余雨婷 張 彥 張 迎 李娜娜 程 研 鄭夢(mèng)迪 閆 平 柴希艷

(1. 西安醫(yī)學(xué)院，陜西 西安 710021；2. 南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇 南京 210023；3. 西安雨潤(rùn)百德健康管理有限公司，陜西 西安 710061)

紫蘇(PerillafrutescensL. Britt.)為唇形科紫蘇屬植物?！吨袊?guó)藥典》(2020版)記載，紫蘇可用于風(fēng)寒感冒、咳嗽嘔惡、妊娠嘔吐、魚(yú)蟹中毒等[1]。其含有揮發(fā)油、黃酮、酚酸、花色苷等化學(xué)成分，具有抗炎、抗氧化、抑菌、抗抑郁等作用[2]。

以肥胖、高血糖、高尿酸血癥等為主的代謝綜合征(MS)是多種代謝紊亂在體內(nèi)“聚集”的一種病理狀態(tài)，可增加糖尿病、心血管疾病等的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，近年來(lái)已成為全球公共健康問(wèn)題[3]。目前對(duì)MS的治療均為對(duì)某一疾病的單一治療，如降低血糖、血脂、血壓水平[4]，尚缺少對(duì)MS的綜合治療。有效防治MS涉及多靶點(diǎn)調(diào)控[5-6]。胰脂肪酶是胰腺腺泡細(xì)胞分泌的消化脂肪的關(guān)鍵酶，抑制胰脂肪酶可降低腸道中脂肪的消化和分解，治療肥胖[7]。黃嘌呤氧化酶(XOD)是尿酸生成的關(guān)鍵酶，在體內(nèi)可催化次黃嘌呤氧化為黃嘌呤，進(jìn)一步氧化為尿酸[8-9]。該途徑可切斷尿酸生成，從而降低尿酸水平。α-淀粉酶是重要的碳水化合物水解酶，尤其對(duì)于中國(guó)2型糖尿病以碳水化合物為主要食物的患者，抑制α-淀粉酶的活性可減少餐后高血糖[10]。乙酰膽堿酯酶(AChE)是生物神經(jīng)傳導(dǎo)中的關(guān)鍵性酶，AChE抑制劑(AChEI)是當(dāng)前阿爾茨海默癥與中老年人癡呆最常見(jiàn)的疾病靶點(diǎn)[11]。

目前對(duì)紫蘇的研究多集中于紫蘇葉、紫蘇籽粕[12]及紫蘇籽油[13]的藥用、油用、香料、食用等方面，但未見(jiàn)關(guān)于紫蘇防治MS及多靶點(diǎn)抑制作用的研究。研究擬通過(guò)IC50值評(píng)價(jià)抑制活性，并采用分子對(duì)接驗(yàn)證結(jié)果及預(yù)測(cè)更多潛在靶點(diǎn)，旨在為紫蘇作為食品添加劑預(yù)防和治療代謝綜合征的作用提供依據(jù)。

1 儀器與試劑

1.1 主要儀器

架盤(pán)藥物天平：IYT-10型，上海光正醫(yī)療儀器有限公司；

數(shù)顯控溫電熱套：SXKW型，北京市永光明醫(yī)療儀器廠(chǎng)；

電熱恒溫水浴鍋：DZKW-D-2型，北京市永光明醫(yī)療儀器廠(chǎng)；

超聲波清洗器：KQ-250B型，昆山市超聲儀器有限公司；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：XD-52AA型，上海賢德實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；

干燥箱：101-1 型，上海市實(shí)驗(yàn)儀器總廠(chǎng)；

紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：UV-1100 型，上海美譜達(dá)儀器有限公司；

高效液相色譜儀：Agilent 1260 LC型，美國(guó)安捷倫科技有限公司；

電子分析天平：SQP型，賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司；

砂芯過(guò)濾器：1 000 mL，上海申迪玻璃儀器有限公司；

酶標(biāo)儀：ReadMax 1900/1900Plus型，上海閃譜生物科技有限公司。

1.2 試劑與試藥

紫蘇：2017—2019年采集于陜西西安、眉縣和甘肅正寧，經(jīng)西安醫(yī)學(xué)院生藥教研室汪興軍老師鑒定為唇形科植物紫蘇PerillafrutescensL.Britt.；

