ。從ZINC官網(wǎng)(http：//zinc.docking.org/)下載咖啡因、茶堿及可可堿化合物用于分子對接的結(jié)構(gòu)式。

1.2 受體預(yù)處理

以6ICK蛋白質(zhì)為例。首先使用PyMOL打開蛋白質(zhì)，檢查蛋白質(zhì)三維立體結(jié)構(gòu)，如圖1(a)所示。該蛋白質(zhì)分子由A、B、C三條多肽鏈鏈組成，且周圍存在大量水分子。每條多肽鏈的α-亞基按功能可以分為兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，分別為N端Rieske型[2Fe-2S]簇域，用于接受來自其他電子轉(zhuǎn)移組分的電子；C端為配體結(jié)合域，用于底物的氧化。為了計(jì)算方便，在不影響計(jì)算結(jié)果的前提下，去除水分子和相關(guān)配基。完成上述工作后對蛋白質(zhì)分子進(jìn)行檢查，未出現(xiàn)丟失原子、化學(xué)鍵斷裂等情況。蛋白質(zhì)預(yù)處理完成后，使用AutoDock Tools，將.pdb格式的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)換為.pdbqt格式，即完成受體的預(yù)處理工作，如圖1(b)所示。

(a) PyMOL處理

(b) AutoDock Tools處理

1.3 配體預(yù)處理

登錄ZINC數(shù)據(jù)庫，查找咖啡因(CFF)、茶堿(TEP)、可可堿(37T)小分子配體，并下載保存.mol2 格式。以小分子配體咖啡因(CFF)為例，用AutoDock Tools軟件打開小分子配體，設(shè)置可旋轉(zhuǎn)鍵的數(shù)量，由于咖啡因是具有雙環(huán)結(jié)構(gòu)的平面剛性化合物，可旋轉(zhuǎn)鍵數(shù)目為0，接著輸出配體的.pdbqt文件即完成小分子配體預(yù)處理工作。

2 結(jié)果與討論

2.1 N-脫甲基酶活性中心驗(yàn)證

酶的催化作用是經(jīng)過其與底物構(gòu)成復(fù)合物(即中間產(chǎn)物)從而降低反應(yīng)能來實(shí)現(xiàn)的。通常情況下，底物并不能與酶分子表面任意部位相結(jié)合，底物只能和酶的活性中心結(jié)合進(jìn)而起到催化作用。Kim等[11]的研究結(jié)果表明，這兩種酶都可以分為兩個(gè)結(jié)構(gòu)域：N端Rieske型[2Fe-2S]簇域和C端配體結(jié)合域。但不同的是，NdmA(6ICN、6ICO)的C端配體結(jié)合域?yàn)榉茄t素鈷中心，而NdmAQL(6ICQ)的C端配體結(jié)合域?yàn)榉茄t素鐵中心。結(jié)合實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果和C端配體結(jié)合域功能，可以確定，蛋白質(zhì)6ICN、6ICO、6ICQ的活性中心為C端具有非血紅素配體附近區(qū)域。且由于NdmA和NdmAQL由三條多肽鏈組成，故將分成A、B、C三條鏈進(jìn)行研究。具體活性中心坐標(biāo)如表1所示。

根據(jù)活性中心位點(diǎn)坐標(biāo)設(shè)置對接中心，使用AutoDock Tools進(jìn)行構(gòu)象搜索，對接的痕跡如圖2所示。

表1 NdmA、NdmAQL活性中心坐標(biāo)Tab.1 The active center coordinates of NdmAand NdmAQL

(a) NdmA(A)-CFF(b) NdmA(B)-CFF(c) NdmA(C)-CFF(d) NdmA(A)-TEP(e) NdmA(B)-TEP

(f) NdmA(C)-TEP(g) NdmAQL(A)-37T(h) NdmAQL(B)-37T(i) NdmAQL(C)-37T

為了使結(jié)果更加清晰直觀，將構(gòu)象結(jié)果聚類分析，結(jié)果如表2所示。根據(jù)小分子配體圖像聚集情況及聚類分析結(jié)果，可以發(fā)現(xiàn)：在NdmA和咖啡因?qū)咏Y(jié)果中，A、B、C三條鏈聚類數(shù)最高組同時(shí)也是結(jié)合自由能最低組，且分布較集中，可以認(rèn)為活性中心位置判斷正確。在NdmA和茶堿的對接結(jié)果中，A、B、C三條鏈中的聚類結(jié)果較為分散，雖然聚類數(shù)最高的組不是結(jié)合自由能最低的組，但是結(jié)合自由能相差較小，綜合來看，聚類數(shù)最高的構(gòu)象附近即為活性中心附近。在NdmAQL和可可堿對接結(jié)果中，A、B、C三條鏈聚類數(shù)最高的組同時(shí)也是結(jié)合自由能最低的，且分布較為集中，故可認(rèn)為活性中心位置判斷正確。

