劉祥華，羅湘筠，李文倩

失神經(jīng)骨骼肌萎縮是周圍神經(jīng)損傷后，骨骼肌失去神經(jīng)支配與營(yíng)養(yǎng)，發(fā)生的一系列形態(tài)學(xué)和功能變化，臨床常發(fā)生于工傷事故傷、車禍傷等［1］。目前，失神經(jīng)骨骼肌萎縮主要采用電刺激、藥物、外科手術(shù)等來治療，可以在一定程度上修復(fù)損傷神經(jīng)，但仍有部分病人的療效有待提高［2］。建立大鼠的失神經(jīng)骨骼肌萎縮模型，探討更有效的治療手段，對(duì)失神經(jīng)骨骼肌萎縮的防治具有重要意義。針灸是傳統(tǒng)中醫(yī)的重要組成部分，主要通過捻轉(zhuǎn)與提插等針刺手法刺激特定部位來治療疾病，近年來受到了研究者們的廣泛關(guān)注［3］。已有研究顯示［4］，針灸可以促進(jìn)周圍神經(jīng)損傷后的修復(fù)，對(duì)于失神經(jīng)肌肉萎縮具有良好的臨床療效，可以改善大鼠的肌肉萎縮狀態(tài)，但其作用機(jī)制尚有待進(jìn)一步探討。基于此，本研究于2019 年5—6 月建立了大鼠失神經(jīng)骨骼肌萎縮模型，旨在分析針刺治療失神經(jīng)骨骼肌萎縮的作用機(jī)制，為臨床針刺在失神經(jīng)骨骼肌萎縮中的治療提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器、試劑與動(dòng)物熒光顯微鏡購(gòu)自日本Olympus 公司；戊巴比妥鈉購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司；TUNEL 檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；兔抗鼠絲/蘇氨酸蛋白激酶（AKT）、腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）、軸蛋白1（Axin1）、磷酸化的絲/蘇氨酸蛋白激酶（p-AKT）、磷酸化的腺苷酸活化蛋白激酶（p-AMPK）、B 細(xì)胞淋巴瘤2（Bcl-2）、Bcl 相關(guān)X 蛋白（Bax）、活化胱天蛋白酶（cleaved caspase-3）和增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）單克隆抗體均購(gòu)于美國(guó)Santa Cruz 公司；辣根過氧化酶標(biāo)記的羊抗兔免疫球蛋白（IgG），購(gòu)于上海信裕生物科技有限公司。

SD 雄性大鼠48 只，SPF 級(jí)，體質(zhì)量范圍200～220 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（京）2015-0001。所有大鼠均飼養(yǎng)于本院動(dòng)物中心實(shí)驗(yàn)室，維持室內(nèi)溫度在25 ℃左右，模擬晝夜光照環(huán)境，大鼠可自由攝食和飲水。

1.2 動(dòng)物造模及干預(yù) 48 只大鼠經(jīng)過預(yù)飼養(yǎng)7 d后，采用簡(jiǎn)單隨機(jī)分組將其分為空白對(duì)照組（n=12）、假手術(shù)組（n=12）、模型組（n=12）和針刺組（n=12）。模型組和針刺組采用手術(shù)切斷坐骨神經(jīng)法制備失神經(jīng)骨骼肌萎縮大鼠模型［5］，首先常規(guī)麻醉大鼠，局部消毒，在大鼠的右后肢股后外側(cè)行一切口，鈍性分離、暴露坐骨神經(jīng)，于中段切斷，造成1.0 mm神經(jīng)缺損；假手術(shù)組只暴露坐骨神經(jīng)，不切斷；空白對(duì)照組不做任何處理，造模過程中共死亡1只大鼠。造模后第2 天，針刺組大鼠采用針刺干預(yù)，參考《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》［6］給予電針治療，取術(shù)側(cè)“足三里”和“承山”穴，以0.5 寸的毫針垂直刺入，針刺深度為5～7 mm，接入韓氏電針穴位刺激儀，頻率為5 Hz，電流強(qiáng)度為1.5 mA，每天1 次，持續(xù)電針刺激10 min，連續(xù)治療3周。術(shù)后觀察大鼠的行為狀態(tài)。

1.3 各組大鼠緋腸肌的濕重比術(shù)后3 周迅速處死大鼠，取大鼠雙側(cè)緋腸肌，生理鹽水沖洗，置于-80 ℃超低溫冰箱暫存。取術(shù)側(cè)緋腸肌觀察肌肉萎縮情況，對(duì)雙側(cè)緋腸肌稱重，計(jì)算緋腸肌組織的濕重比，隨后將其分成兩份，一份置于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的多聚甲醛溶液中固定，用于病理檢測(cè)，另一份直接凍存于-80 ℃冰箱，用于蛋白檢測(cè)。