無(wú)水乙醇：分析純，利安隆博華天津醫(yī)藥化學(xué)有限公司；

沒(méi)食子酸對(duì)照品：純度≥99%，天津市光復(fù)精細(xì)化工廠(chǎng)；

蘆丁、木犀草苷：HPLC≥98%，上海源葉生物科技有限公司；

甲醇：色譜純，廣東光華科技有限公司；

黃嘌呤氧化酶：美國(guó)Sigma公司；

黃嘌呤：純度≥95%，美國(guó)Sigma公司；

α-淀粉酶、3,5-二硝基水楊酸試劑(DNS)：西安姚北生物科技有限責(zé)任公司；

胰脂肪酶：上海阿拉丁生化科技有限責(zé)任公司；

對(duì)硝基苯丁酸酯(PNPP)：上海源葉生物科技有限公司；

N,N-二甲基甲酰胺、磷酸鹽緩沖液(PBS)、乙酰膽堿酯酶、5, 5-二硫代-2-硝基苯甲酸(DTNB)、多奈哌齊：美國(guó)Sigma公司。

無(wú)論是從胎兒到成人，從生食到高湯，還是從促進(jìn)消化到潛在地降低鹽、糖攝入所引發(fā)的慢性病……鮮味一直陪伴在你我左右，無(wú)需恐鮮拒鮮。

1.3 分子對(duì)接軟件及數(shù)據(jù)庫(kù)

采用SYBYL-X2.1.1分子模擬軟件(USA)、ChemDraw繪圖軟件；采用TCMSP(https://old.tcmsp-e.com/)、RCSB(https://www.rcsb.org/pdb)和Pubchem(http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)數(shù)據(jù)庫(kù)。

1.4 方法

1.4.1 粗提物的制備 稱(chēng)取紫蘇葉100 g，用60%乙醇回流提取兩次，每次1 h，合并提取液，過(guò)濾，濾液減壓濃縮至無(wú)醇味，置于水浴鍋中濃縮得醇提物浸膏，50 ℃烘干得紫蘇粗提物。

1.4.2 總酚酸含量測(cè)定 采用福林酚法[14]。

1.4.3 總黃酮含量測(cè)定 采用亞硝酸鈉—硝酸鋁—?dú)溲趸c比色法[15]。

1.4.4 木犀草苷含量測(cè)定 采用高效液相法，色譜條件：Agilent 5 HC C18250 mm×4.6 mm，柱溫為室溫，以甲醇—0.1%甲酸水(V甲醇∶V甲酸水為45∶55)為流動(dòng)相，流速1.0 mL/min，波長(zhǎng)360 nm。

1.4.5 體外α-淀粉酶活性抑制試驗(yàn) 參照文獻(xiàn)[16-17]的方法并修改。精密稱(chēng)取1 gα-淀粉酶，用PBS緩沖液配置成0.02 g/mL溶液，待用。精密稱(chēng)1 g可溶性淀粉，先用少量沸水溶解，再定容至100 mL，煮沸至溶液澄清，取上清液備用。并按式(1)計(jì)算α-淀粉酶的抑制率。

(1)

式中：

RI——抑制率，%；

A1——空白組吸光度；

A2——空白對(duì)照組吸光度；

A3——抑制組吸光度；

A4——抑制對(duì)照組吸光度。

1.4.6 體外XOD活性抑制試驗(yàn) 稱(chēng)取30 mg黃嘌呤，加入2 mL氨水超聲溶解，用磷酸鉀緩沖液配制成0.1 mmol/L 的溶液，用時(shí)稀釋至0.01 U/L。取5 U黃嘌呤氧化酶，配制成0.5 U/mL，用時(shí)稀釋至0.1 U/mL，現(xiàn)配現(xiàn)用。以黃嘌呤為底物，通過(guò)酶標(biāo)儀檢測(cè)3種藥材的XOD抑制活性。設(shè)置紫蘇粗提物質(zhì)量濃度分別為0.05，0.10，0.20，0.30，0.40 mg/mL，設(shè)置空白組、空白對(duì)照組、抑制組和抑制對(duì)照組，每組總體積200 μL。將各樣品和50 μL黃嘌呤(0.01 U/L)共孵育5 min。加入50 μL XOD(0.1 U/L)引發(fā)反應(yīng)(XOD需在25 ℃預(yù)孵30 min以穩(wěn)定酶活)，混勻，測(cè)定295 nm處吸光度，按式(1)計(jì)算XOD抑制率，并以別嘌醇片為陽(yáng)性對(duì)照[18]。

1.4.7 胰脂肪酶活性抑制測(cè)定 參照Liang等[19]的方法并修改。稱(chēng)取0.05 g胰脂肪酶用緩沖液溶解定容至50 mL，8 000 r/min離心10 min，取上清液稀釋得胰脂肪酶溶液。稱(chēng)取0.156 g PNPP，溶于0.25 mLN,N-二甲基甲酰胺，緩沖液定容得底物溶液。按式(1)計(jì)算PNPP抑制率。