2.2 NdmA與咖啡因(CFF)對接結(jié)果

結(jié)合自由能可以從總能量的角度反應(yīng)對接成鍵結(jié)合能力的強(qiáng)弱，結(jié)合自由能數(shù)值通常為負(fù)，絕對值越大，鍵結(jié)合能力就越強(qiáng)，同樣破壞這個(gè)結(jié)合情況所需要的能量也就越高[15-17]。當(dāng)結(jié)合自由能為正時(shí)，表明此時(shí)無法自發(fā)形成化學(xué)鍵，即小分子配體與蛋白質(zhì)無法結(jié)合。結(jié)合自由能并不是唯一評(píng)價(jià)小分子化合物與大分子蛋白質(zhì)對接結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)。對于已經(jīng)給出小分子在蛋白質(zhì)中位置的復(fù)合物，RMSD值也是一項(xiàng)較為重要的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。以復(fù)合物中原配體所在位置為參考值，若RMSD值小于2×10-10m，則配體對接結(jié)果較為準(zhǔn)確，若RMSD值大于2×10-10m，則對接結(jié)果準(zhǔn)確性較低。因此在對接過程中，結(jié)合自由能及RMSD值將成為判斷最優(yōu)構(gòu)象的主要標(biāo)準(zhǔn)。

表2 N-脫甲基酶與配體對接結(jié)果聚類分析Tab.2 Cluster analysis of docking results betweenN-demethylase and ligands

通過Vina軟件得到的NdmA蛋白質(zhì)與咖啡因?qū)哟蚍纸Y(jié)果如表3所示。從表3可以看出，在A、B、C鏈中，構(gòu)象一的結(jié)合自由能打分最低，且RMSD值最小，故推測構(gòu)象一為最優(yōu)構(gòu)象。理論上來說，此時(shí)咖啡因與NdmA結(jié)合最為緊密，催化效率最高。

表3 NdmA與咖啡因(CFF)對接結(jié)果Tab.3 Docking result of NdmA and caffeine (CFF)

分析配體咖啡因與周圍氨基酸相互作用情況，結(jié)果如圖3所示。可以看出，當(dāng)咖啡因與NdmA 蛋白質(zhì)結(jié)合發(fā)生催化作用時(shí)，咖啡因小分子位于A、B、C鏈的疏水口袋中，與蛋白質(zhì)接觸較為充分?？Х纫蛑車被釟埢植及ū奖彼?、亮氨酸、脯氨酸、天冬酰胺和纈氨酸(F168，F(xiàn)174，L182，P219，F(xiàn)223，L248，N282和V285)。A鏈中N282、L248和F168與咖啡因之間形成碳?xì)滏I且L182、L248和N282參與了和咖啡因之間的的疏水相互作用；B鏈中N282和P219與咖啡因之間形成碳?xì)滏I且L182、L248、V285和P219參與了和咖啡因之間的疏水相互作用；C鏈中F168、N282和P219與咖啡因之間形成碳?xì)滏I且L182、L248、V285、F281和N282參與了和咖啡因之間的疏水相互作用。值得注意的是，三條鏈中N282皆與咖啡因之間形成碳?xì)滏I，因此推測N282可能是NdmA與咖啡因結(jié)合的關(guān)鍵氨基酸。且在B鏈和C鏈中，F(xiàn)168與咖啡因分子上的嘧啶環(huán)形成π-π堆積作用，為化合物提供了強(qiáng)大的范德華力使蛋白質(zhì)和配體緊密結(jié)合。

(a) NdmA(A)

(b) NdmA(B)

(c) NdmA(C)

為了驗(yàn)證F168和N282在NdmA與咖啡因結(jié)合過程中的關(guān)鍵性，將其突變?yōu)锳168和A282，以A鏈為例再次進(jìn)行對接，結(jié)果如表4所示。從對接結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，此時(shí)的最優(yōu)構(gòu)象并不是結(jié)合自由能最低的構(gòu)象，再次證明了F168和N282對咖啡因與NdmA緊密結(jié)合起到非常重要的作用。

綜上所述，理論上分析咖啡因與NdmA之間的催化反應(yīng)應(yīng)具有配體與蛋白質(zhì)結(jié)合緊密，吻合度較高，反應(yīng)較完全等特點(diǎn)。

2.3 NdmA與茶堿(TEP)對接結(jié)果

通過Vina軟件得到的NdmA蛋白質(zhì)與茶堿分析配體茶堿與周圍氨基酸相互作用情況，結(jié)果如圖4所示。從圖4中可以看出，茶堿小分子配體皆位于NdmA(A)、NdmA(B)和NdmA(C)的對接口袋中，且與蛋白質(zhì)接觸較為充分。在NdmA(A)中，茶堿周圍分布的氨基酸殘基包括F168、L182、P219、F223、L248、N282和V285，其中L182和P219與茶堿之間形成碳?xì)滏I，F(xiàn)281、L248、N282和V285參與了與茶堿的疏水相互作用。在NdmA(B)中，茶堿周圍分布的氨基酸殘基包括F168、L182、P219、F223、L248和V285，其中F168和P219與茶堿之間形成碳?xì)滏I，F(xiàn)281、L248、P219和L182參與了與茶堿的疏水相互作用。同樣的，在NdmA(C)中茶堿周圍分布的氨基酸殘基包括F168、L182、P219、F223、L248和V285，其中F168和P219與茶堿之間形成碳?xì)滏I，且F223、L248、V285、P219、F281和L182參與了與茶堿的疏水相互作用。盡管不同鏈中茶堿分子周圍的相互作用氨基酸殘基有所不同，但是無論是在A、B或C鏈中，F(xiàn)168都與茶堿分子上的嘧啶環(huán)形成π-π堆積作用，為化合物提供了強(qiáng)大的范德華力。因此推測，在NdmA中，F(xiàn)168和P219可能是與茶堿結(jié)合的關(guān)鍵氨基酸。

