張昊楠，高貴珍，劉 健，孟 想

宿州學院 1.環(huán)境與測繪工程學院；2.生物與食品工程學院，安徽宿州，234000；3.新宇藥業(yè)股份有限公司，安徽宿州，234000

隨著制藥行業(yè)的發(fā)展，制藥污泥的處理問題逐漸成為研究的熱點。制藥污泥處理技術以臭氧化污泥減量、污泥好氧消化與污泥制活性炭為主要研究方向。某制藥企業(yè)以生產鹽酸林可霉素原料藥為主，每年產生約2 000噸的制藥污泥，污泥一般呈現(xiàn)棕黑色且具有淡淡泥土氣味。污泥中含有豐富的蛋白質、有機物及礦質元素，如果無處理排放，不僅會污染環(huán)境，還會造成資源浪費，因此，制藥污泥的循環(huán)利用具有重要意義。

木霉菌(Trichoderma spp.)是重要的生防真菌，可以通過重寄生在植物根部，減少植物病害并提高產量[1-2]。國內對于木霉菌的發(fā)酵大多采用固體發(fā)酵方法，所生產的菌劑可達到足夠數(shù)量的孢子含量，且活性強、易保藏和運輸、所需發(fā)酵設備簡單，成本低廉[3-4]，固體發(fā)酵原料主要有麥麩、米糠、甘蔗渣和秸稈等[5-7]。據(jù)報道國內已有以農業(yè)或工業(yè)廢棄物為主要固體培養(yǎng)基質發(fā)酵生產木霉生防菌劑。而且我國是一個農業(yè)生產大國，玉米、水稻和小麥作為主要的糧食作物，每年大約產8×108t作物秸稈[8]。而玉米秸稈相當于玉米生產的副產品，由于沒有被合理的利用[9]，大部分糧食秸稈都直接在田間堆棄或運輸?shù)街付ǖ慕斩掚姀S焚燒，而焚燒秸稈會引起間接環(huán)境污染與增加二氧化碳排放量，對生態(tài)平衡產生危害[10-11]。

本文研究采用制藥污泥為主要原材料，秸稈作為輔料，進行固體發(fā)酵產哈茨木霉，用單因素試驗考察秸稈加入量、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間與培養(yǎng)基初始含水量對哈茨木霉T-22菌株在污泥培養(yǎng)基上生長及產孢量的影響。結合響應面分析法對哈茨木霉固體發(fā)酵條件進行優(yōu)化研究，旨在解決污泥的存放和處理問題，而且廉價的秸稈也可以當作發(fā)酵輔料，大大降低生產成本，實現(xiàn)廢物的利用再生產，符合國家可持續(xù)發(fā)展戰(zhàn)略要求。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 菌種來源

哈茨木霉T-22菌株，實驗所用菌種是由新宇藥業(yè)股份有限公司環(huán)保研究所提供。

1.1.2 試劑及物料

葡萄糖購于國藥集團化學試劑有限公司；瓊脂購于北京奧博星生物技術有限責任公司；制藥污泥由新宇藥業(yè)股份有限公司好氧池污泥壓濾制備；秸稈為小麥秸稈粉粹60目過篩；土豆為市場采購。

1.1.3 培養(yǎng)基配制

PDA固體培養(yǎng)基: 土豆200 g，瓊脂20 g，葡萄糖20 g，蒸餾水定容至1 L，pH自然。

含鏈霉素的PDA培養(yǎng)基：土豆200 g，瓊脂20 g，葡萄糖20 g，蒸餾水定容至1 L。在倒平板前，按鏈霉素：PDA培養(yǎng)基=1∶100的比例加入無菌處理的0.01 g/mL的鏈霉素，混勻。

污泥培養(yǎng)基：污泥4 g，秸稈2 g，攪拌均勻，混勻置于培養(yǎng)皿中。

1.1.4 孢子液制備及孢子量測定

將木霉菌接種于PDA平板上30 ℃恒溫靜置培養(yǎng)7天，用無菌的0.05%吐溫-80溶液將從平板上洗下來，制備成木霉菌孢子液，以用于后續(xù)的固態(tài)發(fā)酵。發(fā)酵結束后，充分拌勻，取5 g固體發(fā)酵物于50 mL無菌水中，制成孢子液，分別梯度稀釋后，各取200 μL稀釋液于含鏈霉素的PDA培養(yǎng)基上涂布均勻，27 ℃恒溫培養(yǎng)3 d，記錄平板上的菌落數(shù)。

