張昊楠，高貴珍，劉 健，孟 想

宿州學院 1.環(huán)境與測繪工程學院；2.生物與食品工程學院，安徽宿州，234000；3.新宇藥業(yè)股份有限公司，安徽宿州，234000

隨著制藥行業(yè)的發(fā)展，制藥污泥的處理問題逐漸成為研究的熱點。制藥污泥處理技術(shù)以臭氧化污泥減量、污泥好氧消化與污泥制活性炭為主要研究方向。某制藥企業(yè)以生產(chǎn)鹽酸林可霉素原料藥為主，每年產(chǎn)生約2 000噸的制藥污泥，污泥一般呈現(xiàn)棕黑色且具有淡淡泥土氣味。污泥中含有豐富的蛋白質(zhì)、有機物及礦質(zhì)元素，如果無處理排放，不僅會污染環(huán)境，還會造成資源浪費，因此，制藥污泥的循環(huán)利用具有重要意義。

木霉菌(Trichoderma spp.)是重要的生防真菌，可以通過重寄生在植物根部，減少植物病害并提高產(chǎn)量[1-2]。國內(nèi)對于木霉菌的發(fā)酵大多采用固體發(fā)酵方法，所生產(chǎn)的菌劑可達到足夠數(shù)量的孢子含量，且活性強、易保藏和運輸、所需發(fā)酵設(shè)備簡單，成本低廉[3-4]，固體發(fā)酵原料主要有麥麩、米糠、甘蔗渣和秸稈等[5-7]。據(jù)報道國內(nèi)已有以農(nóng)業(yè)或工業(yè)廢棄物為主要固體培養(yǎng)基質(zhì)發(fā)酵生產(chǎn)木霉生防菌劑。而且我國是一個農(nóng)業(yè)生產(chǎn)大國，玉米、水稻和小麥作為主要的糧食作物，每年大約產(chǎn)8×108t作物秸稈[8]。而玉米秸稈相當于玉米生產(chǎn)的副產(chǎn)品，由于沒有被合理的利用[9]，大部分糧食秸稈都直接在田間堆棄或運輸?shù)街付ǖ慕斩掚姀S焚燒，而焚燒秸稈會引起間接環(huán)境污染與增加二氧化碳排放量，對生態(tài)平衡產(chǎn)生危害[10-11]。

本文研究采用制藥污泥為主要原材料，秸稈作為輔料，進行固體發(fā)酵產(chǎn)哈茨木霉，用單因素試驗考察秸稈加入量、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間與培養(yǎng)基初始含水量對哈茨木霉T-22菌株在污泥培養(yǎng)基上生長及產(chǎn)孢量的影響。結(jié)合響應(yīng)面分析法對哈茨木霉固體發(fā)酵條件進行優(yōu)化研究，旨在解決污泥的存放和處理問題，而且廉價的秸稈也可以當作發(fā)酵輔料，大大降低生產(chǎn)成本，實現(xiàn)廢物的利用再生產(chǎn)，符合國家可持續(xù)發(fā)展戰(zhàn)略要求。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 菌種來源

哈茨木霉T-22菌株，實驗所用菌種是由新宇藥業(yè)股份有限公司環(huán)保研究所提供。

1.1.2 試劑及物料

葡萄糖購于國藥集團化學試劑有限公司；瓊脂購于北京奧博星生物技術(shù)有限責任公司；制藥污泥由新宇藥業(yè)股份有限公司好氧池污泥壓濾制備；秸稈為小麥秸稈粉粹60目過篩；土豆為市場采購。

1.1.3 培養(yǎng)基配制

PDA固體培養(yǎng)基: 土豆200 g，瓊脂20 g，葡萄糖20 g，蒸餾水定容至1 L，pH自然。

含鏈霉素的PDA培養(yǎng)基：土豆200 g，瓊脂20 g，葡萄糖20 g，蒸餾水定容至1 L。在倒平板前，按鏈霉素：PDA培養(yǎng)基=1∶100的比例加入無菌處理的0.01 g/mL的鏈霉素，混勻。

污泥培養(yǎng)基：污泥4 g，秸稈2 g，攪拌均勻，混勻置于培養(yǎng)皿中。

1.1.4 孢子液制備及孢子量測定

將木霉菌接種于PDA平板上30 ℃恒溫靜置培養(yǎng)7天，用無菌的0.05%吐溫-80溶液將從平板上洗下來，制備成木霉菌孢子液，以用于后續(xù)的固態(tài)發(fā)酵。發(fā)酵結(jié)束后，充分拌勻，取5 g固體發(fā)酵物于50 mL無菌水中，制成孢子液，分別梯度稀釋后，各取200 μL稀釋液于含鏈霉素的PDA培養(yǎng)基上涂布均勻，27 ℃恒溫培養(yǎng)3 d，記錄平板上的菌落數(shù)。