表4 突變后NdmA與咖啡因(CFF)對接結(jié)果Tab.4 Docking results of NdmA and caffeine (CFF)after mutation

對接打分結(jié)果如表5所示。從表5中結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，A鏈中Mode-4的結(jié)合自由能雖然不是最低，但是RMSD值最小，與原復(fù)合物中構(gòu)象吻合度較高，故推測Mode-4為計(jì)算結(jié)果的最優(yōu)構(gòu)象。同理，在B鏈和C鏈中，Mode-4和Mode-3也應(yīng)分別為此鏈對應(yīng)的計(jì)算結(jié)果的最優(yōu)構(gòu)象。

表5 NdmA與茶堿(TEP)對接結(jié)果Tab.5 Docking result of NdmA and theophylline (TEP)

(a) NdmA(A)

(b) NdmA(B)

(c) NdmA(C)

圖4 茶堿與氨基酸的相互作用

Fig.4 The interaction between theophylline and amino acids

由于茶堿分子皆與NdmA之間形成π-π堆積作用，可認(rèn)為茶堿與NdmA的結(jié)合較為緊密，NdmA可以較好的催化茶堿分子完成脫甲基化。

2.4 NdmAQL與可可堿(37T)對接

通過Vina軟件得到的NdmAQL蛋白質(zhì)與可可堿對接結(jié)果，如表6所示。從表6中結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，根據(jù)RMSD值，最優(yōu)構(gòu)象僅存在于A鏈中，在B鏈和C鏈中并無最優(yōu)構(gòu)象。

表6 NdmAQL與可可堿(37T)對接結(jié)果Tab.6 Docking result of NdmAQL and theobromine (37T)

對比NdmAQL(A)中Mode-4與原化合物中可可堿周圍氨基酸殘基相互作用情況，如圖5所示。從圖5可以看出，與可可堿發(fā)生相互作用的氨基酸殘基皆為L248、F168、V285和L182，區(qū)別在于原化合物中F168與可可堿分子上的嘧啶環(huán)形成π-π堆積作用，由于Mode-4未與F168形成π-π 堆積作用，導(dǎo)致分子對接結(jié)果不理想。出現(xiàn)這種結(jié)果可能是計(jì)算過程所使用的軟件不同，不同軟件之間在構(gòu)象搜尋過程中存在一定誤差，故未找到最優(yōu)構(gòu)象。

(a) Mode-4(b) 原化合物圖5 NdmAQL(A)中可可堿分子對接情況對比Fig.5 Comparison of the docking status of theobrominemolecules in NdmAQL(A)

3 結(jié) 論

根據(jù)NdmA與咖啡因間的相互作用，推測N282和F168為咖啡因能夠緊密結(jié)合在蛋白質(zhì)的疏水空腔內(nèi)的關(guān)鍵氨基酸殘基，可以高效地完成催化氧化作用。NdmA中的F168與茶堿之間存在π-π堆積，這使得配體與蛋白質(zhì)之間結(jié)合較為緊密，故配體與受體的吻合度較高，認(rèn)為 NdmA對茶堿的催化效果較好。還發(fā)現(xiàn)在茶堿與 NdmA之間，L182、F168、P219易與茶堿上的氧原子和氫原子之間形成碳?xì)滏I。且通過分析蛋白質(zhì)與小分子配體間的相互作用，推測P219和F168為茶堿能夠緊密結(jié)合在蛋白質(zhì)的疏水空腔內(nèi)的關(guān)鍵氨基酸殘基，可以高效地完成催化氧化作用。NdmAQL與可可堿的對接結(jié)果中，只有A鏈上存在與實(shí)驗(yàn)結(jié)果較為接近的可可堿構(gòu)象，但在B鏈和C鏈中均未發(fā)現(xiàn)，推測可能是由于NdmAQL本身氨基酸的性質(zhì)導(dǎo)致此結(jié)果，且在NdmAQL中，只有A鏈可以與可可堿結(jié)合并進(jìn)行催化反應(yīng)，其余部位則可能較為困難。

研究結(jié)果表明，N-脫甲基酶主要由NdmA、NdmB、NdmC、NdmD和NdmE 5種蛋白質(zhì)組成，但是只有NdmA的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)得到了較為全面且合理的解釋，期待未來相關(guān)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)能夠被全部解析，深入探索咖啡因的降解機(jī)理，降低咖啡因等相關(guān)甲基黃嘌呤對環(huán)境的危害。