饒?jiān)葡?，陳新?/p>

宮頸鱗癌約占所有宮頸癌70%以上，其在50～55 歲人群中發(fā)病率較高，且有年輕化趨勢(shì)［1］。由于臨床篩查和治療水平提高，近年來宮頸鱗癌早期病人預(yù)后有明顯改善，但中晚期病人治療效果不明顯，5年生存率仍較低［1］。因此探究宮頸鱗癌相關(guān)因子有助于病人病情、臨床療效評(píng)估和病人預(yù)后改善。Qin 等［2］研究表明，泛素偶聯(lián)酶E2（ubiquitin conjugating enzyme E2，UBE2C）在乳腺癌中高表達(dá)，與癌細(xì)胞對(duì)阿霉素敏感性降低和病人不良預(yù)后發(fā)生有關(guān)。有研究證實(shí)，子宮內(nèi)膜癌組織中UBE2C 表達(dá)水平明顯升高，預(yù)示病人晚期組織學(xué)分級(jí)、FIGO分期、復(fù)發(fā)和較短生存期。UBE2C 敲低可抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化［3］。有研究報(bào)道，與正常食管組織比較，食管癌組織中食管癌相關(guān)基因4（esophageal cancerrelated gene 4，ECRG4）水平顯著下降，與癌細(xì)胞凋亡、周期、轉(zhuǎn)移調(diào)控相關(guān)蛋白表達(dá)變化有關(guān)［4］。Tang 等［5］研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌組織中ECRG4 表達(dá)水平降低，過表達(dá)ECRG4 可導(dǎo)致G0/G1 期細(xì)胞周期停滯，抑制乳腺癌細(xì)胞增殖和遷移。本研究通過檢測(cè)宮頸鱗癌組織中UBE2C、ECRG4 mRNA 及蛋白表達(dá)水平，分析二者在宮頸鱗癌發(fā)生發(fā)展中作用及與預(yù)后關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取天門市第一人民醫(yī)院收治的宮頸鱗癌病人73例，選取時(shí)間為2010年6月至2014年6 月，病人年齡（51.26±16.83）歲，范圍為37～71歲；其中有吸煙史19 例，孕次（2.35±0.71）次，產(chǎn)次（1.76±0.58）次。納入標(biāo)準(zhǔn)：①均確診為宮頸鱗癌［6］；②入組前未進(jìn)行任何治療；③臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①妊娠期、哺乳期病人；②合并患有其他婦科惡性腫瘤；③嚴(yán)重心、腎、肝臟功能不足病人。入組宮頸鱗癌病人根據(jù)FIGO 分期標(biāo)準(zhǔn)［6］，可分為：Ⅰ期10 例，Ⅱ期18 例，Ⅲ期45 例。其中Ⅰ～Ⅱ期病人行子宮廣泛性切除+盆腔淋巴切除術(shù)，術(shù)后行輔助放療5例：盆腔外、腹主動(dòng)脈旁淋巴結(jié)照射（每次2 Gy，共40 Gy），陰道殘端腔內(nèi)照射（每次10 Gy，2～4 次）；術(shù)后行輔助化療12 例：紫杉醇（75 mg/m2）+鉑類（順鉑80 mg/m2）藥物進(jìn)行全身化療，3 周1 療程；術(shù)后行放化療結(jié)合治療11例：采用體外+腔內(nèi)放療方案，輔以紫杉醇（75 mg/m2）+鉑類（順鉑80 mg/m2）藥物治療。Ⅲ期病人行均行放化療結(jié)合治療：盆腔外、腹主動(dòng)脈旁淋巴結(jié)照射（每次2 Gy，共80 Gy），陰道殘端腔內(nèi)照射（每次10 Gy，5～7 次）；輔以紫杉醇（135 mg/m2）+鉑類（順鉑80 mg/m2）藥物治療，3 周1 療程，治療2個(gè)療程以上。