1.4 HE 染色和TUNEL 染色檢測(cè)大鼠的緋腸肌組織病理變化取在4%多聚甲醛溶液中固定的緋腸肌組織，進(jìn)行常規(guī)制作切片，隨后將其分成兩份，分別進(jìn)行HE 染色和TUNEL 染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察緋腸肌組織的病理變化和凋亡情況。HE 染色切片使用Olympus Cell Sens Standard 1.6圖像采集系統(tǒng)隨機(jī)測(cè)量在分析肌纖維直徑和橫截面積，計(jì)算患側(cè)肌纖維橫截面積比和肌纖維直徑比。TUNEL 染色切片采用Image J分析圖像，每張采用隨機(jī)數(shù)字表法選取10 個(gè)視野，計(jì)算陽性細(xì)胞數(shù)與總細(xì)胞數(shù)，計(jì)算細(xì)胞的凋亡率。

1.5 蛋白質(zhì)印跡法（Western blotting）檢測(cè)各組大鼠緋腸肌細(xì)胞AKT、AMPK、Axin1、Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3和PCNA的表達(dá)取凍存于-80 ℃冰箱的大鼠緋腸肌組織，勻漿，嚴(yán)格按照蛋白裂解步驟提取勻漿組織中的總蛋白，經(jīng)采用二喹啉甲酸蛋白定量分析試劑盒確定蛋白濃度。取50μg總蛋白依次經(jīng)過電泳、轉(zhuǎn)PVDF 膜，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的脫脂牛奶，在室溫環(huán)境下封閉2 h，隨后洗膜，加一抗AKT、AMPK、Axin1、Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3 和PCNA，在溫度為4 ℃環(huán)境下孵育過夜，洗膜，加入二抗，在室溫下環(huán)境下孵育2 h。再用電化學(xué)發(fā)光顯示圖像，以β-actin 為內(nèi)參，經(jīng)凝膠成像分析系統(tǒng)分析各蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 17.0 軟件分析所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，以±s形式表示，多組間差異采用單因素方差分析，兩兩組間的差異采用SNK 法分析，以P＜0.05表示組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠一般行為學(xué)空白對(duì)照組和假手術(shù)組大鼠行為無明顯異常，針刺術(shù)側(cè)皮膚有反應(yīng)；模型組大鼠術(shù)側(cè)肢拖地，針刺術(shù)側(cè)皮膚無反應(yīng)，大部分大鼠足部皮膚出現(xiàn)潰爛；針刺組大鼠術(shù)側(cè)肢拖地，針刺術(shù)側(cè)皮膚有輕微反應(yīng)，少部分大鼠足部皮膚出現(xiàn)潰爛。

2.2 各組大鼠的腓腸肌組織病理損傷 HE 染色結(jié)果顯示，空白對(duì)照組和假手術(shù)組大鼠的腓腸肌肌肉組織排列規(guī)則，未見異常；模型組大鼠的腓腸肌細(xì)胞排列松散，細(xì)胞間隙變寬，肌纖維橫截面積縮??；針刺組大鼠腓腸肌細(xì)胞排列較整齊，肌纖維橫截面積明顯改善。見圖1。

2.3 針刺對(duì)失神經(jīng)骨骼肌萎縮大鼠腓腸肌組織形態(tài)的影響模型組大鼠腓腸肌濕重比、肌纖維截面積比和肌纖維直徑比均明顯低于空白對(duì)照組和假手術(shù)組（P＜0.05）；針刺組大鼠腓腸肌濕重比、肌纖維截面積比和肌纖維直徑比均明顯高于模型組（P＜0.05）。見表1。

表1 針刺對(duì)失神經(jīng)骨骼肌萎縮大鼠腓腸肌組織形態(tài)的影響/±s

注：①與空白對(duì)照組比，P＜0.05。②與假手術(shù)組比，P＜0.05。③與模型組比，P＜0.05。

組別空白對(duì)照組假手術(shù)組模型組針刺組F值P值鼠數(shù)12 12 11 12濕重比1.00±0.03 0.99±0.04 0.38±0.06①②0.52±0.07①②③434.97＜0.001肌纖維截面積比1.00±0.05 0.98±0.14 0.52±0.12①②0.64±0.11①②③56.05＜0.001肌纖維直徑比1.00±0.07 0.97±0.13 0.53±0.16①②0.66±0.15①②③35.92＜0.001

2.4 針刺對(duì)失神經(jīng)骨骼肌萎縮大鼠腓腸肌細(xì)胞凋亡的影響模型組大鼠腓腸肌細(xì)胞凋亡率（30.85±5.74）%明顯高于空白對(duì)照組（5.21±0.51）%和假手術(shù)組（5.37±0.53）%（P＜0.05）；針刺組大鼠細(xì)胞凋亡率（21.39±3.87）% 明顯低于模型組（P＜0.05）。見圖2。

