李 英， 鄧 超， 計 超?？谑腥嗣襻t(yī)院 重癥醫(yī)學科，海南 ?？?570208

膿毒癥是一種由于宿主對感染的反應失調而引起的危及生命的器官功能障礙[1]。膿毒癥的發(fā)病機制復雜，涉及感染、炎癥反應、免疫等多方面因素。目前，可用的生物標志物尚不能實現(xiàn)膿毒癥(特別是膿毒性休克)的早期診斷和個體化治療[2]。因此，急需能夠反映膿毒癥早期發(fā)生、進展及預測其預后的生物標志物。血清微小RNA(miRNAs)是一組非編碼RNA，作為一種遺傳物質，其在細胞間的通訊中起著至關重要的作用[3]。既往有研究探討膿毒癥患者miRNAs差異化表達譜，并對其潛在作用進行研究[4-5]。然而，miRNAs參與膿毒癥發(fā)病機制的研究還有待進一步深入。本研究采用高通量測序技術對膿毒癥患者的血清miRNAs進行分析，篩選得到差異性表達miRNAs，以期為膿毒癥嚴重程度及預后的早期評估尋找新的生物標志物，為膿毒癥的定制治療提供幫助?，F(xiàn)報道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取自2018年9月至2021年1月?？谑腥嗣襻t(yī)院收治的63例膿毒癥、30例膿毒性休克住院患者為研究對象。膿毒癥或膿毒性休克的診斷依據為《中國膿毒癥/膿毒性休克急診治療指南(2018)》[6]。納入標準：(1)序貫器官功能衰竭評估(sequential organ failure assessment，SOFA)評分(膿毒癥相關)≥2分；(2)確診膿毒癥后進行充分的容量復蘇和血管收縮藥物持續(xù)升壓，動脈血壓≥65 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)；(3)血清乳酸水平>2 mmol/L。排除標準：(1)年齡<18周歲；(2)因其他非感染性因素引致多器官功能障礙；(3)因激素類或免疫抑制劑治療而出現(xiàn)自體免疫性疾病；(4)合并其他影響凝血功能的疾病或惡性腫瘤；(5)合并其他可能影響本研究結果的疾病。另外，從我院健康體檢中心隨機抽取30例健康志愿者作為健康組。健康組男性18例，女性12例；年齡(69.50±13.91)歲。膿毒癥組男性62例，女性31例；年齡(70.80±15.71)歲。本研究經醫(yī)院倫理委員會批準，受試者或家屬均簽署知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 血液樣本采集 使用EDTAK采血管采集3.0 ml外周靜脈血樣本。全血4℃下儲存。樣品在3 000 r/min、4 ℃下離心10 min，取上清液置于1.5 ml無酶離心管中，然后進一步在13 000 r/min離心2 min，取上清液置于1.5 ml底部錐形離心管中，去除沉淀物，樣品保存在-80℃中進行后續(xù)實驗。

1.2.2 應用高通量測序技術檢測血清miRNAs差異表達 用Trizol試劑隨機從3例膿毒癥患者和3例健康人的血清上清樣本中提取總RNA，用凝膠電泳分離DNA片段，將5′端和3′端的RNAadaptor連接到純化小RNA的上，用于反轉錄和聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction，PCR)擴增，用瓊脂糖凝膠電泳回收純化片段(約140 bp)，在Agilent 2100生物分析儀上進行核酸樣品質量控制。采用高通量測序確定表達變化超過2倍的miRNAs作為預測miRNA靶基因和功能富集分析的候選基因。

1.2.3 檢測miR-98表達水平 使用QIAamp RNA血液試劑盒(德國Qiagen公司)從血清樣本中提取總RNA。用蛋白質/核酸定量器測定RNA原液濃度，保存在-80℃中進行后續(xù)實驗。互補DNA(complementary DNA，cDNA)是由Taqman?MicroRNA反轉錄試劑盒(美國Applied Biosystems公司)合成的。采用ABI7500熒光定量PCR系統(tǒng)進行cDNA擴增的實時熒光定量PCR反應。所有的樣本一式三份。以miRNA cel-miR-39(5′-UCACCGGGUGUAAAUCAGCUUG)作為合成的內參對照，將血清miR-98表達水平歸一化為cel miR-39表達，并用2-ΔΔCt法測定。miR-98正向引物:5′-ATCCAGTGCGTGTCGTG-3′；miR-98反向引物：5′-TGCTTGAGGTAGTAAGTTG-3′。