另選取同期本院收治的宮頸上皮瘤變病人62例為宮頸上皮瘤變組，病人年齡（50.52±15.89）歲，范圍為35～70 歲；其中有吸煙史13 例，孕次（2.16±0.64）次，產(chǎn)次（1.51±0.52）次。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)陰道鏡、宮頸液基細(xì)胞學(xué)、病理學(xué)診斷，確診為宮頸鱗狀上皮內(nèi)瘤變［7］；②臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①有宮頸手術(shù)、盆腔放療史；②有腫瘤藥物治療史；③妊娠期病人。入組上皮瘤變病人根據(jù)病理組織活檢結(jié)果分為CIN Ⅱ級(jí)36例，CIN Ⅲ級(jí)26例。

選取同期行全子宮切除術(shù)的54 例子宮肌瘤病人為對(duì)照組，收集正常的宮頸組織（均經(jīng)過病理檢查），年齡（51.83±17.34）歲，范圍為36～73歲；病人中有吸煙史9例，孕次（2.12±0.65）次，產(chǎn)次（1.37±0.43）次。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)病理學(xué)診斷和超聲檢查，確診為子宮肌瘤［8］；②臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①近期無藥物治療史；②妊娠期、哺乳期病人；③未合并其他疾病。三組病人一般資料比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。本研究所有受試者均已簽署知情同意書，本研究經(jīng)天門市第一人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意（20100427）。

1.2 主要儀器和試劑實(shí)時(shí)熒光定量（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）儀（型號(hào)7500，美國(guó)ABI 公司）、RNA 提取試劑盒和免疫組織化學(xué)染色試劑盒（貨號(hào)665077、1171939，德國(guó)Roche公司）、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和qRT-PCR 試劑盒（貨號(hào)RR047A、RR820A，日本Takara 公司）、兔抗人ECRG4 多克隆抗體（貨號(hào)ABP56758，美國(guó)Abbkine 公司）、兔抗人UBE2C 多克隆抗體（貨號(hào)PAB6221，臺(tái)灣Abnova 公司）、羊抗兔IgG二抗（貨號(hào)211-035-109，美國(guó)Abcam公司）。

1.3 方法

1.3.1 樣本采集術(shù)中分別收集Ⅰ～Ⅱ期宮頸鱗癌病人宮頸鱗癌組織、宮頸上皮內(nèi)瘤變病人瘤變組織和子宮肌瘤病人正常宮頸組織，Ⅲ期宮頸鱗癌病人病理組織于病理檢查時(shí)留存。將所得組織分為兩份，一份保存于-80 ℃，用于檢測(cè)UBE2C、ECRG4 mRNA 表達(dá)水平；另一份制成4 μm 厚石蠟切片，用于檢測(cè)UBE2C、ECRG4蛋白表達(dá)。

1.3.2 UBE2C、ECRG4 mRNA 表達(dá)水平檢測(cè)采用qRT-PCR 檢測(cè)UBE2C、ECRG4 mRNA 表達(dá)水平，首先取收集組織在液氮中研磨，按照Trizol 法提取總RNA，然后反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。反應(yīng)體系（20μL）如下：cDNA 2 μL，ROX 0.4 μL，Mix 10 μL，上、下游引物各0.8 μL，dH2O 6.0 μL。反應(yīng)步驟：95 ℃、30 s，1循環(huán)；95 ℃、5 s；65 ℃、15 s，40 循環(huán)；72 ℃、30 s。用2-ΔΔCt法計(jì)算UBE2C、ECRG4 mRNA 相對(duì)表達(dá)量。引物如表1所示。

