謝 芳

（貴陽市疾病預(yù)防控制中心檢驗(yàn)科，貴州 貴陽 550003）

艾滋?。╝cquired immune deficiency syndrome，AIDS）是一種危害性極大的傳染病，由艾滋病病毒（HIV）感染引起，HIV是一種主要攻擊人體免疫系統(tǒng)的病毒，其將人體免疫系統(tǒng)中最重要的T淋巴細(xì)胞作為攻擊目標(biāo)，大量破壞免疫細(xì)胞，使人體免疫功能低下，導(dǎo)致感染各種疾病，也有引發(fā)惡性腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)。HIV抗體檢測是目前診斷AIDS患者感染HIV的重要診斷依據(jù)，以往臨床上主要應(yīng)用免疫印跡法、膠體層析法、明膠吸附實(shí)驗(yàn)等方法檢測HIV，其中免疫印跡法常作為臨床檢測的金標(biāo)準(zhǔn)，其是一種將高分辨率凝膠電泳和免疫化學(xué)分析技術(shù)相結(jié)合的雜交技術(shù)，具有分析容量大、敏感度高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，是檢測蛋白質(zhì)特性、表達(dá)與分布的一種最常用方法，如組織抗原的定性定量檢測、多肽分子的質(zhì)量測定與病毒的抗體或抗原檢測等，但該檢測方法試劑成本昂貴，難以進(jìn)行大范圍的HIV抗體篩查，存在一定局限性[1-2]；膠體層析法應(yīng)用較多，操作迅速、簡單，適合初次篩查，但有學(xué)者指出，該方法檢測的特異度較低，易導(dǎo)致漏檢，對(duì)不確定樣本需復(fù)檢[3]。酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)法是目前臨床實(shí)驗(yàn)室檢測免疫學(xué)指標(biāo)最受歡迎、應(yīng)用范圍最廣泛的方法之一，被廣泛應(yīng)用于乙肝、丙肝、梅毒、AIDS及結(jié)核等傳染類疾病的診斷與激素的檢測，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、快速簡便、成本低、環(huán)保且適合大批量人群篩查等優(yōu)點(diǎn)[4-5]。因此，本研究旨在探討膠體層析法、酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)法在HIV抗體初次篩查中的應(yīng)用，并分析其對(duì)HIV感染的診斷價(jià)值，為臨床診斷與合理治療AIDS提供指導(dǎo)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 回顧性分析貴陽市疾病預(yù)防控制中心利用全國艾滋病實(shí)驗(yàn)室檢測管理系統(tǒng)收集的2020年9月至2021年9月貴陽市的308例疑似AIDS檢測者的臨床資料。其中男性222例，女性86例；年齡23～54歲，平均（38.28±4.20）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：與HIV攜帶者有性接觸者；所有檢測者均為初次篩選；臨床資料完整者等。排除標(biāo)準(zhǔn)：已接受抗HIV治療者；合并其他血液系統(tǒng)疾病、免疫系統(tǒng)疾病、肝、腦、心等臟器功能衰竭者；已確診為HIV感染者等。本研究已通過貴陽市疾病預(yù)防控制中心醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 研究方法

1.2.1 主要儀器 全自動(dòng)蛋白印跡儀（新加坡健利檢驗(yàn)診斷有限公司，型號(hào)：AutoBlot System-20）；酶標(biāo)分析儀（深圳市匯松科技公司，型號(hào)：MB-580）；全自動(dòng)酶標(biāo)洗板機(jī)（深圳市匯松科技發(fā)展有限公司，型號(hào)：PW-960plus）。

1.2.2 檢測方法 采集所有檢測者空腹靜脈血5 mL，離心（3 000 r/min的轉(zhuǎn)速，時(shí)間10 min）后取血清，于-20 ℃環(huán)境中儲(chǔ)存待檢。①膠體層析法：將標(biāo)本恢復(fù)至室溫，取60 μL檢測樣本（微量加樣器），置于試劑卡加樣處，在30 min內(nèi)得到檢測結(jié)果。應(yīng)用免疫層析原理，對(duì)HIV1+2抗體進(jìn)行定性檢測，血樣中若存在HIV1+2抗體，則硒膠體-?抗原則會(huì)結(jié)合HIV1+2抗體。陽性判斷：檢測區(qū)、對(duì)照區(qū)均有紫紅色條帶；陰性：僅對(duì)照區(qū)可見紫紅色條帶。②酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)法：選擇HIV1+2抗原、HIV1+2包被的微孔板，應(yīng)用過氧化物酶標(biāo)記，按照說明書完成HIV1+2抗體檢測。取出酶標(biāo)板，分別設(shè)置1孔樣品、1孔空白對(duì)照、2孔陰性對(duì)照、3孔陽性對(duì)照，除空白孔外，每孔分別加100 μL陽性、陰性對(duì)照品、樣品。實(shí)驗(yàn)步驟：孵育30 min，反復(fù)洗板6次，干燥。除空白孔外，每孔分別加100 μL酶標(biāo)記抗原，孵育20 min，反復(fù)洗板6次，干燥。加底物液，避光反應(yīng)15 min，隨后加終止液，讀取酶標(biāo)分析儀上吸光度（OD）值。陽性判斷：樣品OD值≥ 1，否則為陰性。③免疫印跡法[6]：陽性判斷：至少有2條膜帶（gP41/gP120/gP160）或至少1條膜帶與P24帶同時(shí)出現(xiàn)；陰性：無HIV抗體特異性條帶出現(xiàn)。

