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        針刺激活軸抑制蛋白1、腺苷酸活化蛋白激酶、絲/蘇氨酸蛋白激酶信號(hào)通路對失神經(jīng)骨骼肌萎縮大鼠的保護(hù)作用

        2022-04-29 08:00:58劉祥華羅湘筠李文倩
        安徽醫(yī)藥 2022年5期
        關(guān)鍵詞:腓腸肌骨骼肌電針

        劉祥華,羅湘筠,李文倩

        失神經(jīng)骨骼肌萎縮是周圍神經(jīng)損傷后,骨骼肌失去神經(jīng)支配與營養(yǎng),發(fā)生的一系列形態(tài)學(xué)和功能變化,臨床常發(fā)生于工傷事故傷、車禍傷等[1]。目前,失神經(jīng)骨骼肌萎縮主要采用電刺激、藥物、外科手術(shù)等來治療,可以在一定程度上修復(fù)損傷神經(jīng),但仍有部分病人的療效有待提高[2]。建立大鼠的失神經(jīng)骨骼肌萎縮模型,探討更有效的治療手段,對失神經(jīng)骨骼肌萎縮的防治具有重要意義。針灸是傳統(tǒng)中醫(yī)的重要組成部分,主要通過捻轉(zhuǎn)與提插等針刺手法刺激特定部位來治療疾病,近年來受到了研究者們的廣泛關(guān)注[3]。已有研究顯示[4],針灸可以促進(jìn)周圍神經(jīng)損傷后的修復(fù),對于失神經(jīng)肌肉萎縮具有良好的臨床療效,可以改善大鼠的肌肉萎縮狀態(tài),但其作用機(jī)制尚有待進(jìn)一步探討?;诖?,本研究于2019 年5—6 月建立了大鼠失神經(jīng)骨骼肌萎縮模型,旨在分析針刺治療失神經(jīng)骨骼肌萎縮的作用機(jī)制,為臨床針刺在失神經(jīng)骨骼肌萎縮中的治療提供科學(xué)依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 儀器、試劑與動(dòng)物熒光顯微鏡購自日本Olympus 公司;戊巴比妥鈉購自美國Sigma-Aldrich公司;TUNEL 檢測試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司;兔抗鼠絲/蘇氨酸蛋白激酶(AKT)、腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)、軸蛋白1(Axin1)、磷酸化的絲/蘇氨酸蛋白激酶(p-AKT)、磷酸化的腺苷酸活化蛋白激酶(p-AMPK)、B 細(xì)胞淋巴瘤2(Bcl-2)、Bcl 相關(guān)X 蛋白(Bax)、活化胱天蛋白酶(cleaved caspase-3)和增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)單克隆抗體均購于美國Santa Cruz 公司;辣根過氧化酶標(biāo)記的羊抗兔免疫球蛋白(IgG),購于上海信裕生物科技有限公司。

        SD 雄性大鼠48 只,SPF 級(jí),體質(zhì)量范圍200~220 g,購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司,動(dòng)物許可證號(hào):SCXK(京)2015-0001。所有大鼠均飼養(yǎng)于本院動(dòng)物中心實(shí)驗(yàn)室,維持室內(nèi)溫度在25 ℃左右,模擬晝夜光照環(huán)境,大鼠可自由攝食和飲水。