1.4.8 乙酰膽堿酯酶活性抑制試驗(yàn) 將乙酰膽堿酯酶配置成1.2 mmol/L溶液待用，用時(shí)稀釋10倍。稱(chēng)取ATCH 3.5 mg定容至10 mL。稱(chēng)取24 mg DTNB于10 mL 容量瓶。96孔板中每孔加入PBS 100 μL，乙酰膽堿酯酶(溶于pH 7.5 PBS中)20 μL，樣品溶液20 μL，0.12 mmol/L ATCh 20 μL作為酶反應(yīng)底物。37 ℃培養(yǎng)30 min，加入20 μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的SDS終止反應(yīng)，加入0.6 mmol/L DTNB 20 μL，測(cè)定405 nm處吸光度，按式(2)計(jì)算乙酰膽堿酯酶抑制率，并以多奈哌齊為陽(yáng)性藥。

R=[1-(A樣品-A背景)/A空白]×100%，

(2)

式中：

R——乙酰膽堿酯酶抑制率，%；

A樣品——加入樣品的反應(yīng)體系的吸光度；

A背景——以PBS(pH 7.5)代替酶液的反應(yīng)體系的吸光度；

A空白——以樣品溶劑代替樣品的反應(yīng)體系的吸光度。

1.4.9 分子對(duì)接預(yù)測(cè)作用機(jī)制與靶點(diǎn)

(1) 小分子結(jié)構(gòu)：將化合物3D結(jié)構(gòu)導(dǎo)入SYBYL-X2.1.1中生成表單，再分別放入摩爾區(qū)進(jìn)行能量最小化和加電荷處理，將處理好的結(jié)構(gòu)保存至database數(shù)據(jù)庫(kù)中，以備后續(xù)對(duì)接。

(2) 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)：從RCSB蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中下載胰脂肪酶和α-淀粉酶的靶點(diǎn)蛋白晶體結(jié)構(gòu)，利用SYBYL-X2.0軟件中的Surflex-Dock模塊對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)處理，用于設(shè)定對(duì)接口袋。

(3) Surflex-Dock對(duì)接及評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：Surflex-Dock用于分子對(duì)接，Cscore用于評(píng)價(jià)結(jié)合打分的一致性，配體模式用于對(duì)接小分子化合物到受體的結(jié)合部位，小分子配體與相關(guān)蛋白的親和力打分用于評(píng)價(jià)其結(jié)合力，親和力打分越高，結(jié)合力越強(qiáng)、結(jié)合活性越高。用Total-Score打分函數(shù)對(duì)小分子與靶標(biāo)相互作用進(jìn)行評(píng)分，Total-Score函數(shù)綜合考慮了極性作用、疏水作用、焓和溶劑化等因素，該值愈大，對(duì)接復(fù)合物越穩(wěn)定，小分子化合物與大分子蛋白質(zhì)的匹配結(jié)合作用越好。Total-Score等于8為閾值，8分以上為匹配結(jié)合作用良好。

1.4.10 試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理 使用Origin 8.5軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和作圖，采用SPSS Statistics 23.0軟件計(jì)算IC50值。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品提取率

紫蘇葉醇提取后最終得到干燥品18.59 g，提取率為18.59%。

2.2 總酚酸含量

沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程為y=5.453 0x+0.375 9，R2=0.975 4，吸光度與濃度呈良好的線(xiàn)性關(guān)系。試驗(yàn)測(cè)得紫蘇粗提取物中總酚酸含量為58.59 mg/g。

2.3 總黃酮含量

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程為y=4.821 8x-0.003 8，R2=0.995 5，吸光度與濃度線(xiàn)性關(guān)系良好，試驗(yàn)測(cè)得紫蘇粗提物中黃酮含量為0.309 8 mg/mg。

2.4 木犀草苷含量

木犀草苷標(biāo)品及樣品的色譜圖見(jiàn)圖1，木犀草苷保留時(shí)間為8.236，峰面積為106.9。采用外標(biāo)法測(cè)得樣品中木犀草苷含量為0.819 4 mg/g。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的色譜圖Figure 1 Chromatography of the standards and samples

試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，木犀草苷標(biāo)準(zhǔn)品的進(jìn)樣量與峰面積的積分值的線(xiàn)性方程為Y=19.772X-3.85，R2=0.999 2，當(dāng)木犀草苷質(zhì)量濃度為38～152 mg/mL時(shí)線(xiàn)性關(guān)系良好。精密度試驗(yàn)的RSD為0.36%，表明儀器的精密度良好。重復(fù)性試驗(yàn)的RSD為1.97%，表明該方法重復(fù)性較好。穩(wěn)定性試驗(yàn)的RSD為1.52%，表明供試品溶液在36 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5 紫蘇粗提物對(duì)α-淀粉酶的抑制活性

