王 瑞，張玲葉，杜艷華

(廣東省深圳市龍華區(qū)人民醫(yī)院心內(nèi)科，廣東 深圳 518109)

急性ST段抬高型心肌梗死(ST-segment elevation myocardial infarction，STEMI)再灌注治療后心肌的缺血再灌注損傷，不同程度抵銷了灌注治療作用[1-3]。Sigma-1受體(Sigma-1 receptor,Sig-1R)應(yīng)用于心肌疾病患者中具顯著保護(hù)心肌作用[4-5]。新型選擇性5-羥色胺再攝取抑制劑(selective serotonin reuptake inhibitors，SSRIs)如舍曲林、氟伏沙明具備很強(qiáng)的Sigma-1受體激動(dòng)效果[6-7]。在改善抑郁癥狀的同時(shí)對(duì)心臟具備防護(hù)效果[8]，主要用于心血管疾病與抑郁的治療。筆者前期研究提示PRE-084降低心肌缺血后灌注損所傷引起細(xì)胞調(diào)亡，其機(jī)制與激活A(yù)kt / eNOS信號(hào)通路有關(guān)[9]。本研究通過大鼠建立在體缺血后灌注損傷模型觀察大鼠缺血再灌注損傷應(yīng)用PRE-084對(duì)心肌梗死范及效果。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及主要試劑

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選用24只重量在220～250 g的SD雄性大鼠(動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK鄂2015-0018)由武漢大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供為研究對(duì)象，其均為SPF級(jí)。

1.1.2試劑盒 試劑盒均為購自南京建成生物工程研究所的超氧化物歧化酶(super oxide dismutase，SOD)測(cè)試試劑盒、丙二醛(monochrome display adapter，MDA)測(cè)試試劑盒、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)測(cè)試試劑盒及肌酸激酶同工酶(creatine kinase isoenzyme，CK-MB)測(cè)定試劑盒。

1.2實(shí)驗(yàn)分組 將24只大鼠采用電腦進(jìn)行隨機(jī)分組，PRE-084組(8只)、假手術(shù)組(8只)以及缺血后灌注組(8只)，其中缺血后灌注組與假手術(shù)組術(shù)前輸入生理鹽水，PRE-084組輸入同量的1 mg/kg PRE-084，假手術(shù)組不結(jié)扎只穿線。實(shí)驗(yàn)在武漢大學(xué)人民醫(yī)院心血管211實(shí)驗(yàn)室完成。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1動(dòng)物模型制作及樣本獲取 大鼠術(shù)前12 h禁食。簡(jiǎn)要操作方法為：將10%水合氯醛依據(jù)3 mL/kg的比例進(jìn)行麻醉注射，在實(shí)驗(yàn)大鼠氣管插管后，將其與動(dòng)物呼吸機(jī)鏈接并設(shè)頻率為60次/min，潮氣量設(shè)置為50 g/mL，在胸骨左側(cè)開，用細(xì)小彎針在冠狀動(dòng)脈左前降支中上1/3處穿線(6/0號(hào))，穿雙線(一根用于尹文思蘭染色前結(jié)扎)。以肉眼可見結(jié)扎點(diǎn)的肉眼觀察到遠(yuǎn)端心前壁變紫或蒼白，結(jié)扎后進(jìn)行心電圖ST段變化情況的評(píng)估，將其中無變化者淘汰，于缺血30 min之后，松開結(jié)扎線，觀察約10 min后逐層縫合，連續(xù)觀測(cè)心電圖30 min。