        1.2 動(dòng)物造模及干預(yù) 48 只大鼠經(jīng)過預(yù)飼養(yǎng)7 d后,采用簡單隨機(jī)分組將其分為空白對照組(n=12)、假手術(shù)組(n=12)、模型組(n=12)和針刺組(n=12)。模型組和針刺組采用手術(shù)切斷坐骨神經(jīng)法制備失神經(jīng)骨骼肌萎縮大鼠模型[5],首先常規(guī)麻醉大鼠,局部消毒,在大鼠的右后肢股后外側(cè)行一切口,鈍性分離、暴露坐骨神經(jīng),于中段切斷,造成1.0 mm神經(jīng)缺損;假手術(shù)組只暴露坐骨神經(jīng),不切斷;空白對照組不做任何處理,造模過程中共死亡1只大鼠。造模后第2 天,針刺組大鼠采用針刺干預(yù),參考《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[6]給予電針治療,取術(shù)側(cè)“足三里”和“承山”穴,以0.5 寸的毫針垂直刺入,針刺深度為5~7 mm,接入韓氏電針穴位刺激儀,頻率為5 Hz,電流強(qiáng)度為1.5 mA,每天1 次,持續(xù)電針刺激10 min,連續(xù)治療3周。術(shù)后觀察大鼠的行為狀態(tài)。

        1.3 各組大鼠緋腸肌的濕重比術(shù)后3 周迅速處死大鼠,取大鼠雙側(cè)緋腸肌,生理鹽水沖洗,置于-80 ℃超低溫冰箱暫存。取術(shù)側(cè)緋腸肌觀察肌肉萎縮情況,對雙側(cè)緋腸肌稱重,計(jì)算緋腸肌組織的濕重比,隨后將其分成兩份,一份置于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的多聚甲醛溶液中固定,用于病理檢測,另一份直接凍存于-80 ℃冰箱,用于蛋白檢測。

        1.4 HE 染色和TUNEL 染色檢測大鼠的緋腸肌組織病理變化取在4%多聚甲醛溶液中固定的緋腸肌組織,進(jìn)行常規(guī)制作切片,隨后將其分成兩份,分別進(jìn)行HE 染色和TUNEL 染色,在光學(xué)顯微鏡下觀察緋腸肌組織的病理變化和凋亡情況。HE 染色切片使用Olympus Cell Sens Standard 1.6圖像采集系統(tǒng)隨機(jī)測量在分析肌纖維直徑和橫截面積,計(jì)算患側(cè)肌纖維橫截面積比和肌纖維直徑比。TUNEL 染色切片采用Image J分析圖像,每張采用隨機(jī)數(shù)字表法選取10 個(gè)視野,計(jì)算陽性細(xì)胞數(shù)與總細(xì)胞數(shù),計(jì)算細(xì)胞的凋亡率。

        1.5 蛋白質(zhì)印跡法(Western blotting)檢測各組大鼠緋腸肌細(xì)胞AKT、AMPK、Axin1、Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3和PCNA的表達(dá)取凍存于-80 ℃冰箱的大鼠緋腸肌組織,勻漿,嚴(yán)格按照蛋白裂解步驟提取勻漿組織中的總蛋白,經(jīng)采用二喹啉甲酸蛋白定量分析試劑盒確定蛋白濃度。取50μg總蛋白依次經(jīng)過電泳、轉(zhuǎn)PVDF 膜,加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的脫脂牛奶,在室溫環(huán)境下封閉2 h,隨后洗膜,加一抗AKT、AMPK、Axin1、Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3 和PCNA,在溫度為4 ℃環(huán)境下孵育過夜,洗膜,加入二抗,在室溫下環(huán)境下孵育2 h。再用電化學(xué)發(fā)光顯示圖像,以β-actin 為內(nèi)參,經(jīng)凝膠成像分析系統(tǒng)分析各蛋白的相對表達(dá)量。

        1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 17.0 軟件分析所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),以±s形式表示,多組間差異采用單因素方差分析,兩兩組間的差異采用SNK 法分析,以P<0.05表示組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1 各組大鼠一般行為學(xué)空白對照組和假手術(shù)組大鼠行為無明顯異常,針刺術(shù)側(cè)皮膚有反應(yīng);模型組大鼠術(shù)側(cè)肢拖地,針刺術(shù)側(cè)皮膚無反應(yīng),大部分大鼠足部皮膚出現(xiàn)潰爛;針刺組大鼠術(shù)側(cè)肢拖地,針刺術(shù)側(cè)皮膚有輕微反應(yīng),少部分大鼠足部皮膚出現(xiàn)潰爛。