1.3 觀察指標(biāo) ①以免疫印跡法為金標(biāo)準(zhǔn)，分析膠體層析法、酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)法對(duì)HIV感染的檢測結(jié)果、診斷效能。靈敏度 = 真陽性例數(shù)/（真陽性+假陰性）例數(shù)×100%，特異度 = 真陰性例數(shù)/（假陽性+真陰性）例數(shù)×100%，準(zhǔn)確度=（真陽性+真陰性）例數(shù)/總例數(shù)×100%，陽性預(yù)測值 = 真陽性例數(shù)/（真陽性+假陽性）例數(shù)×100%，陰性預(yù)測值 = 真陰性例數(shù)/（真陰性+假陰性） × 100%。②通過酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)定量測定陽性樣本帶型分布情況。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)，其中計(jì)量資料、計(jì)數(shù)資料分別采用(±s)、[例(%)]表示，組間比較分別行t、χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)法與免疫印跡法 HIV感染308例檢測者中免疫印跡法檢測出HIV感染陽性有220例，陰性88例；酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)法檢測出HIV感染陽性有219例，陰性89例，陽性檢出率為71.10%（219/308），低于免疫印跡法陽性檢出率的71.43%（220/308），但兩組間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2= 0.008，P＞0.05），見表1。

表1 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)法與免疫印跡法檢測結(jié)果( 例 )

2.2 膠體層析法與免疫印跡法 308例檢測者中膠體層析法檢測出HIV感染陽性有220例，陰性88例，陽性檢出率為71.43%（220/308），與免疫印跡法陽性檢出率71.43%（220/308）比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2= 0.000，P＞0.05），見表 2。

2.3 診斷效能 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)法檢測對(duì)HIV感染診斷的靈敏度、特異度、準(zhǔn)確度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值均顯著高于膠體層析法檢測，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表 3。

表3 兩種檢測方式的診斷效能比較(%)

2.4 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)法檢測陽性樣本帶型分布 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)法檢測陽性樣本帶型分布情況可見，219例AIDS患者中g(shù)P160、gP120帶型出現(xiàn)率最高，出現(xiàn)率為100.00%，P55出現(xiàn)率最低，出現(xiàn)率為32.88%，見表4。

表4 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)法檢測陽性樣本帶型分布情況

3 討論

HIV又被稱為人類免疫缺陷病毒，HIV感染會(huì)引起各種機(jī)會(huì)性感染和腫瘤的發(fā)生，也會(huì)引發(fā)群眾的恐慌心理，部分惡性并發(fā)癥會(huì)對(duì)人的健康生活帶來嚴(yán)重影響，甚至?xí){患者生命。近年來，我國AIDS發(fā)病率已經(jīng)進(jìn)入快速增長階段，做好AIDS預(yù)防、控制工作刻不容緩[7]。因此，如何有效防控AIDS已經(jīng)成為臨床上關(guān)注的重點(diǎn)。與其他病原微生物檢測相比，HIV檢測的要求更加嚴(yán)格，任何微小的錯(cuò)誤均可能造成檢查結(jié)果誤差，對(duì)受檢者造成嚴(yán)重影響，因此，保證HIV檢測的靈敏度與特異度非常重要[8]。免疫印跡法作為HIV抗體檢測的金標(biāo)準(zhǔn)，檢測技術(shù)準(zhǔn)確率極高，但費(fèi)用高昂，因此不適合作為廣泛性篩查手段，而在選擇初篩檢測方法時(shí)，為降低成本支出，減少檢測人員工作量，應(yīng)盡量選擇高準(zhǔn)確度的HIV抗體初篩方法[9]。