1.1.5 實驗儀器

FA2004N電子天平(梅特勒-托利多國際股份有限公司)、DHG-9101-OSA型電熱恒溫鼓風干燥箱(上海三發(fā)科學儀器有限公司)、SHP-250型生化培養(yǎng)箱(上海三發(fā)科學儀器有限公司)、GI100T型高壓蒸汽滅菌鍋(美國致微)、SW-CJ-ID型超凈工作臺(上海三發(fā)科學儀器有限公司)、BM2000型三目生物顯微鏡(南京江南永新光學有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌株T-22在污泥培養(yǎng)基上的生物學特性

菌株形態(tài)研究：將配制好的污泥培養(yǎng)基裝入培養(yǎng)皿中，用封口膜封好置于滅菌鍋內，在121 ℃下滅菌30 min，冷卻后接入200 μL孢子液，27 ℃恒溫培養(yǎng)7 d，觀察菌株T-22的菌落形態(tài)特征。

菌絲與孢子形態(tài)研究：取發(fā)酵物少許于載玻片上在顯微鏡下觀察哈茨木霉；另取1 g發(fā)酵物于10 mL無菌水中制成孢子液，于顯微鏡下觀察孢子形態(tài)；利用薄片法(取滅過菌的蓋玻片插在接種過哈茨木霉菌的培養(yǎng)基的中心，于27 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)1 d，待觀察到有菌絲生長到薄片上時，去下薄片)制備菌絲薄片，于顯微鏡下觀察哈茨木霉的菌絲形態(tài)特征。

1.2.2 單因素優(yōu)化設計

以產孢量為指標，采用單因子法篩選菌株固體發(fā)酵培養(yǎng)基的初始含水量、培養(yǎng)溫度、秸稈加入量等指標，確定最佳培養(yǎng)條件。

(1)初始含水量的影響：分別配置含水量為60%、70%、80%的污泥培養(yǎng)基。取配制好的不同初始含水量的污泥培養(yǎng)基裝入250 mL錐形瓶中，每瓶100 mL，每個處理重復3次編號為A、B、C。用棉花封口，在121 ℃下滅菌30 min，冷卻后接入200 μL孢子液，設定溫度恒溫培養(yǎng)7 d后，取樣測定孢子量。

(2)培養(yǎng)溫度的影響：培養(yǎng)溫度設置為25 ℃ 、28 ℃ 、31 ℃三個梯度，每個溫度重復3次編號分別為A、B、C。用棉花封口，在121 ℃下滅菌30 min，冷卻后接入200 μL孢子液，設定溫度恒溫培養(yǎng)7 d后，取樣測定孢子量。

(3)秸稈加入量的影響：污泥與秸稈加入量配比設置4∶1、2∶1、4∶3,每個比例重復3次，編號分別為A、B、C。用棉花封口，在121 ℃下滅菌30 min，冷卻后接入200 μL孢子液，設定溫度恒溫培養(yǎng)7 d后，取樣測定孢子量。

1.2.3 響應面優(yōu)化設計

三因素的確立：參考曾慶才等[12]響應面優(yōu)化設計。根據(jù)單因素實驗和Box-Benhnken設計原理，采用軟件Design-expert 8.0.6.1進行三因素響應面分析實驗，以菌體產孢量為響應量，確定兩兩單因素對哈茨木霉菌體生長影響。以X作為菌體產孢量，初始含水量(X1)、秸稈加入量(X2)和溫度(X3)為三因素，因素三水平分別為：-1、 0和1。試驗設計具體見表1。

表1 發(fā)酵條件Box-Behnken因素水平表

采用Design-expert 8.0.6.1軟件進行響應面優(yōu)化分析，根據(jù)Box-Benhnken中心組合原理，設計實驗方法對培養(yǎng)條件進行優(yōu)化。根據(jù)響應面預測的最佳值進行實驗，測定哈茨木霉菌株T-22的菌體產孢量以驗證響應面預測值的準確性。

2 結果與討論

2.1 菌株T-22在污泥培養(yǎng)基上的生物學特性

菌株T-22在污泥培養(yǎng)基中長勢良好，污泥為其提供了豐富的養(yǎng)料，在培養(yǎng)7 d后，有大量菌絲變綠。顯微鏡下菌株T-22及其孢子和菌絲的狀態(tài)良好，有明顯可見的分生孢子梗，分生孢子梗上有瓶狀結構，瓶狀結構頂端有球形分生孢子菌絲呈透明狀，上面附有少量孢子(圖1)。