        2.2 各組大鼠的腓腸肌組織病理損傷 HE 染色結(jié)果顯示,空白對照組和假手術(shù)組大鼠的腓腸肌肌肉組織排列規(guī)則,未見異常;模型組大鼠的腓腸肌細(xì)胞排列松散,細(xì)胞間隙變寬,肌纖維橫截面積縮小;針刺組大鼠腓腸肌細(xì)胞排列較整齊,肌纖維橫截面積明顯改善。見圖1。

        2.3 針刺對失神經(jīng)骨骼肌萎縮大鼠腓腸肌組織形態(tài)的影響模型組大鼠腓腸肌濕重比、肌纖維截面積比和肌纖維直徑比均明顯低于空白對照組和假手術(shù)組(P<0.05);針刺組大鼠腓腸肌濕重比、肌纖維截面積比和肌纖維直徑比均明顯高于模型組(P<0.05)。見表1。

        表1 針刺對失神經(jīng)骨骼肌萎縮大鼠腓腸肌組織形態(tài)的影響/±s

        注:①與空白對照組比,P<0.05。②與假手術(shù)組比,P<0.05。③與模型組比,P<0.05。

        組別空白對照組假手術(shù)組模型組針刺組F值P值鼠數(shù)12 12 11 12濕重比1.00±0.03 0.99±0.04 0.38±0.06①②0.52±0.07①②③434.97<0.001肌纖維截面積比1.00±0.05 0.98±0.14 0.52±0.12①②0.64±0.11①②③56.05<0.001肌纖維直徑比1.00±0.07 0.97±0.13 0.53±0.16①②0.66±0.15①②③35.92<0.001

        2.4 針刺對失神經(jīng)骨骼肌萎縮大鼠腓腸肌細(xì)胞凋亡的影響模型組大鼠腓腸肌細(xì)胞凋亡率(30.85±5.74)%明顯高于空白對照組(5.21±0.51)%和假手術(shù)組(5.37±0.53)%(P<0.05);針刺組大鼠細(xì)胞凋亡率(21.39±3.87)% 明顯低于模型組(P<0.05)。見圖2。

        2.5 針刺對失神經(jīng)骨骼肌萎縮大鼠腓腸肌增殖和凋亡相關(guān)蛋白的影響模型組大鼠腓腸肌組織Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3 和PCNA 的表達(dá)明顯高于空白對照組和假手術(shù)組(P<0.05);針刺組大鼠腓腸肌組織Bcl-2 和PCNA 的表達(dá)明顯高于模型組(P<0.05),Bax 和cleaved caspase-3 的表達(dá)明顯低于模型組(P<0.05)。見圖3、表2。

        圖3 各組大鼠腓腸肌細(xì)胞增殖和凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)

        表2 各組大鼠腓腸肌細(xì)胞增殖和凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)/±s

        表2 各組大鼠腓腸肌細(xì)胞增殖和凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)/±s

        注:Bcl-2為B細(xì)胞淋巴瘤2,Bax為Bcl相關(guān)X蛋白,cleaved caspase-3為活化胱天蛋白酶,PCNA為增殖細(xì)胞核抗原。①與空白對照組比,P<0.05。②與假手術(shù)組比,P<0.05。③與模型組比,P<0.05。

        組別空白對照組假手術(shù)組模型組針刺組F值P值鼠數(shù)12 12 11 12 Bcl-2 0.27±0.02 0.29±0.02 0.40±0.03①②0.61±0.05①②③276.68<0.001 Bax 0.23±0.02 0.24±0.02 0.53±0.05①②0.33±0.04①②③183.23<0.001 cleaved caspase-3 0.25±0.03 0.26±0.03 0.58±0.06①②0.34±0.04①②③156.21<0.001 PCNA 0.25±0.03 0.25±0.03 0.44±0.05①②0.72±0.08①②③241.04<0.001