1.3.3 UBE2C、ECRG4 蛋白表達(dá)水平檢測(cè)UBE2C、ECRG4 蛋白表達(dá)水平按照免疫組織化學(xué)染色法進(jìn)行檢測(cè)。隨機(jī)選取6 個(gè)視野（×400）觀察，UBE2C、ECRG4 蛋白陽性細(xì)胞主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)，染色為棕黃色或棕褐色顆粒。染色強(qiáng)度：無、淡黃色、棕黃色、棕褐色分別為0、1、2、3 分；陽性細(xì)胞百分比：＜5%、5%～25%、26%～50%、51%～75%、＞75%分別為0、1、2、3、4分。根據(jù)染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞百分比評(píng)分乘積，將UBE2C、ECRG4 蛋白分為高表達(dá)（＞4分）和低表達(dá)（≤4分）［9］。

1.4 隨訪病人出院后，對(duì)73 例病人隨訪5 年，隨訪方式為打電話或復(fù)查，隨訪間隔為3 個(gè)月1 次，結(jié)束時(shí)間為2019 年6 月。隨訪結(jié)束后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，并分析不同UBE2C、ECRG4 蛋白表達(dá)水平病人生存情況。無失訪病例。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法用SPSS 23.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義再采用SNK-q檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用例（%）表示，用χ2檢驗(yàn)；采用Pearson 法分析宮頸鱗癌組織中UBE2C、ECRG4 mRNA 表達(dá)水平相關(guān)性；采用Kaplan-Meier 法繪制生存曲線，分析不同UBE2C、ECRG4 蛋白表達(dá)水平病人5 年總生存率，行l(wèi)og-rank 檢驗(yàn)；采用Cox 回歸模型進(jìn)行危險(xiǎn)因素分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組UBE2C、ECRG4 mRNA 表達(dá)水平比較與正常宮頸組織相比，宮頸上皮內(nèi)瘤變組織和宮頸鱗癌組織中UBE2C mRNA 表達(dá)水平明顯升高，ECRG4 mRNA 表達(dá)水平降低（P＜0.05）。與宮頸上皮內(nèi)瘤變組織相比，宮頸鱗癌組織中UBE2C mRNA表達(dá)水平明顯升高，ECRG4 mRNA 表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05），見表2。

表2 各組泛素偶聯(lián)酶E2（UBE2C）、食管癌相關(guān)基因4（ECRG4）mRNA表達(dá)水平比較/±s

表2 各組泛素偶聯(lián)酶E2（UBE2C）、食管癌相關(guān)基因4（ECRG4）mRNA表達(dá)水平比較/±s

注：①與正常宮頸組織比較，P＜0.05。②與宮頸上皮內(nèi)瘤變組織比較，P＜0.05。

組別正常宮頸組織宮頸上皮內(nèi)瘤變組織宮頸鱗癌組織F值P值例數(shù)54 62 73 UBE2C mRNA 1.01±0.29 1.97±0.63①3.64±1.21①②157.71 0.000 ECRG4 mRNA 1.02±0.31 0.75±0.26①0.51±0.19①②63.72 0.000

2.2 各組UBE2C、ECRG4 蛋白表達(dá)水平比較UBE2C、ECRG4 蛋白主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)中，見圖1。正常宮頸組織、宮頸上皮內(nèi)瘤變組織、宮頸鱗癌組織中UBE2C、ECRG4 蛋白高表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表3。

表3 各組泛素偶聯(lián)酶E2（UBE2C）、食管癌相關(guān)基因4（ECRG4）蛋白表達(dá)水平比較/例（%）

2.3 宮頸鱗癌組織中UBE2C、ECRG4 蛋白表達(dá)水平與臨床病理特征關(guān)系不同分化程度病人癌組織中UBE2C 蛋白高表達(dá)率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；不同分化程度病人癌組織中ECRG4 蛋白高表達(dá)率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。FIGO分期Ⅲ期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移病人UBE2C 蛋白高表達(dá)率明顯高于FIGO 分期Ⅰ～Ⅱ期、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移病人（P＜0.05），ECRG4 蛋白高表達(dá)率明顯低于FIGO 分期Ⅰ～Ⅱ期、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移病人（P＜0.05）。不同年齡、腫瘤直徑宮頸鱗癌病人癌組織中UBE2C、ECRG4蛋白高表達(dá)率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表4。