圖1 哈茨木霉形態(tài)特征

2.2 單因素影響實驗

2.2.1 初始含水量的影響

當污泥培養(yǎng)基的初始含水量分別為60%、70%、80%時，28 ℃恒溫培養(yǎng)，觀察菌株T-22的生長狀況及計算發(fā)酵菌體生長量。當初始含水量為60%，培養(yǎng)5 d時，培養(yǎng)基表面可見少量白色菌絲；培養(yǎng)10 d時，培養(yǎng)基表面菌絲仍呈白色，但白色菌絲的量有一定增加。當初始含水量為70%，培養(yǎng)5 d時，培養(yǎng)基表面可見菌絲變綠，僅少量菌絲為白色；培養(yǎng)10 d時，培養(yǎng)基表面可見菌絲變綠。當初始含水量為80%，培養(yǎng)5 d時，培養(yǎng)基表面有少量白色菌絲，部分菌絲變綠；培養(yǎng)10 d時，培養(yǎng)基表面可見大量白色菌絲，菌絲變綠。由菌絲和孢子生長狀態(tài)來看，當污泥培養(yǎng)基初始含水量為70%時，菌株T-22生長得最好。由表2與圖1可見，當培養(yǎng)基初始含水量為70%時，此刻菌株T-22菌體生長量最大，能達到3.67×109cfu/g，而初始含水量不足70%或者超過70%時，T-22菌株的菌體生長量都會減少。

表2 不同含水量下三組T-22菌株的菌體生長量

2.2.2 培養(yǎng)溫度的影響

當污泥培養(yǎng)基的初始含水量為70%時，分別在25 ℃、28 ℃、31 ℃恒溫培養(yǎng)，觀察菌株T-22的生長狀況及計算發(fā)酵菌體生長量。當培養(yǎng)溫度為25 ℃，培養(yǎng)5 d時，培養(yǎng)基表面可見少量白色菌絲；培養(yǎng)10 d時，培養(yǎng)基表面仍有少量白色菌絲，但有部分菌絲變綠。當培養(yǎng)溫度為28 ℃，培養(yǎng)5 d時，培養(yǎng)基表面可見菌絲變綠，僅少量菌絲為白色；培養(yǎng)10 d時，培養(yǎng)基表面可見大量菌絲變綠。當培養(yǎng)溫度為31 ℃，培養(yǎng)5 d時，培養(yǎng)基表面僅有少量白色菌絲，培養(yǎng)10 d時，培養(yǎng)基表面仍是少量白色菌絲。由菌絲和孢子生長狀態(tài)來看，當培養(yǎng)溫度為28 ℃，菌株T-22生長得最好。由表3可見，當溫度為28 ℃時，此刻菌株T-22菌體生長量最大，能達到3.7×109cfu/g。而當溫度不足28 ℃或者大于28 ℃時，T-22菌株的菌體生長量都會減少。而溫度越高菌株T-22的生長狀況越差，菌體生長量越小。

表3 不同溫度下三組T-22菌株的菌體生長量

2.2.3 秸稈加入量的影響

當污泥培養(yǎng)基的初始含水量為70%，加入配制好的10 g、20 g、30 g的秸稈，28 ℃恒溫培養(yǎng)，觀察菌株T-22的生長狀況及計算發(fā)酵菌體生長量。當秸稈加入量為10 g，培養(yǎng)5 d時，培養(yǎng)基表面可見少量白色菌絲；培養(yǎng)10 d時，培養(yǎng)基表面仍有少量白色菌絲，但有部分菌絲變綠。當秸稈加入量為20 g，培養(yǎng)5 d時，培養(yǎng)基表面可見菌絲變綠；培養(yǎng)10 d時，培養(yǎng)基表面可見大量菌絲變綠。當秸稈加入量為30 g，培養(yǎng)5 d時，培養(yǎng)基表面僅有少量白色菌絲，但部分菌絲變綠；培養(yǎng)10 d時，培養(yǎng)基表面菌絲變綠。由菌絲和孢子生長狀態(tài)來看，當秸稈加入量為20 g時，菌株T-22生長得最好。由表4可見，菌株生長量隨秸稈加入量的增加而增加直到秸稈加入量為20 g時，T-22菌株的菌體生長量達到最大為2.5×109cfu/g。當菌體生長量達到最大值后，隨著秸稈加入量的增加，T-22菌株的菌體生長量減少。