1.1.5 實驗儀器

FA2004N電子天平(梅特勒-托利多國際股份有限公司)、DHG-9101-OSA型電熱恒溫鼓風干燥箱(上海三發(fā)科學儀器有限公司)、SHP-250型生化培養(yǎng)箱(上海三發(fā)科學儀器有限公司)、GI100T型高壓蒸汽滅菌鍋(美國致微)、SW-CJ-ID型超凈工作臺(上海三發(fā)科學儀器有限公司)、BM2000型三目生物顯微鏡(南京江南永新光學有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌株T-22在污泥培養(yǎng)基上的生物學特性

菌株形態(tài)研究：將配制好的污泥培養(yǎng)基裝入培養(yǎng)皿中，用封口膜封好置于滅菌鍋內(nèi)，在121 ℃下滅菌30 min，冷卻后接入200 μL孢子液，27 ℃恒溫培養(yǎng)7 d，觀察菌株T-22的菌落形態(tài)特征。

菌絲與孢子形態(tài)研究：取發(fā)酵物少許于載玻片上在顯微鏡下觀察哈茨木霉；另取1 g發(fā)酵物于10 mL無菌水中制成孢子液，于顯微鏡下觀察孢子形態(tài)；利用薄片法(取滅過菌的蓋玻片插在接種過哈茨木霉菌的培養(yǎng)基的中心，于27 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)1 d，待觀察到有菌絲生長到薄片上時，去下薄片)制備菌絲薄片，于顯微鏡下觀察哈茨木霉的菌絲形態(tài)特征。

1.2.2 單因素優(yōu)化設(shè)計

以產(chǎn)孢量為指標，采用單因子法篩選菌株固體發(fā)酵培養(yǎng)基的初始含水量、培養(yǎng)溫度、秸稈加入量等指標，確定最佳培養(yǎng)條件。

(1)初始含水量的影響：分別配置含水量為60%、70%、80%的污泥培養(yǎng)基。取配制好的不同初始含水量的污泥培養(yǎng)基裝入250 mL錐形瓶中，每瓶100 mL，每個處理重復3次編號為A、B、C。用棉花封口，在121 ℃下滅菌30 min，冷卻后接入200 μL孢子液，設(shè)定溫度恒溫培養(yǎng)7 d后，取樣測定孢子量。

(2)培養(yǎng)溫度的影響：培養(yǎng)溫度設(shè)置為25 ℃ 、28 ℃ 、31 ℃三個梯度，每個溫度重復3次編號分別為A、B、C。用棉花封口，在121 ℃下滅菌30 min，冷卻后接入200 μL孢子液，設(shè)定溫度恒溫培養(yǎng)7 d后，取樣測定孢子量。

(3)秸稈加入量的影響：污泥與秸稈加入量配比設(shè)置4∶1、2∶1、4∶3,每個比例重復3次，編號分別為A、B、C。用棉花封口，在121 ℃下滅菌30 min，冷卻后接入200 μL孢子液，設(shè)定溫度恒溫培養(yǎng)7 d后，取樣測定孢子量。

1.2.3 響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計

三因素的確立：參考曾慶才等[12]響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計。根據(jù)單因素實驗和Box-Benhnken設(shè)計原理，采用軟件Design-expert 8.0.6.1進行三因素響應(yīng)面分析實驗，以菌體產(chǎn)孢量為響應(yīng)量，確定兩兩單因素對哈茨木霉菌體生長影響。以X作為菌體產(chǎn)孢量，初始含水量(X1)、秸稈加入量(X2)和溫度(X3)為三因素，因素三水平分別為：-1、 0和1。試驗設(shè)計具體見表1。

表1 發(fā)酵條件Box-Behnken因素水平表

采用Design-expert 8.0.6.1軟件進行響應(yīng)面優(yōu)化分析，根據(jù)Box-Benhnken中心組合原理，設(shè)計實驗方法對培養(yǎng)條件進行優(yōu)化。根據(jù)響應(yīng)面預(yù)測的最佳值進行實驗，測定哈茨木霉菌株T-22的菌體產(chǎn)孢量以驗證響應(yīng)面預(yù)測值的準確性。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株T-22在污泥培養(yǎng)基上的生物學特性

菌株T-22在污泥培養(yǎng)基中長勢良好，污泥為其提供了豐富的養(yǎng)料，在培養(yǎng)7 d后，有大量菌絲變綠。顯微鏡下菌株T-22及其孢子和菌絲的狀態(tài)良好，有明顯可見的分生孢子梗，分生孢子梗上有瓶狀結(jié)構(gòu)，瓶狀結(jié)構(gòu)頂端有球形分生孢子菌絲呈透明狀，上面附有少量孢子(圖1)。