表4 泛素偶聯(lián)酶E2（UBE2C）、食管癌相關(guān)基因4（ECRG4）蛋白表達(dá)與臨床病理特征關(guān)系/例（%）

2.4 宮頸鱗癌組織中UBE2C、ECRG4 mRNA表達(dá)水平相關(guān)性宮頸鱗癌組織中UBE2C mRNA 與ECRG4 mRNA 表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)（r=-0.52，P=0.000）。見圖2。

圖2 宮頸鱗癌組織中UBE2C、ECRG4 mRNA表達(dá)水平相關(guān)性

2.5 UBE2C、ECRG4 蛋白表達(dá)水平與宮頸鱗癌病人預(yù)后關(guān)系 UBE2C 高表達(dá)組生存17 例，死亡33例，5 年總生存率為34.00%；UBE2C 低表達(dá)組生存15 例，死亡8 例，5 年總生存率為65.22%，UBE2C 高表達(dá)組與低表達(dá)組5 年總生存率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。ECRG4高表達(dá)組生存14例，死亡5 例，5 年總生存率為73.68%；ECRG4 低表達(dá)組生存18例，死亡36例，5年總生存率為33.33%，ECRG4高表達(dá)組與低表達(dá)組5 年總生存率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.6 宮頸鱗癌病人不良預(yù)后危險(xiǎn)因素分析 FIGO分期Ⅲ期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、UBE2C高表達(dá)、ECRG4低表達(dá)是影響宮頸鱗癌病人發(fā)生不良預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P＜0.05）。見表5。

表5 Cox回歸模型宮頸鱗癌病人不良預(yù)后危險(xiǎn)因素分析

3 討論

UBE2C 又稱泛素結(jié)合酶（UBH10），屬于泛素偶聯(lián)酶E2 家族，位于人類染色體20q13.12 區(qū)，有6 種同源異構(gòu)體，在泛素蛋白酶體有絲分裂調(diào)控系統(tǒng)中發(fā)揮重要生物學(xué)作用［10］。有研究報(bào)道，直腸癌組織中UBE2C 表達(dá)水平明顯上調(diào)，體外干擾其表達(dá)可抑制細(xì)胞增殖、遷移和侵襲［10］。本研究得出，UBE2C mRNA 和蛋白表達(dá)上調(diào)可能與宮頸癌發(fā)生有關(guān)。Hu 等［11］研究證實(shí)，下調(diào)UBE2C 表達(dá)可抑制前列腺癌細(xì)胞增殖、侵襲和提高前列腺癌小鼠存活率。本研究結(jié)果顯示，不同分化程度病人癌組織中UBE2C高表達(dá)率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且FIGO 分期Ⅲ期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移病人UBE2C 蛋白高表達(dá)率明顯高于FIGO 分期Ⅰ～Ⅱ期、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移病人，提示UBE2C 蛋白表達(dá)水平升高可能與宮頸鱗癌進(jìn)展有關(guān)。Jin等［12］研究發(fā)現(xiàn)，UBE2C在非小細(xì)胞肺癌組織中表達(dá)水平高于癌旁組織，可通過靶向結(jié)合上皮細(xì)胞標(biāo)記蛋白E-cadherin 抑制因子ZEB1/2 轉(zhuǎn)錄本的5'-UTR 來促進(jìn)肺癌細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，影響癌細(xì)胞周期和抑制凋亡來促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌進(jìn)展和轉(zhuǎn)移。上述研究提示UBE2C 可能通過上調(diào)細(xì)胞上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化促進(jìn)宮頸鱗癌發(fā)生發(fā)展。