        2.6 針刺對失神經(jīng)骨骼肌萎縮大鼠腓腸肌AKT、AMPK、Axin1 蛋白表達(dá)的影響模型組大鼠腓腸肌組織p-AKT/AKT、p-AMPK/AMPK、Axin1 的表達(dá)明顯高于空白對照組和假手術(shù)組(P<0.05);針刺組大鼠腓腸肌組織p-AKT/AKT、Axin1 的表達(dá)明顯高于模型組(P<0.05),p-AMPK/ AMPK 的表達(dá)明顯低于模型組(P<0.05)。見圖4、表3。

        圖4 各組大鼠腓腸肌細(xì)胞AKT、AMPK、Axin1 蛋白表達(dá)的影響

        表3 各組大鼠腓腸肌細(xì)胞絲/蘇氨酸蛋白激酶(AKT)、腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)、軸蛋白1(Axin1)蛋白表達(dá)的影響/±s

        表3 各組大鼠腓腸肌細(xì)胞絲/蘇氨酸蛋白激酶(AKT)、腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)、軸蛋白1(Axin1)蛋白表達(dá)的影響/±s

        注:①與空白對照組比,P<0.05。②與假手術(shù)組比,P<0.05。③與模型組比,P<0.05。

        組別空白對照組假手術(shù)組模型組針刺組F值P值鼠數(shù)12 12 11 12 p-AKT/AKT 0.35±0.04 0.37±0.04 0.54±0.06①②0.82±0.09①②③152.11<0.001 p-AMPK/AMPK 0.34±0.03 0.35±0.02 0.73±0.04①②0.51±0.03①②③405.02<0.001 Axin1 0.26±0.03 0.27±0.03 0.41±0.05①②0.62±0.06①②③172.34<0.001

        3 討論

        失神經(jīng)骨骼肌萎縮在中醫(yī)屬“痿癥”范疇,主要表現(xiàn)為筋骨痿軟、皮膚麻木等,主要病機(jī)為氣血虧虛、血脈瘀滯[7]。針灸是我國中醫(yī)的重要組成部分之一,《黃帝內(nèi)經(jīng)》指出“治痿獨(dú)取陽明”,“足三里”具有理氣和血、舒筋活絡(luò)的功能,和“承山”均為治療下肢瘓癥之要穴,兩穴配合可以改善下肢局部的微循環(huán),抑制肌肉萎縮[8]。因此,本研究取“足三里”和“承山”,分析電針對失神經(jīng)骨骼肌萎縮大鼠的作用機(jī)制。本研究中,電針治療可以有效增加失坐骨神經(jīng)大鼠腓腸肌的濕重、肌纖維的直徑和面積。腓腸肌是坐骨神經(jīng)的靶器官,坐骨神經(jīng)損傷后,腓腸肌會(huì)失去神經(jīng)支配,從而出現(xiàn)肌纖維不可逆地萎縮、變形[9]。陳玄等[10]的研究顯示,電針治療可以增加失神經(jīng)骨骼肌萎縮大鼠的濕重,與本研究結(jié)果基本一致,證實(shí)電針治療可以延緩失神經(jīng)大鼠骨骼肌的萎縮。