1.2.4 酶聯(lián)免疫吸附法檢測血清可溶性自殺相關因子及其配體水平 采用商用酶聯(lián)免疫吸附試劑盒(中國武漢Cusabio Biotech公司，CSB-E04542h，CSB-E04544h)測定人血清中可溶性自殺相關因子(soluble factor associated suicide,sFas)及其配體(soluble Fas ligand，sFasL)濃度。

2 結果

2.1 高通量測序技術檢測血清中miRNAs的差異性表達譜 采用高通量測序技術檢測膿毒癥患者和健康人的血清miRNA表達，共有73個差異性表達miRNAs(圖1)。與健康組相比，膿毒癥組有35個miRNA顯著上調，38個miRNA顯著下調，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。其中，miR-98在膿毒癥患者血清樣本中的表達至少比健康組降低2.3倍。因此，miR-98被篩選為候選基因。

2.2 檢測各組臨床血清樣本中miR-98相對表達量 選擇高通量測序中篩選差異表達2倍以上的miR-98作為候選因子，經實時熒光定量PCR擴增，健康組、膿毒癥組患者血清樣本中miR-98相對表達量分別為1.009(0.843，1.130)和0.526(0.426，0.722)，兩組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。此外，膿毒性休克者血清miR-98相對表達量為0.406(0.356，0.458)，低于膿毒癥患者的0.647(0.493，0.912)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.3 血清樣本中miR-98相對表達量與膿毒癥患者臨床特征的關系 以血清miR-98相對表達量中位值0.526為分界線，將膿毒癥患者分為miR-98低表達亞組(n=47)和高表達亞組(n=46)。miR-98低表達亞組的血小板(blood platelet，PLT)計數(shù)、血清白蛋白(albumin，ALB)、膽堿酯酶(cholinesterase，CHE)水平顯著低于miR-98高表達亞組；與miR-98高表達亞組比較，天冬氨酸氨基轉移酶(aspartic transaminase，AST)、丙氨酸氨基轉移酶(alanine aminotransferase，ALT)、總膽紅素(total bilirubin，TBIL)、尿素氮(urea nitrogen，BUN)、血肌酐(serum creatinine，Scr)、心肌肌鈣蛋白Ⅰ(Cardiac troponin，cTnⅠ)、氨基末端腦鈉肽前體(Amino-terminal pro-brain natriuretic peptide，NT-proBNP)、D-二聚體、C反應蛋白(C-reactive protein,CRP)和降鈣素原(procalcitonin，PCT)水平明顯升高，且凝血酶原時間(prothrombin time，PT)和活化部分凝血活酶時間(activated partial thromboplastin time，APTT)延長，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

圖1 高通量測序技術檢測膿毒癥患者和健康者血清miRNAs差異性表達火山圖

表1 血清樣本中miR-98相對表達量與膿毒癥患者臨床特征的關系

2.4 膿毒癥患者血清樣本中miR-98相對表達量與sFas、sFasL水平的關系 miR-98低表達亞組患者血清sFas 為(1 462.82±367.36)pg/ml，高于miR-98高表達亞組的(922.39±365.99)pg/ml；sFasL為(94.02±33.06)pg/ml，高于miR-98高表達亞組的(59.88±30.04)pg/ml，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。經Pearson相關系數(shù)分析，血清miR-98相對表達量與血清sFas、sFasL水平均呈負相關性(r=-0.722，r=-0.553，P<0.001)。見圖2。

2.5 膿毒癥患者血清樣本中miR-98相對表達量與急性生理與慢性健康評分Ⅱ、SOFA評分的關系 miR-98低表達亞組患者SOFA評分為(10.23±3.59)分，高于miR-98高表達亞組的(6.28±2.43)分；急性生理與慢性健康評分Ⅱ(acute physicology and chronic health evaluation Ⅱ,APACHE Ⅱ)評分為(24.17±5.56)分，高于miR-98高表達亞組的(15.63±3.52)分，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。經Spearman相關系數(shù)分析，血清miR-98相對表達量與SOFA評分、APACHE Ⅱ評分均呈負相關性(r=-0.631，r=-0.594，P<0.001)。見圖3。

圖2 膿毒癥患者血清樣本中miR-98相對表達量與血清sFas、sFasL水平的相關性

圖3 膿毒癥患者血清樣本中miR-98相對表達量與SOFA評分、APACHE Ⅱ評分的相關性

2.6 30 d內病死組與存活組血清樣本中miR-98相對表達量、sFas、sFasL水平 miR-98低表達亞組患者30 d病死率為31.9%(15/47)，低于miR-98高表達亞組的10.9%(5/46)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。此外，病死組患者血清sFas、sFasL水平顯著高于存活組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 30 d內病死組與存活組患者血清miR-98相對表達量、sFas、sFasL水平