由圖2可知，紫蘇粗提物對(duì)α-淀粉酶活性抑制作用的IC50值為0.273 mg/mL，表明紫蘇粗提物對(duì)α-淀粉酶活性有一定的抑制作用，即紫蘇中含有的活性成分能夠抑制血糖水平，后續(xù)可對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步研究。

圖2 紫蘇粗提物對(duì)淀粉酶的抑制曲線(xiàn)Figure 2 Amylase inhibition curves of crude extracts of Perilla

2.6 紫蘇粗提物對(duì)黃嘌呤氧化酶的抑制活性

由圖3可知，紫蘇粗提物和別嘌醇對(duì)黃嘌呤氧化酶活性抑制作用的IC50值分別為0.244，0.319 mg/mL。與陽(yáng)性對(duì)照藥別嘌醇相比，紫蘇粗提物對(duì)黃嘌呤氧化酶有一定的抑制活性，說(shuō)明紫蘇中的活性成分可以降低尿酸水平。

圖3 紫蘇粗提物質(zhì)量濃度與XOD酶抑制率的量效關(guān)系Figure 3 The dose-effect relationship between sample concentration and XOD enzyme inhibition rate

2.7 紫蘇粗提物對(duì)胰脂肪酶的抑制活性

由圖4可知，紫蘇粗提物和奧利司他對(duì)胰脂肪酶活性抑制作用的IC50值分別為0.347，0.614 mg/mL。與陽(yáng)性藥奧利司他相比，紫蘇粗提物有較好的抑制胰脂肪酶作用，表明紫蘇粗提物可以降脂、治療肥胖代謝綜合征。

圖4 紫蘇粗提物對(duì)胰脂肪酶的抑制曲線(xiàn)Figure 4 Pancreatic lipase inhibition curves of the crude extracts

2.8 紫蘇粗提物對(duì)乙酰膽堿酯酶的抑制活性

由圖5可知，紫蘇粗提物對(duì)乙酰膽堿酯酶活性抑制作用的IC50值為0.018 mg/mL，說(shuō)明紫蘇粗提物對(duì)乙酰膽堿酯酶有抑制作用，但相對(duì)陽(yáng)性藥多奈哌齊(0.008 mg/mL)較差，需對(duì)粗提物進(jìn)行深入研究。

圖5 紫蘇粗提物對(duì)乙酰膽堿酯酶的抑制曲線(xiàn)Figure 5 Inhibition curve of Perilla on acetylcholinesterase

2.9 分子對(duì)接預(yù)測(cè)紫蘇與胰脂肪酶和淀粉酶抑制作用靶點(diǎn)

將32種化合物與胰脂肪酶蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)中1lpa、1lpb、1n8s 3個(gè)靶標(biāo)蛋白進(jìn)行分子對(duì)接，共分子對(duì)接96次，將32種化合物與α-淀粉酶的一個(gè)靶標(biāo)蛋白5u3a對(duì)接32次，對(duì)接最佳結(jié)果見(jiàn)表1～表3，其中，與1n8s對(duì)接無(wú)化合物打分>8。由表1～表3可知，芹菜素-5-O-β-D-葡萄糖苷、木犀草素-7-二葡萄糖苷酸、芹菜素-7-葡萄糖苷、山奈酚-3-O-蕓香苷、迷迭香酸、蘆丁等為紫蘇粗提物的有效活性成分。

表1 與胰脂肪酶1lpa對(duì)接最佳結(jié)果Table 1 Best results for docking with pancreatic lipase 1lpa

表2 與胰脂肪酶1lpb對(duì)接最佳結(jié)果Table 2 Best results for docking with pancreatic lipase 1lpb

表3 與α-淀粉酶5u3a對(duì)接最佳結(jié)果Table 3 Best results for docking with-amylase 5u3a

3 結(jié)論

探究了紫蘇粗提物對(duì)α-淀粉酶、黃嘌呤氧化酶、胰脂肪酶、乙酰膽堿酯酶的體外抑制活性。結(jié)果表明，紫蘇粗提物對(duì)4種酶均有抑制作用，表明紫蘇粗提物可有效防治以肥胖、高血糖、高尿酸血癥等為主的代謝綜合征。但多靶點(diǎn)體外篩選模型僅為代謝綜合征的治療提供參考，后續(xù)將通過(guò)體內(nèi)整體動(dòng)物試驗(yàn)深入探究紫蘇粗提物的降脂、降糖、降尿酸作用。