表4 秸稈加入量不同三組T-22菌株的菌體生長量

2.3 響應面優(yōu)化

2.3.1 響應面法優(yōu)化試驗

根據(jù)單因素結果，確定Box-Behnken模型較優(yōu)化水平為：含水量為60%～80%，秸稈加入量為10～30 g，培養(yǎng)溫度為25～31 ℃，培養(yǎng)7 d，試驗設計和菌體生長量見表5。

根據(jù)表5數(shù)據(jù)，通過軟件Design-expert 8.0.6.1處理可得，T-22菌株菌體生長量與單因素變量之間的關系模型：

X=2.03×109-1.58×108X1+3.84×108X2

回歸方程的方差分析見表6。根據(jù)BBD統(tǒng)計學要求，從不同模型方差分析中的均方及檢驗結果綜合來看，整體模型為極顯著P<0.01，失擬性分析得P>0.1，失擬性不顯著，因此模型選擇正確且穩(wěn)定，表明方程對實驗擬合情況較好，實驗誤差小。影響因子對菌體生長量影響的貢獻排序為：秸稈加入量>溫度>初始含水量。

表5 Box-Behnken試驗設計與結果

表6 回歸方差分析

2.3.2 二次響應面回歸模型的建立及方差分析

基于Box-behnken設計的響應面模擬和方差分析得到二次響應曲面模型，結果如圖2所示。在當前試驗范圍內，當秸稈加入量和溫度不變，隨著初始含水量的升高，菌體生長量變化不明顯；當秸稈加入量和初始含水量不變，隨著溫度的升高，菌體生長量先增加后減少；當溫度和初始含水量不變，隨著秸稈加入量的增加，菌體生長量先減少后增加。根據(jù)菌體生長量的變化速率顯示，溫度和秸稈加入量對菌體生長量的影響大于初始含水量的影響，并且秸稈加入量對菌體生長量的影響大于溫度的影響，與方差分析結果一致。

圖2 多因子對菌株T-22菌體生長量影響響應曲面

2.3.3 最優(yōu)組合的確定及驗證試驗

為了獲得菌株T-22菌體生長量的最佳發(fā)酵培養(yǎng)條件，對二項回歸方程求偏導可得三元一次方程組：

解方程組可得：X1=58.22，X2=15.66，X3=29.92，即初始含水量為58.22%，秸稈加入量15.66 g，溫度為29.92 ℃時菌株T-22菌體生長量最大，預測值達到3.27×109cfu/g。為了驗證響應面發(fā)優(yōu)化的最佳培養(yǎng)基的可靠性，進行驗證實驗，在此條件下，進行三次重復試驗，測得菌體生長量的平均值為3.17×109cfu/g，與預測值有較好的擬合性，符合要求。

3 結 論

本研究利用制藥污泥作為哈茨木霉固體發(fā)酵培養(yǎng)基，并進一步探究哈茨木霉T-22菌株污泥培養(yǎng)基固體發(fā)酵的最適條件。單因素實驗結果表示，當培養(yǎng)基初始含水量為70%，菌株T-22污泥培養(yǎng)基固體發(fā)酵效果最好，菌體生長量達3.67×109cfu/g；當培養(yǎng)溫度為28 ℃，菌株T-22污泥培養(yǎng)基固體發(fā)酵效果最好，菌體生長量達3.7×109cfu/g；當秸稈加入量為20 g，菌株T-22污泥培養(yǎng)基固體發(fā)酵效果最好，菌體生長量達2.5×109cfu/g。基于Box-behnken設計的響應面模擬和方差分析得到了可達極顯著水平的二次響應曲面模型，影響因子對菌體生長量影響的貢獻排序為：秸稈加入量>溫度>初始含水量。哈茨木霉T-22菌株固體發(fā)酵在最適條件培養(yǎng)基的初始含水量58.22%，培養(yǎng)溫度29.92 ℃，秸稈加入量15.66 g，菌體生長量可達3.27×109cfu/g。該研究結果表明哈茨木霉菌的固態(tài)發(fā)酵參數(shù)初始含水量及最適培養(yǎng)溫度，與王永東等[13]、孫斐等[14]、劉時論等[15]等人的研究結果相近，且該研究利用制藥污泥固態(tài)發(fā)酵產哈茨木霉，所產生的菌體量也等同于其他原料生產，原材料成本低，制藥污泥得到有效利用，具有明顯的經濟及環(huán)境效益。因此，污泥可以作為哈茨木霉生長的培養(yǎng)基，將藥業(yè)廢棄污泥變廢為寶、減少對環(huán)境的污染，符合國家可持續(xù)發(fā)展戰(zhàn)略要求。