3 討論

膿毒癥患者的住院病死率約為10%，而膿毒性休克患者的住院病死率甚至可超過40%[7]。因此，準確評估膿毒癥患者的嚴重程度和預后，對于個體化臨床治療十分重要。目前，血清學檢查、SOFA評分和 APACHE Ⅱ評分是評估膿毒癥發(fā)病原因和預后的常用臨床指標，但由于膿毒癥的發(fā)病機制錯綜復雜，上述指標尚不能準確、直觀地反映膿毒癥的臨床特征[8-9]。miRNAs作為重要的基因表達調控分子，可以在多種組織和體液中檢測到，在各種疾病的發(fā)病機制和病理生理過程中起著重要作用[4-5,10]。且循環(huán)miRNAs易獲得且結構相對穩(wěn)定，這為從miRNAs水平研究多種疾病發(fā)病機制以及尋找可靠的生物學分子提供新的線索。

有研究表明，miRNAs參與膿毒癥炎癥反應和細胞凋亡過程，并可針對性地調節(jié)炎癥相關信號通路[11]。本研究采用高通量測序技術檢測膿毒癥患者和健康者血清miRNAs差異性表達譜，發(fā)現(xiàn)miR-98在膿毒癥患者血清樣本中的表達至少比健康組降低2.3倍。隨后利用實時熒光定量PCR法進行驗證，結果證實，膿毒癥患者血清miR-98表達下調，且膿毒性休克患者血清miR-98表達下調更明顯。miR-98參與30%～90%的人類基因調控以及相關的病理過程[12]。有研究表明，miR-98與某些情況下的炎癥細胞因子有關。Zhang等[13]研究報道，miR-98在心肌炎患者外周血中表達下調，且心肌細胞miR-98表達的抑制/易化可調節(jié)心肌細胞凋亡，進而誘導心肌損傷。而在本研究中，膿毒癥患者血清miR-98相對表達量與血清sFas、sFasL水平均呈負相關性，說明Fas是miR-98的潛在靶標，miR-98表達升高可以降低Fas誘導細胞凋亡的敏感性，這與Wang等[14]研究結論一致。

細胞凋亡是敗血癥和多器官功能障礙的主要病理學基礎[15]。FasL是與其主要受體Fas結合時激活凋亡外源途徑的主要配體之一，通過激活caspase-8可產生死亡信號，并進一步激活caspase-3凋亡途徑，誘導細胞凋亡損傷[16]。此外，F(xiàn)as/FasL途徑也會啟動壞死性細胞程序性死亡，這是一種不依賴于caspases途徑，而是通過受體相互作用蛋白激酶調控的細胞死亡途徑。巨噬細胞和/或淋巴細胞的活化過程本身就需要對外來病原體產生有效的炎癥和/或適應性免疫反應。對于大多數(shù)細胞來說，這些過程參與細胞自身的死亡過程。而Fas-FasL介導的淋巴細胞自殺則是炎癥或局部組織損傷過程的重要機制，F(xiàn)as/FasL系統(tǒng)平衡也被認為是有助于維持腎、胰腺、肺等不同器官免疫功能正常的分子基礎[17]。有研究表明，F(xiàn)asL-/-動物模型或通過服用Fas-受體融合蛋白FasFP競爭性抑制劑的動物模型，可明顯降低膿毒癥相關的死亡風險[18]。因此，筆者認為，F(xiàn)as/FasL信號激活可誘導體內/體外細胞凋亡增加。本研究通過分析血清miR-98表達水平與患者臨床特征的關系發(fā)現(xiàn)，miR-98低表達與肝、腎、心及凝血功能指標異常有關。APACHE Ⅱ評分和SOFA評分已廣泛應用于評估膿毒癥的嚴重程度和預后。然而，這兩項指標都涵蓋多個項目，在早期評估敗血癥的嚴重程度和預后方面價值有限。本研究血清miR-98表達與APACHE Ⅱ評分、SOFA評分都呈一定的負相關性，說明miR-98在一定程度上反映疾病進展，可作為敗血癥嚴重程度的預測指標。

綜上所述，血清miR-98檢測有助于準確地反映膿毒癥患者的臨床特征，并有望成為評估膿毒癥嚴重程度和預后的潛在生物標志物，其作用機制之一與調控Fas/FasL細胞凋亡通路有關。