        臨床研究顯示,肌肉萎縮主要是由于細(xì)胞凋亡和增殖之間的平衡被打破后,引起的肌細(xì)胞數(shù)量減少和殘存的肌細(xì)胞體積減小[11]。本研究中,電針治療可以抑制失坐骨神經(jīng)大鼠腓腸肌的凋亡,促進(jìn)組織細(xì)胞中Bcl-2 和PCNA 蛋白表達(dá),降低Bax 和cleaved caspase-3 蛋白表達(dá)。Bcl-2/Bax 是一組調(diào)控組織細(xì)胞凋亡的蛋白,主要通過調(diào)節(jié)線粒體膜的通透性,釋放細(xì)胞色素C進(jìn)入胞質(zhì),激活凋亡執(zhí)行蛋白Caspase-3,從而降解細(xì)胞內(nèi)的重要蛋白,誘導(dǎo)組織細(xì)胞凋亡[12]。吳珍元等[13]的研究顯示,細(xì)胞凋亡在大鼠失神經(jīng)骨骼肌萎縮的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用,抑制骨骼肌細(xì)胞的凋亡對于延緩骨骼肌萎縮具有重要意義,提示電針治療可能通過抑制失坐骨神經(jīng)大鼠骨骼肌細(xì)胞的凋亡,延緩骨骼肌萎縮。PCNA 是一種細(xì)胞增殖核抗原,是真核細(xì)胞DNA 合成所必需的一種核蛋白,可以反映肌衛(wèi)星細(xì)胞的增殖活性[14]。吳夢佳等[15]的研究顯示,針刺治療可以調(diào)節(jié)肌衛(wèi)星細(xì)胞的增殖分化和凋亡,防治骨骼肌萎縮,本研究結(jié)果與其類似。結(jié)合本研究結(jié)果表明,電針治療可能通過促進(jìn)肌衛(wèi)星細(xì)胞的增殖,抑制其凋亡,延緩失神經(jīng)大鼠骨骼肌的萎縮。

        本研究中,電針治療可以上調(diào)Axin1 和p-AKT的表達(dá),下調(diào)AMPK 的磷酸化。AMPK 是AMP 依賴的蛋白激酶,也是骨骼肌細(xì)胞的能量感受器,是機(jī)體能量代謝調(diào)節(jié)的關(guān)鍵因子[16]。研究顯示,AMPK被激活后可以降低Akt 的磷酸化水平,降解骨骼肌蛋白質(zhì),參與能量代謝[17]。AKT 是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶,又稱蛋白激酶B,參與了而機(jī)體多條關(guān)鍵信號(hào)通路,在細(xì)胞的存活和凋亡中具有重要作用[18]。Axin蛋白在生物體內(nèi)普遍表達(dá),包括Axin l和Axin 2兩個(gè)亞型,參與了機(jī)體多種信號(hào)通路,是Wnt/βcatenin、p53 等信號(hào)通路的關(guān)鍵蛋白,可以參與調(diào)節(jié)肌衛(wèi)星細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等過程[19]。Zhang等[20]的研究顯示,Axin 1 可能通過與AMPK 發(fā)生免疫共沉淀,形成復(fù)合物,抑制AMPK 的活化,從而激活肌管細(xì)胞中的AKT。AKT 的磷酸化可以參與機(jī)體多種信號(hào)通路,抑制肌蛋白降解,促進(jìn)蛋白合成,促進(jìn)生肌細(xì)胞分化,抑制肌肉萎縮[21-22]。高睿琦等[22]的研究顯示,電針可以上調(diào)失神經(jīng)大鼠AKT 的磷酸化,改善骨骼肌萎縮,與研究結(jié)果基本相符,提示電針治療可能通過上調(diào)Axin1 的表達(dá),與AMPK形成復(fù)合物,從而抑制AKT 的磷酸化,促進(jìn)肌細(xì)胞的分化,抑制肌蛋白的降解。

        綜上所述,電針治療可能通過上調(diào)Axin1 的表達(dá),抑制AMPK 的磷酸化,激活A(yù)KT 的磷酸化,促進(jìn)骨骼肌的增殖、分化,抑制其凋亡,延緩失神經(jīng)大鼠骨骼肌的萎縮,為臨床治療提供了一定的理論依據(jù)。但Axin1/AMPK/AKT 參與了機(jī)體多種生物學(xué)過程,電針治療作用于失神經(jīng)骨骼肌萎縮大鼠的關(guān)鍵靶位點(diǎn)尚需進(jìn)一步探索驗(yàn)證。

        (本文圖1,2見插圖5-1)

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