ECRG4 位于人類染色體2q14.1-14.3 上，是一種由148個(gè)氨基酸殘基組成的跨膜蛋白。肺癌細(xì)胞中ECRG4 表達(dá)下調(diào)，體外過表達(dá)ECRG4 可降低肺癌細(xì)胞增殖能力［13］。本研究通過檢測(cè)ECRG4 mRNA和蛋白表達(dá)，發(fā)現(xiàn)ECRG4表達(dá)下調(diào)可能預(yù)示宮頸鱗癌發(fā)生。有研究表明，胃癌組織中ECRG4 表達(dá)下調(diào)，與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，可能作為胃癌治療靶點(diǎn)［14］。本研究結(jié)果顯示，不同分化程度病人癌組織中ECRG4蛋白高表達(dá)率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。FIGO 分期Ⅲ期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移病人ECRG4 蛋白高表達(dá)率明顯低于FIGO 分期Ⅰ～Ⅱ期、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移病人，提示ECRG4 可能參與宮頸鱗癌進(jìn)展，癌組織中ECRG4 蛋白高表達(dá)率升高與可能與腫瘤分化程度降低、FIGO 分期Ⅲ期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移發(fā)生有關(guān)。Ge等［15］研究證實(shí)，ECRG4表達(dá)下調(diào)可影響上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)標(biāo)志物水平，促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖和遷移，提示ECRG4 可能影響上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化過程，參與宮頸鱗癌進(jìn)展。

Li 等［16］研究表明，ECRG4 在食管癌中表達(dá)下調(diào)，ECRG4 過表達(dá)可通過下調(diào)UBE2C，影響癌細(xì)胞NF-κB 核易位，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡及抑制細(xì)胞增殖。本研究利用Peason 法對(duì)宮頸鱗癌組織中UBE2C、ECRG4 mRNA 表達(dá)進(jìn)行了相關(guān)性分析，結(jié)果顯示二者呈負(fù)相關(guān)，提示宮頸鱗癌組織中ECRG4也可能通過靶向調(diào)節(jié)UBE2C表達(dá)，影響宮頸鱗癌發(fā)生發(fā)展。

Zhang 等［17］研究報(bào)道，胃癌組織中UBE2C 過表達(dá)與病人預(yù)后不良有關(guān)，UBE2C 表達(dá)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM 分期是病人預(yù)后獨(dú)立影響因素。Chen 等［18］研究發(fā)現(xiàn)，鼻咽癌組織中ECRG4蛋白表達(dá)水平明顯低于癌旁組織，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期呈負(fù)相關(guān)，是病人生存期較低的獨(dú)立影響因素。本研究結(jié)果顯示，UBE2C蛋白高表達(dá)組和ECRG4蛋白低表達(dá)組病人5 年總生存率較低，提示UBE2C 高表達(dá)、ECRG4低表達(dá)可能導(dǎo)致宮頸鱗癌病人術(shù)后5 年低生存率。本研究還發(fā)現(xiàn)，UBE2C 高表達(dá)、ECRG4 低表達(dá)、FIGO 分期Ⅲ期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是影響病人不良預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，進(jìn)一步提示UBE2C 高表達(dá)、ECRG4低表達(dá)與宮頸鱗癌不良預(yù)后發(fā)生有關(guān)。

綜上所述，宮頸鱗癌組織中UBE2C mRNA 表達(dá)水平及蛋白高表達(dá)率明顯升高，ECRG4 mRNA 表達(dá)水平及蛋白高表達(dá)率降低，與病人臨床病理特征及5 年總生存率低有關(guān)，可能作為評(píng)估病人不良預(yù)后的預(yù)測(cè)指標(biāo)。但由于本研究方法較為簡(jiǎn)單，具體作用機(jī)制還需進(jìn)一步探究。

（本文圖1見插圖5-1）

圖1 UBE2C、ECRG4蛋白表達(dá)（免疫組化染色×400）：A為UBE2C蛋白在正常宮頸組織中低表達(dá)；B為UBE2C蛋白在宮頸鱗癌組織中高表達(dá)；C為ECRG4蛋白在宮頸鱗癌組織中低表達(dá)；D為ECRG4蛋白在正常宮頸組織中高表達(dá)