圖1 哈茨木霉形態(tài)特征

2.2 單因素影響實驗

2.2.1 初始含水量的影響

當污泥培養(yǎng)基的初始含水量分別為60%、70%、80%時，28 ℃恒溫培養(yǎng)，觀察菌株T-22的生長狀況及計算發(fā)酵菌體生長量。當初始含水量為60%，培養(yǎng)5 d時，培養(yǎng)基表面可見少量白色菌絲；培養(yǎng)10 d時，培養(yǎng)基表面菌絲仍呈白色，但白色菌絲的量有一定增加。當初始含水量為70%，培養(yǎng)5 d時，培養(yǎng)基表面可見菌絲變綠，僅少量菌絲為白色；培養(yǎng)10 d時，培養(yǎng)基表面可見菌絲變綠。當初始含水量為80%，培養(yǎng)5 d時，培養(yǎng)基表面有少量白色菌絲，部分菌絲變綠；培養(yǎng)10 d時，培養(yǎng)基表面可見大量白色菌絲，菌絲變綠。由菌絲和孢子生長狀態(tài)來看，當污泥培養(yǎng)基初始含水量為70%時，菌株T-22生長得最好。由表2與圖1可見，當培養(yǎng)基初始含水量為70%時，此刻菌株T-22菌體生長量最大，能達到3.67×109cfu/g，而初始含水量不足70%或者超過70%時，T-22菌株的菌體生長量都會減少。

表2 不同含水量下三組T-22菌株的菌體生長量

2.2.2 培養(yǎng)溫度的影響

當污泥培養(yǎng)基的初始含水量為70%時，分別在25 ℃、28 ℃、31 ℃恒溫培養(yǎng)，觀察菌株T-22的生長狀況及計算發(fā)酵菌體生長量。當培養(yǎng)溫度為25 ℃，培養(yǎng)5 d時，培養(yǎng)基表面可見少量白色菌絲；培養(yǎng)10 d時，培養(yǎng)基表面仍有少量白色菌絲，但有部分菌絲變綠。當培養(yǎng)溫度為28 ℃，培養(yǎng)5 d時，培養(yǎng)基表面可見菌絲變綠，僅少量菌絲為白色；培養(yǎng)10 d時，培養(yǎng)基表面可見大量菌絲變綠。當培養(yǎng)溫度為31 ℃，培養(yǎng)5 d時，培養(yǎng)基表面僅有少量白色菌絲，培養(yǎng)10 d時，培養(yǎng)基表面仍是少量白色菌絲。由菌絲和孢子生長狀態(tài)來看，當培養(yǎng)溫度為28 ℃，菌株T-22生長得最好。由表3可見，當溫度為28 ℃時，此刻菌株T-22菌體生長量最大，能達到3.7×109cfu/g。而當溫度不足28 ℃或者大于28 ℃時，T-22菌株的菌體生長量都會減少。而溫度越高菌株T-22的生長狀況越差，菌體生長量越小。

表3 不同溫度下三組T-22菌株的菌體生長量

2.2.3 秸稈加入量的影響

當污泥培養(yǎng)基的初始含水量為70%，加入配制好的10 g、20 g、30 g的秸稈，28 ℃恒溫培養(yǎng)，觀察菌株T-22的生長狀況及計算發(fā)酵菌體生長量。當秸稈加入量為10 g，培養(yǎng)5 d時，培養(yǎng)基表面可見少量白色菌絲；培養(yǎng)10 d時，培養(yǎng)基表面仍有少量白色菌絲，但有部分菌絲變綠。當秸稈加入量為20 g，培養(yǎng)5 d時，培養(yǎng)基表面可見菌絲變綠；培養(yǎng)10 d時，培養(yǎng)基表面可見大量菌絲變綠。當秸稈加入量為30 g，培養(yǎng)5 d時，培養(yǎng)基表面僅有少量白色菌絲，但部分菌絲變綠；培養(yǎng)10 d時，培養(yǎng)基表面菌絲變綠。由菌絲和孢子生長狀態(tài)來看，當秸稈加入量為20 g時，菌株T-22生長得最好。由表4可見，菌株生長量隨秸稈加入量的增加而增加直到秸稈加入量為20 g時，T-22菌株的菌體生長量達到最大為2.5×109cfu/g。當菌體生長量達到最大值后，隨著秸稈加入量的增加，T-22菌株的菌體生長量減少。