2.5 針刺對(duì)失神經(jīng)骨骼肌萎縮大鼠腓腸肌增殖和凋亡相關(guān)蛋白的影響模型組大鼠腓腸肌組織Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3 和PCNA 的表達(dá)明顯高于空白對(duì)照組和假手術(shù)組（P＜0.05）；針刺組大鼠腓腸肌組織Bcl-2 和PCNA 的表達(dá)明顯高于模型組（P＜0.05），Bax 和cleaved caspase-3 的表達(dá)明顯低于模型組（P＜0.05）。見圖3、表2。

圖3 各組大鼠腓腸肌細(xì)胞增殖和凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)

表2 各組大鼠腓腸肌細(xì)胞增殖和凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)/±s

表2 各組大鼠腓腸肌細(xì)胞增殖和凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)/±s

注：Bcl-2為B細(xì)胞淋巴瘤2，Bax為Bcl相關(guān)X蛋白，cleaved caspase-3為活化胱天蛋白酶，PCNA為增殖細(xì)胞核抗原。①與空白對(duì)照組比，P＜0.05。②與假手術(shù)組比，P＜0.05。③與模型組比，P＜0.05。

組別空白對(duì)照組假手術(shù)組模型組針刺組F值P值鼠數(shù)12 12 11 12 Bcl-2 0.27±0.02 0.29±0.02 0.40±0.03①②0.61±0.05①②③276.68＜0.001 Bax 0.23±0.02 0.24±0.02 0.53±0.05①②0.33±0.04①②③183.23＜0.001 cleaved caspase-3 0.25±0.03 0.26±0.03 0.58±0.06①②0.34±0.04①②③156.21＜0.001 PCNA 0.25±0.03 0.25±0.03 0.44±0.05①②0.72±0.08①②③241.04＜0.001

2.6 針刺對(duì)失神經(jīng)骨骼肌萎縮大鼠腓腸肌AKT、AMPK、Axin1 蛋白表達(dá)的影響模型組大鼠腓腸肌組織p-AKT/AKT、p-AMPK/AMPK、Axin1 的表達(dá)明顯高于空白對(duì)照組和假手術(shù)組（P＜0.05）；針刺組大鼠腓腸肌組織p-AKT/AKT、Axin1 的表達(dá)明顯高于模型組（P＜0.05），p-AMPK/ AMPK 的表達(dá)明顯低于模型組（P＜0.05）。見圖4、表3。

圖4 各組大鼠腓腸肌細(xì)胞AKT、AMPK、Axin1 蛋白表達(dá)的影響

表3 各組大鼠腓腸肌細(xì)胞絲/蘇氨酸蛋白激酶（AKT）、腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）、軸蛋白1（Axin1）蛋白表達(dá)的影響/±s

表3 各組大鼠腓腸肌細(xì)胞絲/蘇氨酸蛋白激酶（AKT）、腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）、軸蛋白1（Axin1）蛋白表達(dá)的影響/±s

注：①與空白對(duì)照組比，P＜0.05。②與假手術(shù)組比，P＜0.05。③與模型組比，P＜0.05。

組別空白對(duì)照組假手術(shù)組模型組針刺組F值P值鼠數(shù)12 12 11 12 p-AKT/AKT 0.35±0.04 0.37±0.04 0.54±0.06①②0.82±0.09①②③152.11＜0.001 p-AMPK/AMPK 0.34±0.03 0.35±0.02 0.73±0.04①②0.51±0.03①②③405.02＜0.001 Axin1 0.26±0.03 0.27±0.03 0.41±0.05①②0.62±0.06①②③172.34＜0.001

3 討論

失神經(jīng)骨骼肌萎縮在中醫(yī)屬“痿癥”范疇，主要表現(xiàn)為筋骨痿軟、皮膚麻木等，主要病機(jī)為氣血虧虛、血脈瘀滯［7］。針灸是我國(guó)中醫(yī)的重要組成部分之一，《黃帝內(nèi)經(jīng)》指出“治痿獨(dú)取陽明”，“足三里”具有理氣和血、舒筋活絡(luò)的功能，和“承山”均為治療下肢瘓癥之要穴，兩穴配合可以改善下肢局部的微循環(huán)，抑制肌肉萎縮［8］。因此，本研究取“足三里”和“承山”，分析電針對(duì)失神經(jīng)骨骼肌萎縮大鼠的作用機(jī)制。本研究中，電針治療可以有效增加失坐骨神經(jīng)大鼠腓腸肌的濕重、肌纖維的直徑和面積。腓腸肌是坐骨神經(jīng)的靶器官，坐骨神經(jīng)損傷后，腓腸肌會(huì)失去神經(jīng)支配，從而出現(xiàn)肌纖維不可逆地萎縮、變形［9］。陳玄等［10］的研究顯示，電針治療可以增加失神經(jīng)骨骼肌萎縮大鼠的濕重，與本研究結(jié)果基本一致，證實(shí)電針治療可以延緩失神經(jīng)大鼠骨骼肌的萎縮。