1.3.2大鼠心功能的監(jiān)測(cè) 再灌注24 h后再次以10%水合氯醛(3 mL/kg)腹腔注射麻醉，仰臥固定四肢與頭，雙上肢和雙下肢皮下依次鏈接針形心電圖電極，觀察并記錄Ⅱ?qū)?lián)心電圖情況。采用酒精對(duì)頸、胸部進(jìn)行消毒后，剪除頸前縫線，輕輕分離頸前肌后可見氣管，再次插管；將右側(cè)頸部肌進(jìn)行分離，暴露頸動(dòng)脈后結(jié)扎遠(yuǎn)心端，近端用小動(dòng)脈夾夾閉；在動(dòng)脈上剪一“V”字形口，用聚乙烯導(dǎo)管插入切口，松開動(dòng)脈夾，小心推送導(dǎo)管，使導(dǎo)管緩慢經(jīng)過右側(cè)頸總動(dòng)脈最后進(jìn)左心室，將血管與導(dǎo)管用線結(jié)扎，固定導(dǎo)管。壓力換能器連接生物信號(hào)分析系統(tǒng)，記錄心臟壓力曲線。記錄保存2 min的左心室壓力曲線。根據(jù)壓力曲線分析(Biopac system軟件)左心室收縮壓(left ventricular systolic pressure，LVSP)、左心室舒張末壓(left ventricular end diastolic pressure，LVEDP)、等容收縮期左心室內(nèi)壓力上升的最大速率(+dp/dtmax)及等容舒張期左心室壓力下降的最大速率(-dp/dtmax)，心率(heart rate，HR)。

1.3.3CK-MB 心功能檢測(cè)完成后分離一側(cè)股靜脈，先從股靜脈取血1 mL用于查血清CK-MB。

1.3.4心肌梗死面積測(cè)定 取血完成后再次插管；接呼吸機(jī)。剪開胸壁，用前1 d預(yù)留的線再次結(jié)扎冠狀動(dòng)脈，從股靜脈注入1%伊文思藍(lán)2 mL, 可以讓非缺血區(qū)心肌藍(lán)染。然后取之心臟，沖洗后祛除心房心室，在-80 ℃冰箱冰凍20 min后取出，將其切成4～6塊1.5 mm心肌片,其放在37 ℃的2,3,5-triphenyltetrazolium chloride,TTC溶液中15 min，將活的心肌組織染成磚紅色。依次用濾紙將切片吸干水分后進(jìn)行稱重。雙面彩色拍照。根據(jù)心肌厚片表面的3種顏色, 用Photoshop7.0和計(jì)算不規(guī)則多邊形面積軟件分別測(cè)定雙面梗死區(qū)面積和缺血區(qū)面積占整片心肌切面的百分比。

1.4心肌SOD、MDA測(cè)定 心肌梗死面積測(cè)定完成后行留取缺血區(qū)心肌，采用冰生理鹽水進(jìn)行處理,并以濾紙吸干后進(jìn)行稱重, 低溫勻漿離心,吸取上清測(cè)定MDA含量和 SOD活性 。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)。計(jì)量資料比較采用t檢驗(yàn)、單因素方差分析和SNK-q檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1PRE-084對(duì)缺血再灌注對(duì)大鼠血清CK-MB、SOD及MDA的影響的影響 再灌注結(jié)束后檢測(cè)各組CK-MB，結(jié)果顯示，I/R組、PRE-084組的CK-MB值和MDA值均高于Sham組，SOD值低于Sham組，PRE-084組的CK-MB值和MDA值均均低于I/R組，SOD值高于I/R組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 PRE-084對(duì)缺血再灌注大鼠CK-MB、SOD、MDA的影響Table 1 Effect of PRE-084 on CK-MB, SOD and MDA in ischemia-reperfusion rats

2.2PRE-084對(duì)血流動(dòng)力學(xué)的影響 再灌注24 h后，與Sham組相比，PRE-084組及I/R組+dp/dtmax、-dp/dtmax、LVSP明顯下降,與I/R組相比，PRE-084組明顯上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與Sham組相比，PRE-084組及I/R組LVEDP升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，I/R組和PRE-084組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