表4 秸稈加入量不同三組T-22菌株的菌體生長量

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化

2.3.1 響應(yīng)面法優(yōu)化試驗

根據(jù)單因素結(jié)果，確定Box-Behnken模型較優(yōu)化水平為：含水量為60%～80%，秸稈加入量為10～30 g，培養(yǎng)溫度為25～31 ℃，培養(yǎng)7 d，試驗設(shè)計和菌體生長量見表5。

根據(jù)表5數(shù)據(jù)，通過軟件Design-expert 8.0.6.1處理可得，T-22菌株菌體生長量與單因素變量之間的關(guān)系模型：

X=2.03×109-1.58×108X1+3.84×108X2

回歸方程的方差分析見表6。根據(jù)BBD統(tǒng)計學要求，從不同模型方差分析中的均方及檢驗結(jié)果綜合來看，整體模型為極顯著P<0.01，失擬性分析得P>0.1，失擬性不顯著，因此模型選擇正確且穩(wěn)定，表明方程對實驗擬合情況較好，實驗誤差小。影響因子對菌體生長量影響的貢獻排序為：秸稈加入量>溫度>初始含水量。

表5 Box-Behnken試驗設(shè)計與結(jié)果

表6 回歸方差分析

2.3.2 二次響應(yīng)面回歸模型的建立及方差分析

基于Box-behnken設(shè)計的響應(yīng)面模擬和方差分析得到二次響應(yīng)曲面模型，結(jié)果如圖2所示。在當前試驗范圍內(nèi)，當秸稈加入量和溫度不變，隨著初始含水量的升高，菌體生長量變化不明顯；當秸稈加入量和初始含水量不變，隨著溫度的升高，菌體生長量先增加后減少；當溫度和初始含水量不變，隨著秸稈加入量的增加，菌體生長量先減少后增加。根據(jù)菌體生長量的變化速率顯示，溫度和秸稈加入量對菌體生長量的影響大于初始含水量的影響，并且秸稈加入量對菌體生長量的影響大于溫度的影響，與方差分析結(jié)果一致。

圖2 多因子對菌株T-22菌體生長量影響響應(yīng)曲面

2.3.3 最優(yōu)組合的確定及驗證試驗

為了獲得菌株T-22菌體生長量的最佳發(fā)酵培養(yǎng)條件，對二項回歸方程求偏導可得三元一次方程組：

解方程組可得：X1=58.22，X2=15.66，X3=29.92，即初始含水量為58.22%，秸稈加入量15.66 g，溫度為29.92 ℃時菌株T-22菌體生長量最大，預(yù)測值達到3.27×109cfu/g。為了驗證響應(yīng)面發(fā)優(yōu)化的最佳培養(yǎng)基的可靠性，進行驗證實驗，在此條件下，進行三次重復試驗，測得菌體生長量的平均值為3.17×109cfu/g，與預(yù)測值有較好的擬合性，符合要求。

3 結(jié) 論

本研究利用制藥污泥作為哈茨木霉固體發(fā)酵培養(yǎng)基，并進一步探究哈茨木霉T-22菌株污泥培養(yǎng)基固體發(fā)酵的最適條件。單因素實驗結(jié)果表示，當培養(yǎng)基初始含水量為70%，菌株T-22污泥培養(yǎng)基固體發(fā)酵效果最好，菌體生長量達3.67×109cfu/g；當培養(yǎng)溫度為28 ℃，菌株T-22污泥培養(yǎng)基固體發(fā)酵效果最好，菌體生長量達3.7×109cfu/g；當秸稈加入量為20 g，菌株T-22污泥培養(yǎng)基固體發(fā)酵效果最好，菌體生長量達2.5×109cfu/g。基于Box-behnken設(shè)計的響應(yīng)面模擬和方差分析得到了可達極顯著水平的二次響應(yīng)曲面模型，影響因子對菌體生長量影響的貢獻排序為：秸稈加入量>溫度>初始含水量。哈茨木霉T-22菌株固體發(fā)酵在最適條件培養(yǎng)基的初始含水量58.22%，培養(yǎng)溫度29.92 ℃，秸稈加入量15.66 g，菌體生長量可達3.27×109cfu/g。該研究結(jié)果表明哈茨木霉菌的固態(tài)發(fā)酵參數(shù)初始含水量及最適培養(yǎng)溫度，與王永東等[13]、孫斐等[14]、劉時論等[15]等人的研究結(jié)果相近，且該研究利用制藥污泥固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)哈茨木霉，所產(chǎn)生的菌體量也等同于其他原料生產(chǎn)，原材料成本低，制藥污泥得到有效利用，具有明顯的經(jīng)濟及環(huán)境效益。因此，污泥可以作為哈茨木霉生長的培養(yǎng)基，將藥業(yè)廢棄污泥變廢為寶、減少對環(huán)境的污染，符合國家可持續(xù)發(fā)展戰(zhàn)略要求。