臨床研究顯示，肌肉萎縮主要是由于細(xì)胞凋亡和增殖之間的平衡被打破后，引起的肌細(xì)胞數(shù)量減少和殘存的肌細(xì)胞體積減小［11］。本研究中，電針治療可以抑制失坐骨神經(jīng)大鼠腓腸肌的凋亡，促進(jìn)組織細(xì)胞中Bcl-2 和PCNA 蛋白表達(dá)，降低Bax 和cleaved caspase-3 蛋白表達(dá)。Bcl-2/Bax 是一組調(diào)控組織細(xì)胞凋亡的蛋白，主要通過調(diào)節(jié)線粒體膜的通透性，釋放細(xì)胞色素C進(jìn)入胞質(zhì)，激活凋亡執(zhí)行蛋白Caspase-3，從而降解細(xì)胞內(nèi)的重要蛋白，誘導(dǎo)組織細(xì)胞凋亡［12］。吳珍元等［13］的研究顯示，細(xì)胞凋亡在大鼠失神經(jīng)骨骼肌萎縮的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用，抑制骨骼肌細(xì)胞的凋亡對(duì)于延緩骨骼肌萎縮具有重要意義，提示電針治療可能通過抑制失坐骨神經(jīng)大鼠骨骼肌細(xì)胞的凋亡，延緩骨骼肌萎縮。PCNA 是一種細(xì)胞增殖核抗原，是真核細(xì)胞DNA 合成所必需的一種核蛋白，可以反映肌衛(wèi)星細(xì)胞的增殖活性［14］。吳夢(mèng)佳等［15］的研究顯示，針刺治療可以調(diào)節(jié)肌衛(wèi)星細(xì)胞的增殖分化和凋亡，防治骨骼肌萎縮，本研究結(jié)果與其類似。結(jié)合本研究結(jié)果表明，電針治療可能通過促進(jìn)肌衛(wèi)星細(xì)胞的增殖，抑制其凋亡，延緩失神經(jīng)大鼠骨骼肌的萎縮。

本研究中，電針治療可以上調(diào)Axin1 和p-AKT的表達(dá)，下調(diào)AMPK 的磷酸化。AMPK 是AMP 依賴的蛋白激酶，也是骨骼肌細(xì)胞的能量感受器，是機(jī)體能量代謝調(diào)節(jié)的關(guān)鍵因子［16］。研究顯示，AMPK被激活后可以降低Akt 的磷酸化水平，降解骨骼肌蛋白質(zhì)，參與能量代謝［17］。AKT 是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，又稱蛋白激酶B，參與了而機(jī)體多條關(guān)鍵信號(hào)通路，在細(xì)胞的存活和凋亡中具有重要作用［18］。Axin蛋白在生物體內(nèi)普遍表達(dá)，包括Axin l和Axin 2兩個(gè)亞型，參與了機(jī)體多種信號(hào)通路，是Wnt/βcatenin、p53 等信號(hào)通路的關(guān)鍵蛋白，可以參與調(diào)節(jié)肌衛(wèi)星細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等過程［19］。Zhang等［20］的研究顯示，Axin 1 可能通過與AMPK 發(fā)生免疫共沉淀，形成復(fù)合物，抑制AMPK 的活化，從而激活肌管細(xì)胞中的AKT。AKT 的磷酸化可以參與機(jī)體多種信號(hào)通路，抑制肌蛋白降解，促進(jìn)蛋白合成，促進(jìn)生肌細(xì)胞分化，抑制肌肉萎縮［21-22］。高睿琦等［22］的研究顯示，電針可以上調(diào)失神經(jīng)大鼠AKT 的磷酸化，改善骨骼肌萎縮，與研究結(jié)果基本相符，提示電針治療可能通過上調(diào)Axin1 的表達(dá)，與AMPK形成復(fù)合物，從而抑制AKT 的磷酸化，促進(jìn)肌細(xì)胞的分化，抑制肌蛋白的降解。

綜上所述，電針治療可能通過上調(diào)Axin1 的表達(dá)，抑制AMPK 的磷酸化，激活A(yù)KT 的磷酸化，促進(jìn)骨骼肌的增殖、分化，抑制其凋亡，延緩失神經(jīng)大鼠骨骼肌的萎縮，為臨床治療提供了一定的理論依據(jù)。但Axin1/AMPK/AKT 參與了機(jī)體多種生物學(xué)過程，電針治療作用于失神經(jīng)骨骼肌萎縮大鼠的關(guān)鍵靶位點(diǎn)尚需進(jìn)一步探索驗(yàn)證。

（本文圖1，2見插圖5-1）