表2 PRE-084對(duì)血流動(dòng)力學(xué)的影響Table 2 Effects of PRE-084 on hemodynamics

2.3PRE-084對(duì)心肌梗死面積的影響 I/R組與PRE-084組缺血區(qū)占左心室面積分別為(0.45±0.08)mm2和 (0.45±0.09)mm2，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.000，P=1.000)。兩組的心肌梗死范圍分別為(0.49±0.10)%和(0.35±0.09)%，兩組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.943，P=0.054)。

3 討 論

急性心肌梗死病死率和致殘率高，盡早進(jìn)行心肌再灌注治療可以降低病死率，改善患者心功能，是最佳治療方案。然而部分患者的缺血心肌在恢復(fù)血液灌注后，因氧化應(yīng)激等引起組織細(xì)胞損傷,可導(dǎo)致心肌梗死面積擴(kuò)大情況的發(fā)生，且心功能呈現(xiàn)降低的趨勢(shì)，并可出現(xiàn)再灌注性心律失常等異常情況。心肌缺血后灌注損傷降低了再灌注治療作用。近年來心肌缺血/再灌注損傷的發(fā)生機(jī)制是臨床研究的重點(diǎn)與熱點(diǎn)之一。本前期研究提示Sigma-1受體激動(dòng)劑PRE-084可通過激活A(yù)kt/eNOS信號(hào)通路降低心肌缺血再灌注損傷引起的細(xì)胞凋亡，提示Sigma-1受體激動(dòng)劑PRE-084可能具有降低心肌梗死面積，并有助于改善心功能，其機(jī)制除了降低細(xì)胞凋亡外，還可對(duì)氧自由基產(chǎn)生產(chǎn)生影響，顯著提升其對(duì)氧自由基的清除能力。

缺血再灌注的前數(shù)分鐘，能經(jīng)過多種途徑產(chǎn)生大量活性氧[10]。相關(guān)學(xué)者用同位素方法證實(shí)心肌缺血及其后的再灌注過程中有活性氧的形成[11]，之后臨床研究發(fā)現(xiàn)抗氧自由基治療具有心肌保護(hù)作用[12-13]。MDA是I/R損傷中自由基所誘導(dǎo)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)產(chǎn)物之一[14]。其可導(dǎo)致細(xì)胞膜受損，出現(xiàn)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能等方面的損傷[15]。因此MDA對(duì)于體內(nèi)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)具有一定的反應(yīng)作用，間接地反映細(xì)胞損傷的程度。本研究顯示，PRE-084治療組MDA下降，提示對(duì)心肌保護(hù)作用與降低氧自由其損傷有關(guān)。體內(nèi)自由基的清除通過SOD實(shí)現(xiàn)，SOD是過氧化物酶，能夠還原過氧化物，減少活性氧簇的生成。超氧化物可快速, 自發(fā)歧化為過氧化氫, 在SOD作用下這種轉(zhuǎn)化可加速約1萬倍，這種快速轉(zhuǎn)換有效地防止了O2-與其他生物分子在細(xì)胞中的反應(yīng)。本研究顯示缺血后灌注使SOD顯著下降，降低了氧自由基清除能力，而PRE-084治療組SOD上升，提示PRE-084治療增加機(jī)體對(duì)氧自由基的清除能力。

本研究提示再灌注24 h后，經(jīng)PRE-084預(yù)處理，心肌梗死后心肌細(xì)胞膜受損時(shí)，可導(dǎo)致其細(xì)胞內(nèi)釋放，并進(jìn)入血液中，因此其在血液中的表達(dá)水平有助于了解心肌的受損程度。同時(shí)，PRE-084治療組心臟功能顯著升高，提示PRE-084治療降低心肌缺血再灌注心肌損傷。

綜上所述，PRE-084預(yù)處理減少心肌梗死后心肌損傷作用機(jī)制可能與Sigma-1受體激動(dòng)劑PRE-084可激活的Akt/eNOS信號(hào)通路降低心肌缺血再灌注損傷，及降低氧自由基損傷等有關(guān)。