膠體層析法、酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)法均是目前常用的HIV抗體初篩方法，其中，膠體層析法可對(duì)HIV抗體進(jìn)行定性，其檢測原理為HIV抗體與硒膠體-?抗原結(jié)合，可被合成肽、重組抗原捕捉固定，顯示紅線，該檢測方法還具有檢測費(fèi)用低、需要設(shè)備少、反應(yīng)快速等特點(diǎn)，膠體層析法對(duì)HIV抗體檢測的檢出率較高，可作為HIV篩查、風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的參考依據(jù)，但在應(yīng)用膠體層析法檢測時(shí)，也可能出現(xiàn)漏診、誤診情況[10-11]。

酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)法對(duì)高、低值質(zhì)控血清的HIV抗體檢出率均處于較高水平，且能夠顯示帶型分布，更適合作為HIV初次篩查手段，從其檢測原理上看，主要是通過將HIV抗原包被于固相載體，然后加入酶標(biāo)記HIV抗原后，再加入待檢樣品，通過底物顯色，以酶標(biāo)儀顯示檢測結(jié)果，其利用酶催化底物反應(yīng)，形成放大效果，有效提高檢測的靈敏度；由于該檢測方法的穩(wěn)定性較高，且受溶血因素影響較小，因此檢測誤差較小[12]。本研究結(jié)果顯示，308例檢測者中免疫印跡法陽性檢出率為71.43%，酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)法陽性檢出率為71.10%，膠體層析法陽性檢出率為71.43%；酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)法檢測的靈敏度、特異度、準(zhǔn)確度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值均顯著高于膠體層析法檢測，表明酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)法應(yīng)用于艾滋病病毒抗體初次篩查中的診斷價(jià)值更高。酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)法可在室溫環(huán)境下完成，無需特殊設(shè)備，可一次性檢測多個(gè)樣本，操作簡單，更適合廣泛性篩查；此外，通過酶標(biāo)儀讀取數(shù)據(jù)，降低溫度、標(biāo)本處理等因素對(duì)檢測結(jié)果的影響，也能夠提高酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)法檢測結(jié)果的客觀性、準(zhǔn)確性及科學(xué)性。相關(guān)研究顯示，采用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)法經(jīng)過初次篩選，結(jié)果顯示2 875份標(biāo)本呈陽性份27份，陽性概率為0.94%，對(duì)27份標(biāo)本進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室確認(rèn)，其中，確定為陽性份的17份，占原本陽性份62.96%；不確定份4份，占23.53%；陰性份6份，占22.22%，提示酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)法運(yùn)用于艾滋病檢驗(yàn)中HIV抗體篩查效果較好，但是為了保證準(zhǔn)確率，應(yīng)該規(guī)范操作，同時(shí)選取合格標(biāo)本，保證試劑質(zhì)量，充分降低假陽性率[13]。本研究結(jié)果顯示，酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)法檢測的219例陽性病例中，gP160、gP120帶型出現(xiàn)率最高，出現(xiàn)率為100.00%，P55出現(xiàn)率最低，出現(xiàn)率為32.88%，說明HIV在gP160、gP120帶型人群中較為活躍、傳染性較強(qiáng)，對(duì)此類人群需加強(qiáng)HIV監(jiān)測。

應(yīng)注意的是，雖然酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)法檢測價(jià)值高，但也存在假陽性、假陰性情況，可能與實(shí)驗(yàn)操作繁瑣、類風(fēng)濕因子、人為因素及環(huán)境因素干擾等有關(guān)[14]。相關(guān)標(biāo)本干擾因素主要包括以下方面：①內(nèi)源性干擾因素，即高濃度非特異性免疫球蛋白、補(bǔ)體、類風(fēng)濕因子等。處理方法為，在標(biāo)本采集后，可用0.01 mol/L的磷酸鹽緩沖液稀釋，在56 ℃溫度下滅活30 min。②外源性干擾因素，即標(biāo)本采集、送檢、保存過程中因人為或環(huán)境因素引起的污染、溶血、存儲(chǔ)時(shí)間過長、加入抗凝物質(zhì)不當(dāng)、凝集不全等。處理方法為，嚴(yán)格按照說明書及無菌操作執(zhí)行相關(guān)操作，避免過度劇烈震蕩，防止溶血；待其凝固或血塊收縮后進(jìn)行離心處理，立即檢測標(biāo)本。

綜上，與膠體層析法相比，酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)法在HIV抗體初次篩查中診斷價(jià)值更高，可用于臨床HIV抗體初次篩查。